原生质体培养方法和再生植株的遗传与变异
植物原生质体技术及其应用
植物原生质体技术及其应用中国蓉亏通报2009,25(08):22—26ChineseAgriculturalScienceBulletin植物原生质体技术及其应用于晓玲,李春强,彭明(中图热带农,『科学院热带生物技术研究所,海口571101)摘要:原生质体技术是在原生质体分离基础上,进行一系列技术操作,包括原生质体融合,遗传转化,植株再生等.原生质体技术为细胞杂交,新品种培育,及其与有关的细胞,分子和遗传等学科的交叉渗透,提供一种使用范围广,可行性强的技术体系.阐述了植物原生质体的分离培养,遗传转化等关键技术及其应用,认为原生质体技术在高等植物遗传性状的改良及生产实践中有着广阔的应用前景.关键词:原生质体;制备;遗传转化中图分类号:$336文献标识码:A AdvancesontheResearchofProtoplastTechnologyYuXiaoling,LiChunqiang,PengMing(b~tituteofTropicalBioscienceandBiotechnology,ChineseAcademyofTropicalAgricultu ralSciences,Haikou571101)Abstract:ProtoplasttechnologyisaseriesoftechnicaloperationsbasedOilprotoplastisolati on,includingprotoplastfusion,genetictransformation,andplantregenerationandSOon.Theprotoplastte chnologiesprovideawideuserangeandfeasibletechnologysystem,forcellhybridizationandbreedingofnewsp ecies,andcross—infiltrationamongsubjectsofcellculture,molecularandgenetics.Inthispaper,theseparation ,cultureandapplicationofprotoplasttechniqueweresummarizes.Webelievethattherehasfartherap plicationinthegeneticimprovementofhigherplantsandpractice.Keywords:protoplast,preparation,genetictransfonnation植物原生质体是指去除细胞壁被质膜所包围的,具有生活力的细胞,其结构包括细胞膜,细胞质(包括各种细胞器,细胞骨架系统及胞基质)和细胞核等部分.原生质体技术是指在原生质体的分离培养基础上进行的一系列技术操作,主要包括原生质体植株再生,原生质体融合和细胞杂交,转基因等培育变异新类型的生物技术等.原生质体培养和植株再生技术具有使用范围广,可行性强等优点,是植物生物工程的基础.对植物原生质体的研究,可追溯到20世纪60年代,英国植物学家Cockingt用酶解方法降解细胞壁,获得了番茄根尖原生质体,自此原生质体的研究得到迅速发展.1970年Nagata和Takeble口首次报道烟草叶肉原生质体经分离,培养得到再生植株.Carlson于1972年利用原生质体融合技术从烟草中获得第一个种间杂种,可部分克服有性杂交不亲和性,获得体细胞杂种,从而为创造和选育优良品种找到了一条新途径.近年来,由于原生质体具有结构简单,发育同步性好,群体数量大,DNA分子易于进入细胞,易获得纯合性转化子的特点,及其培养技术与有关的细胞,分子和遗传等学科的交叉渗透,使植物原生质体的研究越来越受到重视.研究领域也从分离原生质体进行的生理生化和利用不同材料的原生质体得到再生植株的阶段转到原生质体的应用(尤其是遗传性状改良)方面.笔者对植物原生质体的关键技术及其应用进行综述.1原生质体的分离和培养1.1原生质体的分离1.1.1分离方法原生质体的分离方法有两种:机械分离法和酶解分离法.机械分离法由于产量低,方法繁琐费力;以及对分生组织和液泡化程度不高的细胞不适用的特点,现在已很少有人使用.基金项目:中国热带农业科学院中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金资助"橡胶转基因技术平台的建立"(ITBBZD0711)a第一作者简介:于晓玲,女,1979年出生,硕士,研究方向:基因工程通信地址:571101海南省海口市城西学院路4号热带生物技术研究所,E—mail******************.收稿日期:2009.O1.07,修回日期:2009.02.18.于晓玲等:植物原生质体技术及其应用?23?酶解分离法为目前普遍采用的原生质体分离方法.酶解是在25～28℃的恒温,黑暗或弱光下进行;酶解后经过O.038nlnl孔径左右的镍丝网过滤,滤去消解不完全的组织碎块(导管,筛管等)和细胞团.然后将滤液离心,弃去上清液,将离心下来的原生质体重新悬浮在洗液(CPW)中,再次离心,去上清液,重复3次.在倒置显微镜下检查纯化效果,效果好,用原生质体培养基离心,效果不好,用质量分数为20%的蔗糖离心,使完整的原生质体浮于液面.1.1.2影响原生质体分离的因素植物材料的选择,预处理过程,酶制剂的使用等均可影响原生质体的分离效果.(1)材料选择适宜材料是成功分离原生质体的关键,主要包括基因型,材料的类型及材料的生理状态等方面.基因型影响原生质体分离的效果,包括原生质体产量, 活力和植株再生方面.材料及其生理状态对原生质体的制备和活力的影响也很大阁.叶片可以得到大量比较均一的原生质体且不使母细胞受到破坏,许多资料报道双子叶植物分离原生质体的最佳材料是叶片p.此外,子叶,胚轴,茎尖及愈伤组织,悬浮培养物和体细胞胚等均可作为分离原生质体的材料.在木本植物中,愈伤组织或细胞悬浮物是应用最广泛的原生质体培养材料u.但是,采用愈伤组织和细胞悬浮物往往需要经若干次的继代培养才能达到适合分离原生质体的状态;而继代时间的长短在很大程度上影响所获得原生质体的活力和产量n".(2)预处理许多研究报道,酶解之前对材料进行预处理有利于原生质体的分离,对保持原生质体的完整性及提高原生质体的产量都有积极的作用.Power等[1报道,酶解以前对材料进行暗处理,有利于原生质产量的提高.Willin等同把苹果叶片放在附加质量分数为5% PVP并添加0.5mmol/L的蛋氨酸的W5盐.糖溶液中处理30min,原生质体的产量明显提高.金晓玲等的研究表明,在分离草莓叶肉原生质体前将试管苗转入低浓度蔗糖的培养基中预培养2～3周,或暗处理1周,原生质体的产量大大提高【8].但是并非所有的原生质体分离都需要经过预处理,如柑桔试管苗幼叶原生质体的游离.在实验中,材料是否需要预处理要根据不同的情况而定.(3)酶制剂酶的类型及使用浓度:目前用于游离原生质体常用的酶有纤维素酶,半纤维素酶,果胶酶和离析酶等,其中纤维素酶和果胶酶对植物原生质体的制备是最必要的.酶液中纤维素酶与果胶酶或离析酶的浓度和比例对原生质体的解离效果具有较大的影响【".酶制剂的选择要根据材料的不同而定.此外,由于不纯的酶制剂所含杂质对原生质体可能有不同程度的毒害作用,因此,也要特别重视酶的质量和来源.酶液浓度过高或过低均不利于原生质体的解离.而酶浓度随其酶活性高低而异,且每批次酶活性不一,因此不同批次的酶宜先进行最佳浓度预实验.酶液添加物:酶液对原生质体的产量和活力有很大影响.原生质体在无稳压剂的介质中会因过分吸胀而裂.过高或过低的渗透压对原生质体均有损伤,不利于以后的培养.常用的渗透压稳定剂有两大类:一类为糖醇或可溶性糖(如甘露醇,山梨醇,蔗糖或葡萄糖等)组成有机溶液;另一类为无机盐溶液,常由CaC1:,MgSO或培养基中的无机盐组成.通常用甘露醇,山梨醇,葡萄糖来调节酶液的渗透压.W巴尔茨(1983)等认为,代谢活跃的渗透压稳定剂(葡萄糖和山梨醇)与代谢不活跃的渗透压稳定剂(甘露醇)一起使用有利于维持酶液的渗透压.由于酶制剂中常含有核酸酶,影响原生质体的活力,可以用降低保温温度或减少酶解时间,提高原生质体的活力.加入适量的PVP或MES能稳定酶解过程的pHt】.酶液的处理时间:酶解处理～般静置在黑暗中进行,也可偶尔轻摇,酶解时间几小时至几十小时不等. 实践表明:如果酶液处理时间太短,所获得的原生质体量少而不能满足实验的需要,但过长时间酶液又会对原生质体具有一定的伤害作用,从而影响原生质体的产量和细胞壁再生的能力.因此,为了获得大量的具有高活力的原生质体,酶解时间一般以12～14h为宜.酶解温度一般在27℃左右.1.2原生质体的培养1.2.1培养基原生质体的培养基多采用以MS培养基为基础的改良培养基,一般酸度为pH5.6—5.8.无机盐是构成培养基的主要成分,较高的Ca2浓度能提高原生质体的稳定性.高浓度的NH4+对原生质体的生长发育不利".实验证明糖是原生质体培养中较理想的渗透压稳定剂和碳源【l.抗氧化剂(甘氨酸,PVP(聚乙烯吡咯烷酮),维生素C等)的添加可较好地防止木本植物原生质体再生细胞团的褐化现象[2o1.细胞壁脱离后,随着培养天数的增加,RNase酶活性异常升高,加入BSA可降低该酶的活性,保证原生质体的活力".不同植物原生质体培养对激素的种类和浓度的要24?中国农学通报求存在很大的差异,通常在培养前期需要较高水平的生长素和细胞分裂素,才能启动细胞壁的再生和细胞分裂.1.2.2培养方法原生质体的培养方法主要有液体培养,固体培养和固液结合培养等.液体培养法操作简单,对原生质体损伤较小,且易于添加新鲜培养物,但此法常会使原生质体分布不均匀,发育的原生质体之间产生粘连而影响其进一步的生长和发育,尤其是难以定点观察单个原生质体的命运.最简单的固液结合培养法是在培养皿的底部先铺上一薄层含或不含原生质体的固体培养基,再在其上进行原生质体的液体浅层培养,此法有利于固体培养基中的营养成分(或细胞有用代谢物)缓慢地向液体培养基中释放,以补充培养物对营养的消耗,同时培养物所产生的有害物质也可被固体培养基吸收.固体培养法是将原生质体与含琼脂或低熔点琼脂糖的培养基相混合,其中尤其是低熔点琼脂糖固体包埋法可有效地防止液体培养中原生质体出现聚集现象,减轻原生质体局部区域的褐化,并可减轻因凝集而产生的植板率和分裂率统计的困难.它是既便于定点观察,又有利于追踪原生质体再生细胞的发育过程,因此是一种最为有效的培养方法.培养方法作为原生质体再生植株的关键一环,目前已愈来愈引起人们广泛的重视,其总体思路主要围绕着避免原生质体在培养过程中受到机械或化学伤害,使原生质体处于最佳的营养吸收状态,多种培养方法相结合等几个方面展开.Schween等口报道,近年来一种装有玻璃纸层的培养皿被广泛用于原生质体的培养中.1.2_3培养密度原生质体培养的常规技术是群体培养,培养密度对细胞的生长十分重要.密度条件一般在5×10～5×10个/ml时,植物原生质体才能正常的分裂与发育口.密度过高时,由于营养不足或细胞代谢物过多而抑制再生细胞的正常生长:密度过低时,又会使与分裂有关的物质达不到一定的浓度而使再生细胞不能持续分裂.1.3原生质体的低温保存原生质体从制备到转化操作繁琐,每次进行原生质体操作前都必须进行酶解,分离等步骤.为节约时间,避免药品的浪费,需要使原生质体在一段时间内保持其原生质体状态,不形成或减慢形成细胞壁,并保持原生质体的活力.原生质体的超低温保存为此提供了可能.早在20世纪70年代末,Withers和Street首次运用5%DMSO做保护剂,经液氮保存后,胡萝卜的原生质体的存活率达90%.此后,多种原生质体超低温保存获得成功].2原生质体的转化2.1生物介质介导的遗传转化目前应用的生物介质主要是根癌农杆菌和发根农杆菌.它们转化的原理分别是通过活化Ti和质粒的Vir区基因,达到对T-DNA转移的目的.外植体与农杆菌的共培养是获得转化植株的重要途径.根癌农杆菌转化频率比发根农杆菌转化频率高,并能直接从农杆菌转移基因到植物细胞核基因组,是目前较理想的转化系统.徐子勤等1以根癌农杆菌为介质转化苜蓿原生质体取得成功.由于不同品种或同一品种的不同器官或组织的再生能力不同,因此利用农杆菌进行遗传转化之前,首先要对不同的外植体建立相应的高效再生体系.2.2细胞融合法PEG介导法由Davey等.首先建立,主要原理是借助细胞融合剂诱导原生质体摄取外源DNA.PEG法的融合率可达10%～15%,无种属特异性,几乎可诱导任何原生质体的融合[28】.Rasmusse等通过PEG介导法将Gus基因导入油菜的原生质体.Panhar等p.研究PEG介导法指出,用CaC1处理原生质体及低剂量的紫外线处理可以提高DNA的摄取和外源基因的表达.20世纪80年代初开始探索使用电融合法,是目前最流行的物理诱导融合方法p".细胞电融合利用细胞在相对电极之间的介电电泳,诱导细胞按特定方向排列,通过电极间产生的较高场强的电脉冲使相互接触的细胞发生电穿孔,进而发生电融合.近年来,已经测出数十种植物原生质体的电融合参数,并获得部分细胞杂种.2.3激光微束穿刺法激光微束穿刺法就是利用直径很小,能量很高的激光微束引起细胞膜可逆性穿孔,从而使处于细胞周围的外源DNA随之进入细胞的转基因方法.早在1987年,Weber等p就利用微束激光照射油菜细胞,将荧光素标记的外源DNA导入叶绿体,观察到荧光显示, 并且发现这一处理对细胞的分裂能力和叶绿体的光合能力影响较小.由于激光微束穿刺技术操作简便,转化频率高,从而引起了许多科学家的重视,由此带动了此项技术在原生质体遗传转化中的应用与发展.激光微束穿刺法操作简便,对细胞的损伤小,可以准确定位于被照射的细胞,实验重复性好,已成为一种行之有效的转基因手段.但与农杆菌介导法相比,激于晓玲等:植物原生质体技术及其应用?25?光微束穿刺法转化效率较低,且激光微束仪设备复杂, 造价昂贵,因此限制了此技术的推广普及.2.4电击法电击法是利用高压电脉冲作用,在原生质体膜上"电击穿孔",形成可逆的瞬间通道,从而促进外源DNA的摄入,此法在动物细胞中应用较早,并取得了很好的效果.现在这一方法已被广泛应用于各种植物,例如Guerche等用纤维素酶处理油菜2周龄的嫩叶后获得原生质体,于电击仪中电击转化处理,筛选得到了21个抗性克隆,并最终获得了2株转化植株,其形态和育性完全正常;黄家总等p成功的利用电击细胞融合的方法使紫罗兰和桂竹香原生质体融合.该方法对细胞没有毒害作用,并且操作简便,融和同步性好,可在显微镜下观察融合的全过程,整个过程中的参数容易控制.至今已广泛应用于动植物及微生物细胞的融合.2.5其他方法目前植物基因工程中除了运用上述方法外,还有一些其他方法,如脂质体法,显微注射法等.脂质体法就是将包含外源基因的带负电荷的脂质体与植物原生质体融合,从而达到转基因的目的;显微注射法是利用显微注射仪将外源DNA直接注入受体细胞质或细胞核中.这些方法各有其优缺点及适用范围,在油菜育种中运用较少,而在其他作物上有成功的报道.3原生质体技术的应用由于原生质体失去了细胞壁这一屏障,因而使其具有特殊的优点.原生质体不仅可作为一个单细胞系统来研究细胞壁再生,细胞分裂与分化,摄入细胞器, 病毒侵染机理,膜透性及离子转运等基础理论研究的理想材料;同时还是原生质体培养和原生质体融合的基础[36].而且,近年来以原生质体为材料利用膜片钳技术研究离子通道及原生质体在受光,胁迫和激素作用后的调节机制已成为研究的热点.此外,原生质体也被用来作为研究植物细胞钙信号转导及其调节机制的理想材料_3s】.原生质体融合技术可以高效地将供体的目标性状基因转移给受体,解决种间杂交不亲和的缺点,为品种遗传改良,遗传工程和作物改良提供了多种可能.植物原生质体融合技术已在多种植物中获得成功的应用弘Ⅻ.利用原生质体导入外源基因不存在不亲和问题,且没有细胞壁的障碍,便于进行遗传转化操作.人们对利用原生质体导入外源基因及原生质体瞬间表达系统在基因研究中的应用进行了大胆的尝试和实践.杨仲南等【39通过PEG介导研究了外源GUS基因在花椰菜原生质体中的瞬间表达.薛红卫等4o]将GUS基因导人甘蓝下胚轴原生质体并获得转基因植株.Eimert等[4l用花椰菜叶肉原生质体,通过电激法转化得到了抗性芽.Mukhopadhyal等用甘蓝下胚轴原生质体在PEG的介导下,直接摄取了质粒DNA,转化频率为10%～33%,而且获得了转化再生植株㈣.目前,已经建立对芹菜,玉米,胡萝卜,拟南芥和烟草等植物对不同的外界刺激下信号转导机制的研究[431,以及应用原生质体单核化技术解决杂交育种难题等.这对植物遗传转化,性状改良等方面都具有深刻的指导意义【一.4展望几十年来,原生质体技术在细胞生物学,生物工程学,生理学,遗传学,病理学,病毒学和育种学等研究领域中都得到了应用.植物原生质体技术得到了迅速的发展,并取得了可喜的成绩,主要表现在通过原生质体获得再生植株的植物种类不断增加,包括林木,观赏植物,药用植物,果树和作物等.虽然对植物原生质体的研究取得了很大的进展,但是利用原生质体技术改良高等植物的遗传性状并将之运用于生产实践中还有一些距离.今后应重点在以下几个方面开展工作:(1)进一步扩大原生质体培养材料的种类及基因型;(2)加强对原生质体再生植株无性系变异的细胞遗传学研究;(3)继续加强原生质体融合方式方法与应用的研究;(4)加强利用原生质体融合技术进行遗传性状改良的研究.参考文献[1]CockingEC.Amethodfortheisolationofplantprotoplastsand 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烟草K326叶肉原生质体培养再生植株及影响因素的研究
将烟草 Ｋ ２ ３ ６种 子 放 人 ７ ％ 的 乙 醇 中 浸 泡 ０ ３ ， ０ １ 升汞溶 液 中消 毒 ７ｒ ｎ 无菌 水 冲洗 ４ ０ Ｓ在 ． ％ ｉ， ａ
植 物原生 质体 是 除去细 胞壁 而仅 为原 生质膜 所
包 围的裸露 细胞 ． 因而 它具 有一 般 植 物 细 胞所 不 具
１ 材料与方法
１ １ 材料 ．
备的优点 ， 不仅成 为植物生理学、 细胞 生物学 、 体细
胞遗传 学 等理论 研 究 的理 想 材 料 ， 且 植 物 原生 质 而 体技术 也成 为生 物 工程 及 作 物 改 良的有 效 手 段 ． 自 １７ 年 Ｔｋｂ 等 首次 利 用 烟 草 叶 片原 生 质 体 获得 ９１ ａｅｅ 了再 生植 株 ， 此开 始 了原 生 质 体培 养 研 究 的新 纪 从
摘 要 以烟草 Ｋ ２ ３ ６无菌 苗为材料 ， 成功地将烟草叶肉原生 质体 培养 出再 生植株． 同时 就烟草 叶肉原生 质体 的酶解 并 Ｋ ２ ；原生质体 培养 ； ３６ 分化 ； 生植 株 再
条件 、 培养方法及培养基 中的激素组成等 因素对植株再生 的影响进行 了研究和探索． 关键词
Ａｂ ｔａ ｔ ｓ ｒ ｃ ：Ｗ ｈ ｌ ｌ ｎ ｓｆｏ ｔ ｂ ｃ ｏ ｍｅ ｏ ｈ ｌ ｐ ｏｏ ｌ ｓｓｗ ｒ ｂ ａｎ ｄ ｂ ｓｎ ３ ６ ｌａ ｔｒ １ Ｓ ｍｅ ｏ ｅ ｐ ａ ｔ ｒ ｍ ｏ ａ ｃ ｓ ｐ ｙｌ ｒ ｔ ｐ ａ ｔ ｅ ｅ ｏ ｔ ｉｅ ｙ ｕ ｉ ｇ Ｋ ２ ｅ ｆ ｍａ ｅ ｉ ． ｏ ａ
植物原生质体培养
3 提取方法
①机械分离法（Machanical isolation） ②酶法分离（Enzymatic isolation）
①机械法
早在1892年，克莱若克（Klercker）就已采用机 械法分离原生质体。 方法：细胞放入高渗糖溶液中，质壁分离，剪碎组织， 在这个过程中，有些质壁分离的细胞只被切去了细胞 壁，从而释放出完整的原生质体。 缺点：产量低；方法繁琐费力；局限性大。分生组织 和其他液泡化程度不高的细胞中分离原生质体时不能 用此法。
f cell colonies derived from protoplast,
g proto-calli developed from protoplasts embedded in agarose,
h green shoot formation,
i fertile green plant
Protoplast culture and fertile green plant regeneration of rye.
优点：可获得大量的原生质体，几乎适用 于所有植物的器官、组织和细胞。
缺点：酶制剂由于含有核酸酶、蛋白酶、 酚类等物质，影响原生质体的活力。
注意事项： ⑴酶溶剂及其渗透压 酶溶剂：原生质体培养基或特殊配制。 渗透压调节剂：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等 浓度范围450～800mmol/L
⑵酶处理： 酶浓度 酶解时间
界面法
①离心沉淀法
• 原理：原生质体的比重比较大，离心后原生质 体沉于底部。
• 步骤： 第一步原生质体溶液用400目网筛过滤。 第二步离心（500～1000rpm,离心5～6min）。 第三步吸去上清液，沉淀物重新悬浮，再离心 沉淀。如此2～3次。 第四步用原生质体培养液洗1次，收集原生质体。
原生质体培养名词解释
原生质体培养名词解释原生质体培养是一种常用的植物组织培养技术，用于繁殖植物和研究植物基因转化等问题。
本文将介绍原生质体培养的定义、原理和应用等方面的名词解释。
下面是本店铺为大家精心编写的4篇《原生质体培养名词解释》，供大家借鉴与参考，希望对大家有所帮助。
《原生质体培养名词解释》篇11. 原生质体（Protoplast）原生质体是指从植物细胞中除去细胞壁后剩余的细胞质部分，包括细胞膜、质体、线粒体、质体小体、微管和微丝等细胞器。
原生质体是一个高度液态的细胞质体系，其形态和功能类似于一个微小的细胞。
原生质体可以通过融合实现远缘杂交，从而扩大植物遗传资源的利用范围。
2. 原生质体培养（Protoplast Culture）原生质体培养是指将离体的植物原生质体在适当的培养基上进行培养，以获得再生的植物组织或细胞。
原生质体培养的主要目的是通过原生质体的融合，克服远缘杂交障碍，实现植物遗传资源的利用和改良。
3. 原生质体融合（Protoplast Fusion）原生质体融合是指两个或多个原生质体合并成一个细胞的过程。
原生质体融合可以通过电激、化学处理或生物方法等手段诱导。
融合后的细胞称为杂种细胞，可以用于植物遗传资源的利用和改良。
4. 再生（Regeneration）再生是指通过培养技术，使离体的植物组织或细胞重新分化、再生为新的植株或组织。
再生是原生质体培养的重要应用之一，也是植物组织培养技术的基础。
5. 遗传转化（Genetic Transformation）遗传转化是指将外源基因或基因组导入植物细胞内，并使其表达的过程。
遗传转化是植物基因工程的重要组成部分，也是原生质体培养的应用之一。
通过原生质体培养技术，可以将目的基因导入植物细胞内，并实现植物的遗传转化。
6. 植物组织培养（Plant Tissue Culture）植物组织培养是指将离体的植物组织或细胞在适当的培养基上进行培养，以获得再生的植物组织或细胞。
植物原生质体培养
原生质体的培养1. 原生质体的分离与纯化原生质体培养的意义(1)再生植株由原生质体再生生成植株，不论在进行有关细胞生物学或生物合成和代谢的实验研究上，还是在组织培养实践中，都有一定的优点：①可利用均一的分化细胞群体；②因无细胞壁，试剂对细胞作用更为直接，其反应能直接测量，以使反应产物能较快的分离出来；③在理论和实践中，可极大节省空间，如在一个三角瓶就能培养210个细胞，但在大田种植需要4亩地；④可缩短实验周期，如悬浮培养时仅需1～2个小时。
原生质体培养可在遗传学方面进行基因互补，不亲和性，连锁群和基因鉴定，分析基因的激活和失活水平的研究。
在研究分化问题时，用一个均一的原生质体群体可以筛选数以千计的不同。
营养和激素条件，探索诱导单细胞的分化条件等。
(2)用于远缘体细胞融合，进行体细胞杂交。
这是一种新的远缘杂交方法，为人们提供新的育种方法。
两个亲缘关系较远的植株用一般杂交方法是不容易成功的，而用细胞融合的方法却成为可能。
首先，两个原生质体融合形成异核体，异核体再再生细胞壁，进行有丝分裂，发生核融合，产生杂种细胞，由此可培养新的杂种。
一、原生质体(protoplast)的分离（一）材料来源原生质体是通过质壁分离与细胞壁分开的部分，是能存活的植物细胞的最小单位。
自从1960年用酶法制备大量植物原生质体首次获得成功以来，原生质体培养成为生物技术最重要的进展之一。
通过大量的试验表明，没有细胞壁的原生质体仍然具有"全能性"，可以经过离体培养得到再生植株。
原生质体的分离研究较早，1892年Klereker首先用机械的方法分离得到了原生质体，但数量少且易受损伤。
1960年，英国植物生理学家Cocking首先用酶解法从番茄幼苗的根分离原生质体获得成功。
他使用一种由疣孢漆斑菌培养物制备的高浓度的纤维素酶溶液降解细胞壁。
然而，直至1960年纤维素酶和离析酶成为商品酶投入市场以后，植物原生质体研究才成为一个热门的领域。
甘蓝型油菜子叶原生质体培养及植株再生研究
养基 为 Ｅ培养 基 ＋１ ０ ／ Ｂ ． Ｌ ６一 Ａ＋０ １ ／ ｇ ． Ｉ ＮＡＡ＋０ ０ ／ Ａ３ ０ ｍｏ／ ＮＯ３ 所有再 生 ｇ ． ２ Ｌ Ｇ ＋３ ｌＬ Ａｇ ｇ ｇ ；
芽均在 无激 素 的 ＭＳ培 养基上 生根 。研 究结 果为 建立成 熟 的甘蓝 型 油菜原 生质体 再 生体 系提 供 了
摘要 ：以甘 蓝型 油菜 中双 ６号子 叶为材 料制备 原 生质体 ， 用 固液结合 培 养 ， 讨 了其原 生质 体分 采 探
离、 培养与 再生的优化条件 ， 获得 了再生植株 。结果表 明： 混合酶 液（ ． 纤维素酶 ＋０ １ 果胶 酶 ＋ ０５ ． ０ ２ ｌＬ甘露 醇＋８ ｍｍｏ／ ａ １） Ｓ Ｍ 溶液按 ３： ． ｍｏ ／ Ｏ ｌＬ Ｃ Ｃ ２ 与 Ｃ ７的 比例 混合 ， 解 １ 酶 ４ ｈ可获得 高产 率 中 双 ６号子 叶原 生质体 ； 生质体 在 前人 设计 的 Ｂ、 固液相 结 合培 养基 上 培 养效 果好 ； 原 Ｃ 最佳 分化 培
ｇｅ ｅ ａ ｉｎ ｏ ｒ ｔ ｐ ａ ｔｗ ｅ ｅｔ ｓｅ ｎ ｌｉ ｔｌ ｈ ｅ ｅ ｅ ａ ｉｎ ｐ ａ ｌｔ ｒ ｔｉ ｅ ｎ ｒ ｔｏ ｆｐ ｏ ｏ ｌｓ ｒ ｅ ｔｄ ａ ｄ ｕ ｔｍａ ｅｙ ｔ ｅ ｒ ｇ ｎ ｒ ｔ ｌｎｔｅｓ ｗｅ ｅｏｂ ａｎ ｄ． Ｔｈ ｅ ｕ ｔ ｏ ｅ ｒ ｓ ｌｓ
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基因组对芸苔属作物原生质体培养及植株再生的影响
基因组对芸苔属作物原生质体培养及植株再生的影响
李世君;孟征;李德葆
【期刊名称】《遗传学报：英文版》
【年(卷),期】1994(21)3
【摘要】本文以包心菜、芜菁油菜、浙油６０１的无菌苗叶肉原生质体为材料，经不同液体培养基浅层培养，细胞分裂并形成愈伤组织。
愈伤组织经增殖后，转到分化培养基上诱导分化，均获得了再生植株。
本文着重研究了植物基因组对原生质体分裂频率及植株再生的影响。
研究结果表明：（１）植物基因组对原生质体分裂频率的影响随原生质体培养基的不同而异；（２）植物基因组对原生质体再生植株影响显著，芜菁油菜的Ａ基因组不利于原生质体再生植株，包心菜的Ｃ基因组有利于原生质体再生植株。
【总页数】5页(P222-226)
【关键词】基因组;芸苔属;原生质体培养
【作者】李世君;孟征;李德葆
【作者单位】浙江农业大学生物技术研究所
【正文语种】中文
【中图分类】S565.403.2
【相关文献】
1.原生质体培养在芸薹属蔬菜作物中的研究进展 [J], 张艳;李成琼;宋洪元;秦家顺
2.十字花科芸薹属作物小孢子胚植株再生体系的研究进展 [J], 谢景;李智军;卢文佳;
曾晶
3.芸苔属花粉—下胚轴原生质体融合再生杂种小植株 [J], 李昌功;周嫦
4.芸苔属植物幼嫩花粉原生质体分离、培养及花粉－体细胞原生质体的融合 [J], 李昌功;周嫦;杨弘远
5.不同供体原生质体前处理方法对甘蓝与萝卜属间原生质体融合植株再生的影响[J], 雷开荣;U.Ryschka;E.Klocke
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马铃薯原生质体再生植株染色体及有丝分裂变异的研究
马铃薯原生质体再生植株染色体及有丝分裂变异的研究
张延红;何春雨;于品华;柳俊
【期刊名称】《甘肃农业科技》
【年(卷),期】2008(000)003
【摘要】对马铃薯叶肉原生质体再生的54个株系及其亲本进行了根尖染色体数目检测,在待测的54个再生株系中,有7个株系是双单倍体(2n=24),40个株系是四倍体(2n=48);少数为非整倍体和六倍体,变异丰富.同时也观察到有丝分裂过程中出现了多核、类无丝分裂、染色体呈环状分布和"∞"状分布等现象.
【总页数】3页(P28-30)
【作者】张延红;何春雨;于品华;柳俊
【作者单位】甘肃省中医学院药学院,甘肃,兰州,730000;甘肃农业大学农学院,甘肃,兰州,730070;甘肃省冬小麦研究所,甘肃,兰州,730020;甘肃农业大学农学院,甘肃,兰州,730070;湖北省马铃薯工程技术研究中心,湖北,武汉,430070
【正文语种】中文
【中图分类】S532
【相关文献】
1.马铃薯原生质体再生植株遗传变异研究进展 [J], 张延红;何春雨;柳俊
2.美味猕猴桃原生质体再生植株细胞遗传学研究Ⅰ.体细胞染色体数目的变化 [J], 何子灿;蔡起贵;柯善强
3.毛花猕猴桃原生质体再生植株根尖染色体数目变异与细胞多核现象 [J], 张远记;魏小萍
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5.美味猕猴桃原生质体再生植株细胞遗传学研究Ⅲ .母株减数分裂前期Ⅰ染色体配对的光镜观察 [J], 何子灿;蔡起贵;钱迎倩;黄宏文;侯云甫;何子灿
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压，否则细胞团不会继续生长。待 小愈伤组织长至1 -2mm时，应及时
转移至固体培养基使其进一步生长
4.植株再生
原生质体培养再生的愈伤组织可直接转移到分化培养基，一步成苗 （器官发生）。愈伤组织也可通过体细胞胚发生，先形成胚状体，再 诱导生芽、生根。不同植物种属，其再生方式不同
供体细胞的分化程度：同一个基因型的植株生长在不同的环境条件下，其 生理状态会有改变。供试植株最好生长在控制条件下，以提高原生质体的细 胞分裂频率和再生能力，并且可提高实验重复性
柑橘：叶肉原生质体无论单独培养还是共培养均不能再生，只有胚性愈伤 组织来源的原生质体才能再生
起始培养密度与培养基
–起始培养密度：适宜密度为1-5×105/ml –培养基激素水平：柑橘不添加外源激素，也可再生 –培养基营养成分完全性：越丰富越好
仙客来原生质体的再生
香蕉原生质体再生—Assani等2006 看护培养
Sugarbeet （糖 甜菜）callus and protoplast regeneration
影响原生质体培养的主要因素
基因型
– 番茄与秘鲁番茄有性杂交后性状分离的遗传分析表明，其愈伤组 织再生能力受2个显性基因决定(Koornneef等1987)。Cheng和 Veilleux(1991)对芙薯(S. phureja)原生质体培养能力进行遗传 分析，证明从原生质体培养到形成愈伤组织受2个独立位点的显性 基因控制(Cheng等1991)
• 变异程度的大小与起始材料及培养过程中产生的 变异有关
• 原生质体再生植株变异可为体细胞遗传学研究和 品种改良提供有益的材料
• 从原生质体培养再生植株已选育一些新品种（体细
胞突变育种）
原生质体一般培养2～7 d开始第1次分裂，但第1次分裂 的时间随植物种类、分离原生质体的材料、原生质体质量、 培养基成分和培养条件而异
用幼苗下胚轴和子叶、幼根、悬浮培养的细胞、未成熟种 子的子叶等分离原生质体，一般比用叶肉分离原生质体容 易诱导分裂，第一次分裂出现的时间较快
3. 愈伤组织形成
1）多数情况下，原生质体培养2周 后，可形成多细胞团，3周后形成肉 眼可见的小细胞团，5-6周后形成直 径1 mm的小愈伤组织 2）原生质体培养15-20天后，需要及
液体－固体双层培养:Liquid solid culture
即在培养皿底部铺一层琼脂糖固体培养基，再将原生 质体悬浮液滴于固体培养基表面
优点：固体培养基中的营养物质可以缓慢释放到液体 培养基，如果在下层固体培养基中添加一定量的活性 炭，则还可以吸附培养物产生的一些有害物质，促进 原生质体的分裂和细胞团的形成
Protoplast density counting
25格 × 16格（0.1 mm3）的血球计数板计算公式：原生
质体细胞数 / ml = 80小格（左上、右上、左下、右下、中5个中格）内 原生质体细胞个数/80 × 400 × 104 × 稀释倍数
1 ml = 1 cm3 = 1000 mm3
原生质体发育与植株再生
细胞壁再生 细胞分裂与生长 愈伤组织形成
植株再生
1. 细胞壁再生
–原生质体培养数小时后开始再生新的细胞壁，一至数天内便可形成完整细 胞壁
–新合成的细胞壁可用0.1％荧光增白剂（Calcofluor）染色后在荧光显微 镜下观察，可见到绿色荧光围绕细胞表面，证明细胞壁已形成。也可用高 渗溶液产生质壁分离的方法、电子显微镜观察技术和冰冻蚀刻法等进行再 生细胞壁的研究
将含有原生质体的液态琼脂糖培养基用吸管以大约 50 l一滴的量滴于直径6 cm的培养皿，待其固化后向 其中添加3ml液体培养基并于摇床上低速旋转培养 (Thompson等，1986)。培养过程中，通过调整液体培 养基的渗透压来调节培养物的渗透压以利于其进一步 的生长和发育。这种方法由于改善了培养物的通气和 营养环境，从而促进了原生质体的分裂和细胞团的形 成
三、原生质体再生植株遗传及变异
染色体变异 植株性状变异
染色体变异
• 染色体倍性变异是原生质体再生植株的常见变异类型 • 原生质体再生植株的倍性与分离原生质体的起始材料有关
– 由茎尖、叶肉和胚性组织细胞分离的原生质体能较好保持原来的 倍性
– 用悬浮培养细胞，特别是长期继代培养的细胞系分离的原生质体 ，较易出现染色体倍性及数目的变化
– Dudits等（1991）以苜蓿不同基因型深入研究，表明某个基因 型在离体培养时难以形成体细胞胚。若将对激素调节有作用的发
根农杆菌rolB和rolC基因引入并表达，可能促使其体细胞胚形成
原生质体来源
供体材料类型：向日葵幼叶、子叶和下胚轴原生质体培养，只有下胚轴 原生质体培养得到了细胞团和体细胞胚，而幼叶和子叶原生质体均未获得成 功
原生质体培养方法
液体浅层培养
固体平板培养
固-液体双层培养
琼脂糖珠培养
液体浅层培养:Liquid thin layer culture
将含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一薄层，封 口后进行培养
优点：操作简单，对原生质体的损伤小，且易于添加 新鲜培养基和转移培养物
缺点：原生质体分布不均匀，常发生原生质体粘连现 象而影响其进一步生长和发育；难以跟踪观察某一个 细胞的发育情况；一旦污染，全皿报废
缺点：不易观察细胞的发育过程
Semi-permeable membrane on solid medium
Semi-permeable membrane enhances embryo regeneration in citrus protoplast culture
琼脂糖珠培养:Agarose bead culture
固体平板培养:Solid culture
固体培养也就是琼脂糖包埋培养。低融点琼脂糖可在 30 C左右融化与原生质体混合而不影响原生质体的生 命活动。混合后的含有原生质体的培养基铺于培养皿 底部，封口后进行培养
优点：可以跟踪观察单个原生质体的发育情况，易于 统计原生质体分裂频率
缺点：操作要求严格，尤其是混合时的温度掌握必须 合适，温度偏高则影响原生质体的活力，温度偏低则 琼脂糖凝固太快原生质体不易混合均匀
– Grosser等（1984）报道，由三叶草叶肉原生质体再生的植株为 二倍体（2n=16），而由培养细胞分离的原生质体再生的植株为 四倍体（2n=32）
原生质体再生植株变异还与植物种类有关：马铃薯易变
，柑橘不易变
植株表型变异与育种
• 原生质体再生植株表型变异：包括植物学性状、抗性
变异、育性/果实无核、成熟期等
–原生质体培养数小时后新壁开始形成，先是质膜合成形成细胞壁主要成分 的微纤维，然后转移到质膜表面进行聚合作用产生多片层的结构，之后在 质膜与片层结构之间或在膜上产生小纤维丝，逐渐形成不定向的纤维团， 最后形成完整的细胞壁
–只有能形成完好细胞壁的再生细胞才能进入细胞分裂阶段
2. 细胞分裂和生长
原生质体培养数天后，胞质增加，细胞器增殖，RNA、 蛋白质及多聚糖合成增加，不久即可发生核的有丝分裂及 胞质分裂