HBV感染小鼠模型的研究进展_王军

自 1963 年 Blumberg 发现 HBsAg 以来［3］，人们对 HBV 的 认识与研究不断深入，虽然阐明了 HBV 周期中的诸多问题，但 仍有一些问题尚未解决，如 HBV 侵入肝细胞的受体是什么？ HBV 导致肿瘤发生的机制是什么？ HBV 治疗中如何有效清除 肝细胞内的共价闭合环状 DNA（ cccDNA） ？ 在以上科学问题 的研究过程中，理想的实验动物模型是必不可少的工具。
HBV 可以引起肝脏的急、慢性感染，其中慢性感染是引起 严重肝脏疾病的主要病因。据世界卫生组织报道［1］，全球有约 1 /3 的人曾感染过 HBV，其中有 3． 5 亿人发展为慢性 HBV 感染 （ 主要为 5 岁以下儿童） ，每年约有 100 万人死于 HBV 感染所致 的肝硬化和肝癌。我国是 HBV 感染的高流行地区，第三次全国 乙型 肝 炎 流 行 病 学 调 查 表 明，我 国 人 群 HBsAg 携 带 率 为 7. 18% ，由此推算我国现有慢性 HBV 感染者约 9300 万，其中慢 性乙型肝炎患者约 2000 万。每年新发乙型肝炎病例约 50 ～ 100 万，近年来 一 直 为 我 国 法 定 报 告 传 染 病 发 病 率 之 首。每 年 因 HBV 导致的肝硬化和肝癌死亡病例约 30 万［2］，因此 HBV 感染 仍是我国当前和今后长时期危害人民健康的公共卫生问题。
为了解决 HBV 抗原免疫耐受的问题，Larkin 等［12］用 HBV 转基因小鼠与重症联合免疫缺陷（ severe combined immune deficiency，SCID） 小鼠杂交，构建了 HBV / SCID 转基因小鼠，该小 鼠无 T、B 淋巴细胞，给该小鼠过继输入相同遗传背景的野生 型小鼠脾脏细胞（ T、B 淋巴细胞） ，使表达 HBV 的小鼠肝脏细 胞暴露在健康的免疫系统中，建立了 HBV 转基因小鼠的急性 损伤模型； 随后 Baron 和 Publicover 等［13 － 14］用类似的方法分别 构建的 HBV / T 淋巴细胞抗原受体（ T cell receptor，TCＲ） α － / － 转基因小鼠、HBV / 核基因重组激活基因（ recombination activating gene，ＲAG） 1 － / － 转基因小鼠，均属于适应性免疫缺陷小 鼠，过继输入脾脏细胞重建其免疫系统，得到了类似于人类的 急性 HBV 感染模型，但其操作过程比较复杂，且与人类感染 HBV 后引起肝脏炎症的自然病程相比仍有较大差别。
小鼠具有体型小、繁殖力强、易于饲养、遗传背景明确和易 于标准化等优点，因此建立操作简便、经济实用的小鼠模型是 HBV 研究的 发 展 趋 势。但 是 HBV 严 格 的 种 属 特 异 性 使 得 HBV 不能感染正常小鼠，为打破这一屏障，国内外许多学者进 行了各种尝试并且取得了巨大的进展，本文就支持 HBV 复制 和感染的小鼠模型作一简要综述。 1 HBV 转基因小鼠模型
为有效的将 HBV 基因转入小鼠体内且避免免疫 耐 受， Yang 等［19］构建了 1． 3 倍 HBV 基因组全长的表达质粒，采用高 压水动力转染法经小鼠尾静脉将质粒注入体内，从而大大提高 了 HBV 基因组在小鼠肝脏的表达效率，成功构建了急性 HBV 感染小鼠模型，但是随着小鼠体内 HBV 特异性抗体和细胞毒性 T 淋巴细胞的出现，HBV 的复制仅持续半个月左右。水动力转
王军，等． HBV 感染小鼠模型的研究进展
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综述
HBV 感染小鼠模型的研究进展
王 军，黄豫晓，沈 燕，梁 姣，刘学武，李英辉，赵 亚
（ 第四军医大学基础部，病原生物学教研室，西安 710032）
摘要： HBV 由于其较强的种属特异性，目前尚缺乏理想的实验动物模型来阐明其具体的发病机制。目前有关 HBV 感染模型的
为更好模拟 HBV 自然感染，研究人员试图将人类的肝脏细 胞植入小鼠体内。Ilan 等［23］构建的三聚体模型是一种典型的 人鼠嵌合肝脏小鼠模型，正常小鼠经致死剂量的辐射处理后，静 脉注射 SCID 小鼠的骨髓细胞重建其造血功能，将 HBV 感染过 的人类肝细胞植入其体内，大约 80% 的移植小鼠可检测到病毒 颗粒和 cccDNA，但是该模型小鼠体内人类肝细胞不能维持正常 的组织结构，只能在 1 个月内保持原有的生物学功能，不适合开 展长期研究。为延长人类肝细胞存活时间，Ohashi 等［24］将分离 的人类肝细胞移植到 SCID 小鼠体内，同时给小鼠注射肝细胞生 长因子受体（ c － Met） 的激动型抗体，该抗体可以活化人类 c － Met 而不能作用于鼠 c － Met，从而大大提高人类肝细胞的存活 时间（ 3 ～ 6 个月） ，接种 HBV 后，HBsAg 和 HBV DNA 可在血中 存在 5 个月之久； Brown 等［25］将 HBV 基因组转染永生化的人类 肝细胞后植入 ＲAG － 2 缺陷小鼠（ 无成熟的 T、B 淋巴细胞） ，小 鼠在 5 个月之内都可检出高滴度 HBV DNA。
另一种解决 HBV 抗原免疫耐受问题的方法是通过基因表 达调控系统，在特定的时间及部位诱导 HBV 基因表达，目前常 用的有 Tet － on 系 统［15］，如 Xu 等［16］ 构 建 的 转 基 因 小 鼠，将 rtTA基因置于肝脏特异性启动子载脂蛋白 E 的调控之下，在强 力霉素诱导下，能够在肝脏部位特异性调控 HBV 基因的表达， 但是其在没有强力霉素诱导下存在“漏过性表达”的问题，尚 无法很好解决免疫耐受难题。近年来，研究人员尝试联合使用 Tet 四环素调控系统和 Cre / loxP 基因敲除系统，以实现在转基 因小鼠体内对目的基因的更严格调控，并取得了一定进展［17］。 Lan 等［18］构建的三转基因小鼠，尝试联合采用 Tet － on 调控系 统和 Cre / loxP 基因敲除系统，严格调控 HCV 丝氨酸蛋白酶表 达，为 HBV 转基因小鼠模型研究提供了新的思路。 2 高压水动力法构建的 HBV 转染小鼠模型
研究大多集中在小鼠方面，并已取得了很大进展。综述了 HBV 转基因小鼠、HBV 转染小鼠和人鼠嵌合肝脏 HBV 小鼠等模型的优
缺点，提出合理使用这些模型有பைடு நூலகம்于更好地阐明 HBV 的致病机制。
关键词： 肝炎病毒，乙型； 模型，动物； 小鼠，转基因； 综述
中图分类号： Ｒ512． 62
文献标志码： A
文章编号： 1001 － 5256（ 2016） 01 － 0165 － 04
免疫研究。 通信作者： 赵亚，电子信箱： zhaoya@ fmmu． edu． cn。
目前常见的 HBV 动物模型中，灵长类动物最接近人类，作 为 HBV 感染的动物模型也已得到公认［4 － 5］，其感染 HBV 后与 人类急性感染比较接近，但慢性感染率低且数量稀少，受伦理 因素制约，难以满足 HBV 研究需要； 与灵长类动物亲缘关系较 近的树鼩，体型小且价格低廉，喂养及实验操作简便，作为研究 HBV 感染的动物模型亦使用较多［6］，但树鼩的感染率不高，仅 能引起瞬时感染； 此外，几种与 HBV 相似的嗜肝类 DNA 病毒， 如鸭肝炎病毒、土拨鼠肝炎病毒等也得到了广泛使用［7］，但其 基因结构和生物学功能与 HBV 相差较大，不能完全替代 HBV 感染模型，且多数动物模型遗传背景不清，难以标准化，也使其 应用受到限制。
doi： 10． 3969 / j． issn． 1001 － 5256． 2016． 01． 036 收稿日期： 2015 － 05 － 04； 修回日期： 2015 － 06 － 21。 基金项目： 国家自然科学基金（ 31172167） 作者简介： 王军（ 1988 － ） ，男，助理研究员，主要从事寄生虫感染与
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临床肝胆病杂志第 32 卷第 1 期 2016 年 1 月 J Clin Hepatol，Vol． 32 No． 1，Jan． 2016
开辟了新路，同时构建了含 1． 1、1． 2 及 2． 0 倍全长 HBV 基因 组的转基因小鼠模型，但这些 HBV 转基因小鼠在复制表达水 平、遗传稳定性、实用性等方面还不够理想。Guidotti 等［10］ 在 HBV 全长序列 5'末端重复一个 C 基因和 X 基因及其增强子，构 建了 1． 3 倍全长 HBV 基因组的转基因小鼠，该小鼠体内可检测 到 HBsAg、HBeAg 和 HBcAg，也可观察到小鼠体内完整病毒颗粒 的形成，且病毒颗粒具有感染性，HBV 复制水平与慢性乙型肝 炎患者相当，类似于人类乙型肝炎慢性携带状态［11］，这大大提 高了 HBV 转基因小鼠模型的应用价值，在乙型肝炎治疗和抗病 毒药物筛选等方面做出了重要贡献。但该转基因小鼠最大的缺 点在于免疫耐受性不强，由于 HBV 抗原在胚胎阶段就持续表 达，小鼠产生免疫耐受，该小鼠不会表现出类似于人类乙型肝炎 的免疫病理变化，因而与 HBV 自然感染存在一定差异。
建立转基因小鼠模型是解决 HBV 宿主特异性的有效方 法，早在 1985 年，Chisari 和 Babinet 等［8 － 9］ 分别领导的研究小 组率先采用受精卵显微注射法建立了 HBV 转基因小鼠模型， 他们先后构建了 S 基因、X 基因、C 基因以及全长基因的转基 因小鼠，以模拟不同的 HBV 感染状态，为乙型肝炎的深入研究
Ｒesearch advances in mouse models of hepatitis B virus infection WANG Jun，HUANG Yuxiao，SHEN Yan，et al． （ Department of Pathogenic Biology，Forth Military Medical University，Xi'an 710032，China） Abstract： Hepatitis B virus （ HBV） is a great threat to human health，but due to its strong species specificity，there are still no ideal animal models at present to clarify the pathogenesis of HBV infection． At present，the research on HBV infection models mainly concentrates on mice，and great progress has been achieved / made． This review focuses on the advantages and disadvantages of HBV transgenic mouse model，HBV － transfected mouse model，and human － mouse chimeric liver HBV mouse model，and suggests that rational application of these models helps to clarify the pathogenesis of HBV． Key words： hepatitis B virus； models，animal； mice，transgenic； review