重点篇——叶绿素含量测定方法的研究

叶绿素含量测定方法的研究

侯党权

（安康学院农学与生命科学院，陕西安康725000）摘要：叶绿素是植物进行光合作用的主要色素，叶绿素含量是植物生理研究中的重要指标。本文在前人研究的基础上，就叶绿素含量测定方法的研究进展进行了综述，为叶绿素含量的科学测定提供一定的参考。对研究植物的生理过程及设法提高作物的产量有重要的意义。

关键词：叶绿素含量；方法；研究

我国是一个人口大国，人均耕地面积相对不足，农业问题是关系到我国13亿人口吃饭的大问题，正所谓无农不稳，无工不富，无商不活。因此农业对于我国这样的人口大国尤为重要。利用科学技术提高农业水平对我国经济发展非常需要。

叶绿素是光合作用最重要的产物，同时叶绿素的含量也是植物重要的生理指标之一[1]。由于其对周围环境很敏感，并与植物的光和作用、营养吸收等密切相关，被广泛作为植物生长的常规测定指标项目。因此，研究叶绿素含量的提取方法意义重大。

一、叶绿素的应用研究

1、简介

叶绿素是植物进行光和作用的主要色素，是一类含脂的色素家族，位于类囊体膜。叶绿素吸收大部分的红光和紫光但反射绿光，所以叶绿素呈现绿色，它在光合作用的光吸收中起核心作用。叶绿素为镁卟啉化合物，包括叶绿素a、b、c、d、f以及原叶绿素和细菌叶绿素等。叶绿素不很稳定，光、酸、碱、氧、氧化剂等都会使其分解。酸性条件下，叶绿素分子很容易失去卟啉环中的镁成为去镁叶绿素。叶绿素有造血、提供维生素、解毒、抗病等多种用途。

2、分类

叶绿素分为叶绿素a、叶绿素b、叶绿素c、叶绿素d、叶绿素f、原叶绿素和细菌叶绿素等。

叶绿素名称存在场所最大吸收光带

叶绿素a所有绿色植物中红光和蓝紫光

叶绿素b高等植物、绿藻、眼虫藻、管藻红光和蓝紫光

叶绿素c硅藻、甲藻、褐藻红光和蓝紫光

叶绿素d红藻红光和蓝紫光

叶绿素f细菌非可见光（红外波段）

原叶绿素黄花植物（幼苗期）近于红光和蓝紫光

细菌叶绿素紫色细菌红光和蓝紫光

3、用途

（1）、造血功能

诺贝尔得奖人Dr.Richard Willstatter和Dr.Hans Fisher发现：叶绿素的分子与人体的红血球分子在结构上很是相似，唯一的分别就是各自的核心为镁原子与铁原子。因此，饮用叶绿素对产妇与因意外失血者会有很大的帮助。

（2）、帮助解除体内杀虫剂与药物残渣

营养学家Bernard Jensen博士指出，叶绿素能除去杀虫剂与药物残渣的毒素，并能与辐射性物质结合而将之排出体外。此外，他也发现一般上健康的人会比病患者拥有较高的血球计数，但通过吸收大量的叶绿素之后，病患者的血球计数就会增加，健康状况也会有所改善。

（3）、养颜皮肤

新英国医药期刊曾经做过这样的报导：叶绿素有助于克制内部感染与皮肤问题。美国外科杂志报导：Temple大学在1200名病人身上，尝试以叶绿素医治各种病症，效果极佳。

二、叶绿素提取方法的应用研究

叶绿素含量是重要的植物生理性指标之一。根据所用提取叶绿素的溶剂不同有多种测定方法,在国际上以传统的Arnon法[2](也称研磨法)应用最为广泛。但该法需要把植物材料研磨并经转移、过滤或离心处理,不仅步骤繁琐，工作量大,在提取过程中易损失样品,叶绿素受光氧化而引起测量误差。而且不可避免地使试验人员较长时间与挥发于空气中的试剂相接触,对人体损害较大[3]。因此,有人对此方法进行修改[4],但由于提取不完全、效率低和提取液不稳定而未广泛采用[5]；H iscox&Israe lstan用二甲基亚砜(DMSO)直接浸提植物叶片叶绿素[6],省略了A rnon法研磨和去渣的步骤,但需要在65℃下浸提,叶绿素会受到一定程度的破坏，加之其叶绿素吸收光谱与Arnon法存在一定差异,沿用Arnon法公式必有误差,而且DMSO气味难闻，故未被广泛使用。但叶绿素浸提法受到重视，陈福明、陈顺伟[4]和张宪政[7]分别对不同配比的丙酮、乙醇和水的混合液的浸提效果的研究，证明了利用混合液进行叶绿素浸提的可行性。徐邦发等[8]为解决通常采用分光光度计费工耗时、易引起离体叶绿素的光分解而造成误差等问题，通过比较几种不同混合提取液的提取，提出测定棉花叶片叶绿素含量的最佳方法为丙酮浸提法。陈福明等[4]和刘绚霞等[9]分别对不同配比的丙酮、乙醇和水的混合液的浸提效果进行了研究,证明利用混合液进行叶绿素浸提的可行性。洪法水等[10]研究表明,丙酮与乙醇混合液提取叶绿素存在协同效应,且两者在等摩尔混合时提取效果最好;而彭运生等[5]和刘绚霞等[9]研究认为,丙酮乙醇（2:1）混合液浸提叶绿素效果较好。吴志旭等[11]对丙酮萃取分光光度法测定植

物体内叶绿素a的方法进行了改进，样品经过冷冻，50℃丙酮快速提取并放置2h 后进行测定，时间由8～20h缩短为1.5～2.5h。吴志旭等和李得孝等对传统的Arnon法进行了改进[11～12],将样品冷冻处理后,用50℃丙酮静置提取并进行测定,极大提高了工作效率。

三、目前叶绿素检测方法

叶绿素的含量测定方法有多种，其中主要有：

1、原子吸收光谱法[13]：通过测定镁元素的含量，进而间接计算叶绿素的含量。

2、分光光度法[14]：利用分光光度计测定叶绿素提取液在最大吸收波长下的吸光值，即可用朗伯一比尔定律计算出提取液中各色素的含量。

叶绿素a和叶绿素b在645nm和663nm处有最大吸收，且两吸收曲线相交于

652nm处。因此测定提取液在645nm、663nm、652nm波长下的吸光值，并根据经验公式可分别计算出叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素的含量。

3、光声光谱法[15]：光声光谱法作为一门新兴技术己被广泛地应用于各门学科的研究之中。光声光谱可以得到任何类型固态物质(如晶体、粉末、凝胶直至生物活体)的光谱对于许多传统光谱难于测定的不透明、高反射、高散射试样，常无需制样或稍加制样即可简便地加以测定。生物试样的光声光谱研究近年来有迅速增长。光声光谱是直接探测无辐射跃迁过程的唯一手段，70年代以来已发展成一个专门的研究领域，研究对象涉及物理、化学、生物、材料等学科，并且能给半导体工业和微电子工业的研究提供一种新的研究和检测手段。光声光谱直接测量光束与材料相互作用后所吸收的热量，显然，它是光谱技术与量热技术的组合。同传统的光谱技术相比较。光声光谱技术具有下列特点：

(1)直接测量光束与材料相互作用后所吸收的热量；

(2)对散射光不敏感；

(3)样品本身就是电磁辐射的检测器。光声光谱技术本身的特点使得它能胜任传统光谱技术难于完成或不能完成的某些工作。

4、基于机器视觉技术的叶绿素检测方法[16]

基于计算机视觉的叶绿素检测方法是一种快捷、便利的监测方法，具有无损伤和实时等特点，成为植物叶绿素信息获取的新手段。植物叶片颜色的变化实质上是植物体内叶绿素及其它色素含量变化引起的。叶片的颜色与叶绿素含量有着密不可分的关系，人们往往把叶片颜色变化作为判断作物营养和缺素症发生的直接依据。

这种测定方法与分光光度计法相比，其优势在于快速，简便，省时，省力，节约成本，操作简单，不足之处是精度不如分光光度计法高，但也完全能满足指

定农业生产的需要。与SPAD(日本美能达公司产的SPAD一502叶绿素含量测定仪，其工作原理是通过测量叶片在两种波长范围内的透光系数来确定叶片当前叶绿素的相对数量。)测定方法相比，因SPAD的测定是点触式的，读取的数值仅是仪器探头触点处的叶绿素含量值，不能代表整个叶片的叶绿素含量水平，若要获取整个叶片的叶绿素含量需要进行大量测定，而本方法，只需拍摄一张包含完整叶片的图像，即可获得叶片局部叶绿素的含量，也可获得整个叶片叶绿素含量，甚至多个叶片叶绿素的含量。表现的突出优势为成本低，操作灵活，效率高，精度高。并可作为便携式作物叶片叶绿素含量测定仪。

四、机器视觉技术在作物中的研究应用

机器视觉技术在农业生产上的研究与应用，始于20世纪70年代末期，当时主要研究集中于桃、香蕉、西红柿、黄瓜等农产品的品质检测和分级。由于受到当时计算机发展水平的影响，检测速度达不到实时的要求，处于实验研究阶段。随着电子技术、计算机软硬件技术、与人类视觉相关的生理技术的迅速发展，数字图像技术本身在理论和实践上都取得了重大突破。在农业机械上的研究与应用也有了较大的进展，除农产品分选机械外，目前己渗透到收获、农田作业、农产品品质识别以及植物生长检测等领域，有些已取得了实用性成果[16]。

在国外，计算机视觉技术被广泛的应用于农业生产中，使用颜色特征识别和判别分析柑桔病[17]，基于机器视觉的马铃薯自动分级系统等等[18]。

国内，李少昆等率先将图像技术用于小麦、玉米等大田作物株型信息的提取和生长监测。王克如等利用机器视觉技术获取棉花叶片颜色特征，建立棉花叶片叶绿素测定模型。其研究结果表明RGB颜色系统的B、B／R、HSI系统的H均与叶绿素浓度间呈极显著相关，建立和筛选了六组棉花叶绿素含量预测模型，预测误差在7．8％一13．65％之间[19]。毛罕平等提出了基于计算机视觉的番茄营养元素亏缺的识别，此方法提取的颜色特征能理想识别缺素番茄叶片，结果表明，对不易肉眼判别的番茄缺氮和缺钾初期叶片的识别准确率在85％以上，能满足生产要求[20]。柴阿丽等利用计算机视觉技术建立了根据番茄叶片颜色特征确定其叶绿素含量的一元二次拟合模型，从建立的6组模型中筛选出拟合度较高的3组模型进行检验，预测误差在0～22.22%之间[21]。

五、展望

在基于计算机视觉技术的叶绿素含量的研究中，集图像采集、预处理、分割、分析、叶绿素转换为一体，可以更方便的为农学专家所用，从而提高科研效率。随着数字图像技术的发展，与农业的结合将越来越紧密，对于农产品的无损化检验、作物病虫害的预测分析、农作物产量的预测等方面，有着广阔的应用前景。

参考文献：

[1]徐芬芬，叶利民，徐卫江，等.小白菜叶绿素含量的测定方法比较[J].北方园艺，2010,(23):34-36.

[2]苏正淑,张宪政.几种测定植物叶绿素含量的方法比较[J].植物生理学通讯, 1989,25(5):77-78.

[3]黄帆，郭正元，徐珍.测定浮萍叶绿素含量的方法研究[J].实验技术与管理，2007,24(5).

[4]陈福明,陈顺伟.混合法测定叶绿素含量的研究[J].林业科技通讯，1984(2):4 -8.

[5]彭运生,刘恩.关于提取叶绿素方法的比较研究[J].北京农业大学学报,19 92,18(3):247-249.

[6]H ISCOX J D,ISRAELSTAN G F.A me thod of the ex tracti on o f chlorophy II from leaf tissue withoutm acerati on[J].Can J Bot,1979,57:1332-1 334.

[7]张宪政.植物叶绿素含量测定丙酮乙醇混合液法[J].辽宁农业科学,1986, (3):26-28.

[8]徐邦发,徐雅丽.棉花叶片的叶绿素含量测定[J].塔里木农垦大学学报,1995，7（2）:29-31.

[9]刘绚霞,董振生,刘创社,等.油菜叶绿素提取方法研究[J].中国农学通报,200 4,20(4):62-63.

[10]洪法水,魏正贵,赵贵文.菠菜叶绿素的浸提和协同萃取反应[J].应用化学, 2001,8(7):532-535.

[11]吴志旭,张雅燕.叶绿素a测定方法的改进及最优提取时间探讨[J].甘肃环境研究与检测,2003,16(2):150-152.

[12]李得孝,郭月霞,员海燕,等.玉米叶绿素含量测定方法研究[J].中国农学通报,2005,21(6):153-155.

[13]张宪政.植物叶绿素含量测定方法比较研究[J]沈阳农业大学学报，1985,(4).

[14]杨振德.分光光度法测定叶绿素含量的探讨[J]广西农业生物科学，1996,(2).

[15]陈秉除，方健文，杜浩．光声光谱法测定植物叶片中的叶绿素含量[J]植物生理学通讯，1993,(4)．

[16]Laury Chaerle，Dominique Van Der Straeten．Seeing is believing：imaging techniques to monitor plant health．Biochimica et Biophusica Acta.1519(2001)153-166．

[17]Pydipati，R.，Burks，T.F．and Lee，W.S．Identification of citrus

disease using color features and discriminant analysis．Computer and Electronics in Agriculture52(2006):49-59.2006．

[18]Noordam，J．C．，Otten,GW．，Timmermans，A.J.M．，and Zwol，B．van,“High．Speed potato grading and quality inspection based on a color vision system”，Proceeding of SPIE-Machine vision application in industrial inspection VIII，PP206—217，2000．

[19]王克如，李少昆，王崇桃,等.用机器视觉技术获取棉花叶片叶绿素浓度[J]

作物学报，2006,32(1):34-40.

[20]毛罕平，徐贵力，李萍萍．基于计算机视觉的番茄营养元素亏缺的识别[J]

农业机械学报，2003,34(2):73-75.

[21]柴阿丽，李宝聚，王倩，等．基于计算机视觉技术的番茄叶片叶绿素含量的检测[J]园艺学报,2009,36(1):45-52.