分子标记技术的种类
第五章分子标记技术原理与应用
AFLP标记的基本原理是基于PCR技术扩增基因 组DNA限制性片段，基因组 DNA先用限制性内切酶切割，然后将双链接头 连接到DNA片段的末端，接 头序列和相邻的限制性位点序列，作为引物结 合位点。限制性片段用两种 酶切割产生，一种是罕见切割酶，一种是常用 切割酶。
分子标记的应用
获得与目标性状连锁的分子标记
分子标记辅助育种的经典例子
美国科学家将分子选择应用在玉米杂种优势遗传改良上，经过改良的B73 改良的Mo17的组合比原始的B73 Mo17组合和一个高产推广组合 Pioneer hybrid 3165皆增产10%以上（Stuber and Sisco 1991; Stuber et al. 1995）。 通过分子标记技术将3个抗稻瘟病基因（Pi-2、Pi-1和Pi-4）在水稻第6、 11和12号染色体上进行定位，然后利用连锁标记将这3个抗性基因聚合起 来。基因聚合试验从3个分别带有Pi-2、Pi-1和Pi-4基因的近等基因系 C101LAC、C101A51和C101PKT出发，已成功地获得聚合了这3个抗稻瘟病 基因的植株，它们可以作为供体亲本在育种中加以利用，可同时提供数 个抗性基因。 （Zheng et al. 1995）
一、限制性片段长度多态性技 术(RFLP)
限制性片段长度多态性技术(RFLP)是用已知的 限制性内切酶消化目标 DNA，电泳印迹，再用DNA探针杂交并放射自 显影，从而得到与探针同源 的DNA序列酶切后在长度上的差异。 RFLP标记在正常的分离群体中都呈典型的孟德 尔式遗传。PFLP的结果稳 定，在作物基因图谱构建和QTL基因定位分析 上使用较多。
三、简单重复序列SSR
常用DNA分子标记类型和特点
常用DNA分子标记类型和特点DNA分子标记是一种广泛应用于生物学研究和诊断领域的技术，用于识别、检测和定量目标DNA序列。
常见的DNA分子标记类型包括荧光染料、酶和放射性同位素等。
每种标记类型都具有其独特的特点和应用场景。
荧光染料是DNA分子标记中最常用的类型之一、它们通过在DNA分子上附着荧光染料，使其在荧光显微镜下可见。
荧光染料具有多种颜色和化学性质，可用于多重标记和多个目标的同时检测。
其主要特点包括：1.高灵敏度：每个荧光染料分子都有较强的荧光信号，因此可以在微量样品中进行检测。
2.高选择性：荧光染料可以针对目标DNA序列进行选择性标记，从而实现目标分子的准确检测。
3.高兼容性：荧光染料可以与不同的DNA分析方法兼容，如凝胶电泳、荧光定量PCR等。
酶也是常用的DNA分子标记类型之一、通过将酶与DNA标记物结合，可以通过酶的催化反应产生可定量的信号。
常用的酶标记包括辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）。
其主要特点包括：1.高灵敏度：酶催化反应可以在大量酶底物的参与下放大信号，从而提高检测的灵敏度。
2.稳定性：酶标记的DNA可以在各种条件下稳定存在，并且可以长期保存。
3.可视性：酶催化反应可以产生可见的颜色或发光信号，从而直观地观察到标记物。
放射性同位素是DNA分子标记的传统方式之一、通过将放射性同位素与DNA标记物结合，可以通过放射性测量来定量目标DNA序列。
1.高灵敏度：放射性测量可以实现非常低浓度目标DNA的检测。
2.高特异性：放射性同位素标记DNA具有非常高的特异性，可以准确检测目标序列。
3.长期保存：放射性同位素标记的DNA可以长期保存，方便未来的回溯和再分析。
虽然放射性同位素标记具有较高的灵敏度和特异性，但其使用需要特殊的设备和技术，并且存在较高的辐射风险，因此在现代实验室中较少使用。
总结而言，DNA分子标记在生物学研究和诊断中起着至关重要的作用。
不同类型的DNA标记具有各自的特点和应用场景，研究人员可以根据实验需求选择合适的标记方式，以便实现高灵敏度、高特异性和可视化的目标DNA检测。
分子标记种类及概述
分子标记种类及概述分子标记是一种在生物学、生物化学和药理学研究中广泛应用的技术。
它主要通过将分子或化合物与特定的标记物相结合，以便于对其进行检测、跟踪和定量分析。
分子标记的种类非常多样，包括荧光标记、放射性标记、酶标记和生物素标记等。
每种标记方法都有其特定的优势和适用范围，下面将详细介绍这些分子标记的类型及其概述。
1.荧光标记：荧光标记是最常用且广泛应用的一种分子标记方法。
它通过将目标分子与荧光染料结合，利用目标分子与激发光源相互作用后发出荧光信号来进行检测和定量分析。
荧光标记具有灵敏度高、非破坏性、实时监测能力强等特点，适用于细胞生物学、分子遗传学和生物化学等研究领域。
2.放射性标记：放射性标记是利用放射性同位素来标记目标分子的一种方法。
通过将放射性同位素（如3H、14C、32P等）与目标分子结合，可以通过放射性衰变的特性来检测和定量分析目标分子。
放射性标记具有极高的敏感性和特异性，适用于分子生物学、药理学和临床药理学等研究领域。
3.酶标记：酶标记是利用酶来标记目标分子的一种方法。
通过将酶与目标分子结合，然后加入适当的底物来触发酶的催化反应，可以产生可见色素或荧光信号，从而实现对目标分子的检测和定量分析。
酶标记具有高度特异性和灵敏度，适用于生物化学、免疫学和临床检验等研究领域。
4.生物素标记：生物素标记是利用生物素（一种小分子）与目标分子结合，然后利用亲和性层析或荧光染料来检测和定量分析目标分子的一种方法。
生物素标记具有快速、简单和高效的特点，适用于生化学、药理学和分子生物学等研究领域。
除了以上几种常见的分子标记方法外，还有许多其他的分子标记方法，比如金纳米颗粒标记、蛋白质标记和DNA标记等。
这些标记方法可以根据研究的具体需求来选择和应用。
标记方法的选择应考虑到目标分子的性质、研究目的和实验条件等因素。
分子标记在生物学研究中有着广泛的应用，如细胞成像、蛋白质定位、基因表达研究等。
它们在分子和细胞水平上为我们提供了许多有关生物学过程和分子机制的信息。
分子标记种类及概述
分子标记种类及概述分子标记是一种用于标识和追踪分子的技术，主要应用于生物医学研究和临床诊断中。
分子标记的种类繁多，包括荧光标记、放射性标记、放射免疫分析标记、酶标记等。
本文将对这些常见的分子标记进行概述。
荧光标记是最常用的分子标记方法之一，通过将荧光染料与目标分子结合，可以实现对其实时观测和定量分析。
荧光标记的主要优点是高灵敏度、高选择性和易于操作。
常用的荧光染料有荧光素（Fluorescein）、荧光素同工酶（Rhodamine）和青酰胺（Cyanine），它们具有不同的光谱性质和化学稳定性，可以根据实验需要进行选择。
荧光标记的应用包括蛋白质定位、分子诊断和细胞成像等。
放射性标记是利用放射性同位素对分子进行标记，常见的同位素包括碘-125和碘-131、放射性标记的主要优点是灵敏度高，能够实现极低浓度的目标分子的检测。
放射性标记主要应用于放射免疫分析、肿瘤标记和代谢研究等领域。
然而，由于放射性标记具有放射性危险，使用时需要注意安全操作并遵守相关规定。
放射免疫分析标记是将放射性同位素标记的抗原或抗体与待检测物共同作用，通过测定放射性同位素的放射性衰减来定量分析待检测物的含量。
放射免疫分析标记用于检测微量物质，具有高灵敏度和高特异性的优点，广泛应用于生物医学研究和临床诊断中。
放射免疫分析标记可以通过放射性同位素的选择和标记方法的改进来提高其性能。
酶标记是将酶与目标分子结合的一种分子标记方法，通过酶作用产生的特定反应来间接检测目标分子的存在。
常用的酶标记方法包括辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase, HRP）标记、碱性磷酸酶（AlkalinePhosphatase, AP）标记和β-半乳糖苷酶（β-Galactosidase）标记等。
酶标记的优点包括高灵敏度、高稳定性和容易检测，但其缺点是反应时间相对较长。
除了上述常见的分子标记方法外，还有一些其他的分子标记技术，如生物素标记、量子点标记和金纳米颗粒标记等。
遗传学中的分子标记技术
遗传学中的分子标记技术遗传学是研究遗传现象的一门学科，而分子标记技术则是其中的一个重要领域。
它不仅可以帮助我们研究物种间的遗传联系，还可以应用于医学和农业领域，为人们的生活带来更多便利和进步。
本文将介绍遗传学中的分子标记技术，探讨其在实践中的应用以及未来的发展方向。
一、分子标记技术简介分子标记技术是利用分子水平的遗传标记对个体、品系或群体进行鉴别、分类、分子配对等分析的一种技术。
目前常用的几种分子标记技术包括限制性片段长度多态性（RFLP）、随机扩增多态性（RAPD）、序列标记位点（SSR）和单核苷酸多态性（SNP）等。
RFLP技术是一种基于DNA序列限制性切割位点的分析方法。
通过将基因组DNA切成不同的长度片段，然后对这些片段进行电泳分离，最后通过DNA探针的帮助确定特定位点的DNA序列。
RAPD技术则是一种无需事先知道DNA序列的技术，通过使用随机序列的寡核苷酸为引物进行PCR扩增，经过电泳分离后可以得到特定长度的DNA条带。
SSR技术则是利用序列中重复核苷酸序列的多态性，选取特定的序列扩增后进行电泳分离，得到条带后可以确定所研究物种基因组的遗传变异情况。
SNP技术则是一种最新的分子标记技术，它是基于单核苷酸变异位点的方法，通过测量单个碱基的点突变来分析遗传多样性。
二、分子标记技术的应用1.遗传分析分子标记技术在遗传学研究中可以用于基因型鉴定、亲缘关系分析、遗传多样性评估等方面。
例如，利用SSR技术可以分析豆科作物的遗传多样性，帮助育种学家定位有用的基因，并加速豆科作物的育种进程。
另外，RFLP技术还可以用于协助医学领域的DNA指纹分析，对于识别罪犯身份、证明亲子关系等方面都有巨大贡献。
2.病理学研究在病理学研究中，分子标记技术可以用于检测各种疾病的基因突变、表达谱的差异、重要调节基因的变化等。
例如，SNP技术可以用于筛查患有代谢性疾病的患者，SSR技术可以用于评价肿瘤的恶性程度。
3.农业领域分子标记技术在农业领域中的应用越来越普遍，可以用于作物品种鉴别、繁殖方式分析、作物改良等方面。
利用分子标记辅助育种
利用分子标记辅助育种一、分子标记辅助育种概述分子标记辅助育种是现代生物技术与传统育种方法相结合的一种高效育种技术。
它利用分子标记与目标基因紧密连锁的特性，在作物育种过程中对目标基因进行追踪和选择，从而显著提高育种效率和准确性。
随着分子生物学技术的不断发展，分子标记辅助育种已成为作物遗传改良的重要手段，在农业生产中发挥着越来越重要的作用。
二、分子标记辅助育种的关键技术1. 分子标记类型- SSR标记（简单重复序列标记）：SSR标记具有多态性高、共显性遗传、重复性好等优点。
其核心是由1 - 6个核苷酸组成的简单重复序列，广泛分布于基因组中。
通过设计特异性引物对SSR区域进行扩增，根据扩增产物的长度多态性来检测个体间的差异。
例如，在水稻育种中，利用SSR 标记可以有效区分不同品种的水稻，为品种鉴定和纯度检测提供了可靠的方法。
- SNP标记（单核苷酸多态性标记）：SNP标记是基因组中单个核苷酸的变异，是最常见的遗传变异类型。
它具有数量多、分布广泛、检测通量高的特点。
SNP标记的检测方法包括基于PCR的方法、芯片技术和新一代测序技术等。
在玉米育种中，SNP标记已被广泛应用于全基因组关联分析（GWAS），用于挖掘与重要农艺性状相关的基因位点，为分子标记辅助选择提供了丰富的标记资源。
- AFLP标记（扩增片段长度多态性标记）：AFLP标记结合了RFLP（限制性片段长度多态性）和PCR技术的优点，具有较高的多态性检测效率。
其原理是通过对基因组DNA进行限制性内切酶酶切，然后连接特定的接头，再进行选择性扩增。
扩增产物通过电泳分离，根据片段长度多态性来分析遗传差异。
在小麦育种中，AFLP标记可用于构建遗传连锁图谱，定位控制小麦抗病性、品质等性状的基因。
2. 目标基因定位与克隆- 连锁分析：连锁分析是通过研究标记与目标基因在染色体上的连锁关系来定位目标基因的方法。
当标记与目标基因紧密连锁时，它们在遗传过程中倾向于一起传递。
分子标记技术的种类
分子标记技术的种类根据不同的核心技术基础，DNA 分子标记技术大致可分为三类分子标记技术大致可分为三类: : : 第一类以第一类以Southern 杂交为核心杂交为核心, , , 其代表性技术为其代表性技术为RFLP ；第二类以PCR 技术为核心，如RAPD 、SSR 、AFLP 、STS 、SRAP 、TRAP 等；第三类以DNA 序列序列((mRNA 或单核苷酸多态性单核苷酸多态性))为核心，其代表性技术为EST 标记、SNP 标记等。
理想的分子标记应达到以下的要求：标记应达到以下的要求：①具有高的多态性；①具有高的多态性；①具有高的多态性；②共显性遗传；②共显性遗传；②共显性遗传；③能够明确辨别等③能够明确辨别等位基因；位基因；④分布于整个基因组中；④分布于整个基因组中；④分布于整个基因组中；⑤选择中性⑤选择中性⑤选择中性((即无基因多效性即无基因多效性))；⑥检测手段简单、快速；⑦开发成本和使用成本尽量低廉；⑧在实验室内和实验室间重复性好。
目前，没有任何一种分子标记均满足以上的要求，它们均具有各自的优点和不足。
其特点比较见表一。
其特点比较见表一。
1限制性内切酶片段长度态多态性性标记（Restriction Fragment Length Polymorphism ，RFLP ）19741974年，年，Grozdicker 等人鉴定温度敏感表型的腺病毒DNA 突变体时，发现了经限制性内切酶酶解后得到的DNA 片段产生了差异，由此首创了第一代DNA 分子标记技术——限制性内切酶片段长度多态性标记(RFLP )。
其原理是由于不同个体基因型中内切酶位点序列不同同个体基因型中内切酶位点序列不同((可能由碱基插入、缺失、重组或突变等造成)，利用限制性内切酶酶解基因组DNA 时，会产生长度不同的DNA 酶切片段，通过凝胶电泳将通过凝胶电泳将 DNA 片段按各自的长度分开，通过Southern 印迹法，将这些大小不同的DNA 片段转移到硝酸纤维膜或尼龙膜上，再用经同位素或地高辛标记的探针与膜上的酶切片段分子杂交，的探针与膜上的酶切片段分子杂交，最后通过放射性自显影显示杂交带，最后通过放射性自显影显示杂交带，最后通过放射性自显影显示杂交带，即检出即检出限制性片段长度多态性。
分子标记种类及概述
分子标记种类及概述分子标记是一种在生物学和化学研究中广泛应用的技术，用于标记和追踪特定分子或化合物。
这些标记物能够提供关于分子的定位、数量、运动和相互作用的信息，从而帮助研究人员理解生物过程和化学反应的机制。
在本文中，将介绍几种常见的分子标记技术及其应用。
1.荧光标记：荧光标记是一种将荧光染料与目标分子结合的技术。
这些染料能够吸收特定波长的光并发射出不同波长的荧光。
通过在显微镜下观察荧光信号的强度和位置，研究人员可以了解分子在细胞或组织中的分布和动态变化。
荧光标记在细胞成像、蛋白质定位和分子交互作用研究等领域得到广泛应用。
2.放射性标记：放射性标记利用放射性同位素将目标分子标记。
这些同位素会发射出放射性粒子，可以通过放射性探测器进行检测和定量。
放射性标记在生物体内的追踪和代谢研究中具有重要作用。
例如，放射性同位素碘-125可以用于标记核酸和蛋白质，用于核酸杂交实验和蛋白质免疫沉淀等研究。
3.酶标记：酶标记是一种将酶与目标分子结合的技术。
酶可以催化底物的转化并产生可测量的信号。
常用的酶标记方法包括辣根过氧化物酶（HRP）标记和碱性磷酸酶（AP）标记。
这些标记在免疫学实验、分子诊断和酶联免疫吸附实验（ELISA）等领域得到广泛应用。
4.金属标记：金属标记利用金属离子将目标分子标记。
这些金属离子可以与特定配体结合形成稳定的络合物。
常用的金属标记包括铁、铑、镉等。
金属标记在蛋白质结构研究、药物输送和分子成像等领域具有重要应用价值。
5.生物素标记：生物素标记是一种将生物素与目标分子结合的技术。
生物素是一种小分子，能够与亲和力很高的亲生素结合。
通过将亲生素标记上荧光染料或酶等探针，可以实现对目标分子的标记和检测。
生物素标记在免疫组织化学、核酸杂交和蛋白质亲和纯化等领域得到广泛应用。
总之，分子标记技术是现代生物学和化学研究中不可或缺的工具。
通过将特定的标记物与目标分子结合，研究人员可以追踪和定量目标分子在生物体内的分布、运动和相互作用，从而深入了解生物过程和化学反应的机制。
分子标记技术
分子标记技术分子标记技术是一种在物理学、生物学和化学领域具有重要应用的技术，它可以被用来检测和追踪细胞、组织和器官内的少量物质。
此外，它还可以用于分析和组织多种小分子的表征和探索。
与传统的分析技术相比，分子标记技术具有更高的灵敏度，可以快速进行大批量的分析，而不影响样本细节。
分子标记技术主要分为三大类：基于分子探针的标记技术，基于蛋白质和细胞表面抗原的标记技术以及基于偶联反应的标记技术。
基于分子探针的标记技术是一种最常用的分子标记技术，它利用一些特定的化合物来检测特定的物质，如DNA和RNA等。
通常，这些探针化合物是染料或荧光素等有色物质，当它们与特定的分子结合时，会发出特定的荧光信号。
基于蛋白质和细胞表面抗原的标记技术包括各种免疫技术，比如免疫组化，抗原-抗体免疫印迹，以及免疫荧光技术等。
这些技术通过抗原-抗体结合的方式，利用特异的抗体识别特定的蛋白质和细胞表面抗原，并通过染料或荧光素的发光表示检测出的信息。
偶联反应标记技术是一种重要的分子标记技术，它通过一种偶联的反应，将一种可以发出特定荧光或染色信号的化合物连接到另一种特定部位的分子上。
这种技术可以应用于检测例如DNA和RNA等特定类型的分子，从而对细胞内各种活动进行检测。
此外，分子标记技术也是分子生物学和化学研究领域中非常重要的技术，它可以帮助研究者们更好地了解结构、功能和调控机制等相关课题。
它还可以应用于药物开发、重大疾病的研究与治疗、医学诊断等多个领域，对生命科学的研究和发展具有重要的意义。
总而言之，分子标记技术是细胞和分子研究中重要的技术，其结果具有高精确度，可以快速、准确地检测细胞及其内部物质和活动物质，为细胞和分子生物学研究打开了新的大门，也为疾病的诊断和治疗提供了强有力的支持。
分子标记原理和技术
分子标记原理和技术分子标记原理和技术是一种用于研究和检测生物分子的方法。
分子标记是通过给生物分子附上一种特定的标记物，使其能够被观察和测量。
分子标记技术在生物医学研究、临床诊断、药物研发和环境监测等领域都有广泛的应用。
分子标记的原理是利用化学反应将标记物与待检测的生物分子结合起来，然后通过适当的方法观察或检测标记物。
常见的标记物有荧光染料、放射性同位素、酶和金纳米粒子等。
标记物的选择要考虑其化学性质、稳定性、检测灵敏度和特异性等因素。
分子标记技术有很多种，下面列举几种常见的技术：1.荧光标记：荧光标记是最常用的分子标记技术之一、通过给生物分子附加荧光染料，可以通过荧光显微镜观察其分布和表达水平。
荧光标记还可以用于流式细胞术、酶联免疫吸附实验等。
荧光标记可以选择多种不同的荧光染料，如草莓红、FITC和PE等。
2.放射性标记：放射性标记是利用放射性同位素将标记物与生物分子结合起来。
这种标记方法可以通过放射性计数器或放射影像技术来检测，具有极高的灵敏度。
常用的放射性同位素有3H（氚）、14C（碳14）和32P（磷32）等。
3.酶标记：酶标记是利用酶与底物之间的反应来检测生物分子。
常用的酶有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）。
酶标记技术可以通过底物的颜色变化或荧光信号来观察酶的活性和分布。
4. 化学标记：化学标记是利用特定化学反应将标记物与生物分子结合起来。
常见的化学标记方法有SNAP标记、CLIP标记和Biotin-avidin 标记等。
化学标记的优点是反应选择性高，标记物的稳定性和特异性好。
5.金纳米粒子标记：金纳米粒子标记是一种新兴的分子标记技术。
金纳米粒子可以通过调节粒子大小和表面修饰来实现对生物分子的特异性识别。
金纳米粒子标记可以通过紫外-可见吸收光谱或扫描电镜观察。
分子标记技术在生物学研究中扮演着重要角色，能够帮助科学家观察和分析生物分子的功能和相互作用。
此外，分子标记技术还被广泛应用于临床诊断和药物研发领域，例如用于检测肿瘤标记物、鉴定药物靶点和筛选药物库。
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分子标记技术的种类根据不同的核心技术基础,DNA分子标记技术大致可分为三类: 第一类以Southern杂交为核心, 其代表性技术为RFLP;第二类以PCR技术为核心,如RAPD、SSR、AFLP、STS、SRAP、TRAP等;第三类以DNA序列(mRNA或单核苷酸多态性)为核心,其代表性技术为EST标记、SNP标记等。
理想的分子标记应达到以下的要求:①具有高的多态性;②共显性遗传;③能够明确辨别等位基因;④分布于整个基因组中;⑤选择中性(即无基因多效性);⑥检测手段简单、快速;⑦开发成本与使用成本尽量低廉;⑧在实验室内与实验室间重复性好。
目前,没有任何一种分子标记均满足以上的要求,它们均具有各自的优点与不足。
其特点比较见表一。
1限制性内切酶片段长度多态性标记(Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP) 1974年,Grozdicker 等人鉴定温度敏感表型的腺病毒DNA突变体时,发现了经限制性内切酶酶解后得到的DNA片段产生了差异,由此首创了第一代DNA分子标记技术——限制性内切酶片段长度多态性标记(RFLP)。
其原理就是由于不同个体基因型中内切酶位点序列不同(可能由碱基插入、缺失、重组或突变等造成),利用限制性内切酶酶解基因组DNA时,会产生长度不同的DNA 酶切片段,通过凝胶电泳将DNA片段按各自的长度分开,通过Southern印迹法,将这些大小不同的DNA片段转移到硝酸纤维膜或尼龙膜上,再用经同位素或地高辛标记的探针与膜上的酶切片段分子杂交,最后通过放射性自显影显示杂交带,即检出限制性片段长度多态性。
进行RFLP时,酶切要彻底,注意内切酶的选择,对于亲缘关系很近的物种,可增加内切酶的使用种类。
目前RFLP 的使用领域很广泛,其具有以下优点:①RFLP标记源于基因组DNA的自身变异,理论上可覆盖整个基因组,能提供丰富的遗传信息;②标记不受组织、环境与发育阶段的影响;③呈共显性,即杂交时等位DNA片段均呈现带,能区分纯合基因型与杂合基因型,F2表现出 1∶2∶1的孟德尔分离定律[3],提供标记座位完全的遗传信息;④由于限制性内切酶的专一性使结果稳定可靠,重复性好。
其缺点就是:①操作繁琐,费时;②酶切后的DNA质量要求高;③使用放射性同位素进行分子杂交,有危险性等。
2随机扩增多态性DNA标记 (Random Amplified Polymorphic DNA,RAPD)20世纪80年代,基于PCR技术的第二代分子标记技术诞生并迅速发展起来。
1990年,Williams 等发表了一种不需预先知道DNA序列信息的检测核苷酸序列多态性的方法,即随机扩增多态性DNA标记(RAPD)。
其原理就是以碱基顺序随机排列的寡核苷酸单链(8-10bp)为引物,以组织中分离出来的基因组DNA为模板进行扩增。
随机引物在基因组DNA序列上有其特定结合位点,一旦基因组在这些区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变,就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化,从而导致扩增产物的数量与大小发生改变,表现出多态性。
用琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物,溴化乙锭染色后可在紫外光下显现出基因组相应区域DNA的多态性。
与RFLP相比,RAPD方便易行,DNA用量少,设备要求简单,不需DNA探针,设计引物也不需要预先进行序列分析,不依赖于种属特异性与基因组的结构;合成一套引物可以用于不同生物基因组分析,用一个引物就可扩增出许多片段,并且不需使用同位素,安全性好。
但因为引物较短导致退火温度较低,易产生错配,故实验的稳定性与重复性差,且为显性标记,不能区分纯合子与杂合子。
RAPD 标记技术利用单引物扩增多个基因位点使其在一定程度上对反应条件敏感,这会限制其应用。
将RAPD-PCR变成经典的PCR可克服此限制,即设计更长的引物。
1993年,Paran提出的序列特征化扩增区域标记(Sequenced Characterized Amplified Region,SCAR)即为以经典PCR为基础的分子标记技术[1]。
SCAR标记技术通过对产生的RAPD片段克隆与测序,设计一对互补于原来RAPD片段两端序列的24聚体的引物,扩增原来模板DNA,产生SCAR-DNA片段。
相对于RAPD,SCAR由于使用更长的引物与更高的退火温度而具有更高的可靠性与可重复性,对反应条件不敏感,且可以将显性RAPD标记转变为共显性的SCAR标记,从而提高遗传作图效率。
此外,还有任意引物PCR标记(Arbitary primer,AP-PCR)技术与DNA扩增指纹(DNA Amplified fingerprinting,DAF)技术,前者使用20或30bp的任意引物随机扩增基因组DNA,后者用5或8bp的任意引物随机扩增基因组DNA。
这些技术彼此相似,都能提供DNA的多态性信息,用于遗传图谱构建或基因定位等。
当然RAPD标记技术使用最广泛。
3 简单重复序列标记(Simple Sequence Repeat,SSR)1982年,Hamade等人发现了简单重复序列标记(SSR)技术,或称微卫星序列标记(Microsatellite sequence,MS),或短串联重复标记( Short Tandem Repeat,STR)。
真核生物基因组中存在大量重复频率极高而顺序复杂性极低的串联重复序列[5]。
按重复基序的长度可将串联重复序列分为卫星DNA(基序100-300bp)、小卫星DNA(基序10-60bp)、微卫星DNA(基序1-6bp)。
与中卫星DNA(由不同大小串联重复组成)等。
微卫星就是由DNA复制或修复过程中DNA滑动与错配或者有丝分裂、减数分裂期姐妹染色单体不均等交换引起的。
微卫星的突变率在不同物种、同一物种的不同位点或同一位点的不同等位基因间存在很大差异。
尽管微卫星DNA分布于整个基因组的不同位置,但其两端序列多就是保守的单拷贝序列,根据这两端的序列设计一对特异引物,通过PCR技术将期间的核心微卫星DNA序列扩增出来,利用电泳分析技术就可以得到其长度的多态性,此即SSR标记的原理。
SSR 标记具有高度重复性、丰富的多态性、共显性、高度可靠性等优点,但由于其需要对所研究物种的一系列微卫星位点进行克隆与测序分析,以便设计相应的引物,这就是非常费时、费力与代价昂贵的工作,没有足够的投资、人力与时间,就是不可能实现的,因而给它的利用带来了一定困难。
简单重复序列间区标记(Inter-Simple Sequence Repeat,ISSR)可以克服以上提到的SSR标记的缺点,或称锚定简单重复序列标记(Anchored Simple Sequence Repeat,ASSR)。
在SSR序列的3’端或5’端加上一个2-4bp的随机核苷酸,形成微卫星DNA的锚定引物,在PCR反应中,锚定引物可引起特定位点退火,导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间DNA片段进行扩增。
所扩增的inter SSR区域的多个条带通过电泳可分辨,呈现出扩增带的多态性。
该方法不需知道DNA序列即可用锚定引物扩增。
4 扩增片段长度多态性标记(Amplified Fragment Length Polymorphism,AFLP)1993年,荷兰科学家Zbaeau与Vos发现了一种检测DNA多态性的新方法,即扩增片段长度多态性标记(AFLP)。
AFLP就是RFLP与PCR相结合的产物,其原理就是先用两种限制性内切酶(低频剪切酶与高频剪切酶,前者识别为点为6bp,后者为4bp)双酶切基因组DNA产生不同大小的DNA片段,酶切产物玉双链人工接头连接,作为扩增反应的模板DNA,然后以人工接头的互补链为引物进行预扩增,最后在接头互补链的基础上添加 1-3bp选择性核苷酸作引物对模板DNA 再进行选择性扩增,电泳分离获得的DNA扩增片段,根据扩增片段长度的不同检测出多态性。
引物由三部分组成:与人工接头互补的核心碱基序列、限制性内切酶识别位点序列、引物3’端的选择碱基序列(1-10bp)。
接头与接头相邻的酶切片段的几个碱基序列为结合位点。
该技术的独特之处在于所用的专用引物在不知道DNA信息的前提下就可对酶切片段进行PCR扩增。
AFLP结合了RFLP与RAPD两种技术的优势,具有分辨率高、稳定性好、效率高的优点。
但它的技术费用昂贵,对DNA的纯度与内切酶的质量要求很高。
尽管AFLP技术诞生时间较短,但可称之为分子标记技术的又一次重大突破,被认为就是目前一种十分理想、有效的分子标记。
5 表达序列标签标记(Expressed Sequence Tag,EST)1991年,Adams等人用EST对表达序列进行了研究,她们从人脑cDNA文库中随机挑取600个克隆,测序合成EST,从而发现了一系列在脑部表达的新基因并由此建立了表达序列标签标记(EST)技术。
其原理就是将mRNA反转录成cDNA并克隆到载体构建成cDNA文库后,大规模随机挑取cDNA克隆,对其3’端或5’端进行序列,得到的序列与数据库中已知序列比对,从而获得对生物体生长发育、繁殖分化、遗传变异、衰老死亡等生命过程的认识。
ES T即就是通过从cDNA文库中随机挑取的克隆进行测序后所得的部分cDNA的3’端或5’端序列,一般长为300-500bp。
每一个EST代表一个表达基因的部分转录片段。
EST 标记分为两类:一就是以分子杂交为基础,用EST本身作为探针与经过酶切后的基因组DNA杂交而产生;二就是以PCR为基础,按照EST的序列设计引物对植物基因组特殊区域进行PCR扩增而产生。
利用EST标记,对EST序列进行分析可得到大量的基因表达信息。
与其她分子标记相比,EST 标记的优越性在于直接与一个表达基因相关,且大量的EST可累积建立一个新的数据库,为表达基因的鉴别等研究提供大量信息。
由于EST来源于cDNA克隆,因此它部分反映了基因组的结构及不同组织中基因的表达模式。
通常EST还可在Gen Bank及PIR(Protein Information Resource,PIR)等数据库中进行比较分析,以获得其可能的功能、表达模式等信息。
但EST标记所获得的基因组信息不完整,因为如调控序列、内含子等序列并不在EST序列中。
且EST标记需要进行大批量的测序,实验费用较高。
6 单核苷酸多态性标记(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)1998年,在人类基因组计划的实施过程中产生了单核苷酸多态性标记(SNP)技术。
SNP就是指在基因组中同一位点的不同等位基因之间仅有个别核苷酸的差异或只有小的插入、缺失产生的DNA序列多态性。
以这样的DNA序列多态性特征作标记即可区分两个个体遗传物质的差异,此即SNP标记的原理。