固定化酶制备及酶活力测定
各种酶固定方法
一、D380(功能基团为伯氨基)为载体戊二醒交联固定化α一淀粉酶1、固定化载体的预处理吸附树脂采用乙醇、丙酣、蒸馏水交替处理，最后用蒸馆水冲洗至中性备用；离子交换树脂先用蒸馆水漫泡胀润、去杂，然后用 HCl 、NaOH 交替处理，最后用蒸锢水冲洗至中性，置于 4 "C冰箱保存备用。
2、载体选择取处理后载体(湿态)约1.0g，分别加入 20mL 酶液摇匀，在摇床上室温 (25°C摄氏度),100r/min 振摇，过夜(12h)，弃去上清，并以磷酸缓冲液反复洗涤至洗涤液中无蛋白检出。
分别测定固定化酶和上清液的酶活，并计算固定化得率。
根据其酶活和得率进行筛选。
３、固定化条件的优化取处理后载体(湿态)1.0g左右，加入一定量戊二醒，在摇床上定温(25°C) , 100r/min 振摇一定时间，弃去上清，蒸馏水反复冲洗至无戊二醛残留。
处理后加入酶液进行固定化，条件同载体选择。
4、蛋白质含量测定采用 Bradford 的方法，以牛血清蛋白为标准曲线。
5、酶活收率指实际测定的总的固定化酶活与固定化时所用的全部游离酶活之比。
6、酶活测定以 20.0mL 的 2% 可溶性淀粉为底物，加入 5.0mL 的缓冲液。
在60 °C预热 5min 后加入适量固定化酶或稀释至适当浓度的酶液，准确反应 5min 后，立即取出1.0mL 反应液置于稀腆液5.0mL 中摇匀显色。
以稀腆液为空白，于 660nm 波长下测定其吸光度值。
二、D301 树脂固定化假丝酵母脂肪酶1、固定化载体及其预处理选择 7 种工业应用广泛的吸附和离子交换树脂： D301、D113、AB-8、D3520、D4020、D290、D280, 购自南开大学化工厂。
其中 D301 为大孔弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂,D113 为大孔弱酸性丙烯酸系阳离子交换树脂, AB-8、D3520 和 D4020 为大孔吸附树脂, D290和 D280 为大孔强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂。
固定化酶制备及酶活力测定
实验三固定化酶制备及酶活力测定【实验目的】1.掌握包埋法固定化酶的操作技术。
2.掌握测定碱性蛋白酶活力的原理和酶活力的计算方法。
3.学习测定酶促反应速度的方法和基本操作。
【实验原理】酶活力是指酶催化某些化学反应的能力。
酶活力的大小可以用在一定条件下它所催化的某一化学反应的速度来表示。
测定酶活力实际就是测定被酶所催化的化学反应的速度。
酶促反应的速度可以用单位时间内反应底物的减少量或产物的增加量来表示，为了灵敏起见，通常是测定单位时间内产物的生成量。
由于酶促反应速度可随时间的推移而逐渐降低其增加值，所以，为了正确测得酶活力，就必须测定酶促反应的初速度。
碱性蛋白酶在碱性条件下，可以催化酪蛋白水解生成酪氨酸。
酪氨酸为含有酚羟基的氨基酸，可与福林试剂（磷钨酸与磷钼酸的混合物）发生福林酚反应。
（福林酚反应：福林试剂在碱性条件下极其不稳定，容易定量地被酚类化合物还原，生成钨蓝和钼蓝的混合物，而呈现出不同深浅的蓝色。
）利用比色法即可测定酪氨酸的生成量，用碱性蛋白酶在单位时间内水解酪蛋白产生的酪氨酸的量来表示酶活力。
所谓固定化酶，就是用物理或化学方法处理水溶性的酶使之变成不溶于水或固定于固相载体的但仍具有酶活性的酶衍生物。
在催化反应中,它以固相状态作用于底物，反应完成后,容易与水溶性反应物分离，可反复使用。
固定化酶不但仍具有酶的高度专一性和高催化效率的特点，且比水溶性酶稳定，可较长期使用，具有较高的经济效益。
将酶制成固定化酶，作为生物体内的酶的模拟，可有助于了解微环境对酶功能的影响。
酶的固定化方法大致可分为载体结合法、交联法和包埋法等。
载体结合法：将酶结合到非水溶性的载体上(图1)。
一般来讲,载体的亲水性基团越多，表面积越大，单位载体结合的酶量也越大。
最常用的是共价结合法，此外还有离子结合法、物理吸附法。
①共价结合法是将酶蛋白分子上官能团和载体上的反应基团通过化学价键形成不可逆的连接的方法。
在温和的条件下能偶联的酶蛋白基团包括有氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的羟基等。
制备固定化酶实验报告
一、实验目的1. 了解固定化酶的概念、原理及其在生物催化领域的应用。
2. 掌握固定化酶的制备方法，提高实验操作技能。
3. 通过实验，了解固定化酶的催化活性、稳定性及重用性能。
二、实验原理固定化酶是指通过物理或化学方法将酶固定在固体载体上，使其在催化反应中保持酶活性的一种技术。
固定化酶具有以下优点：1. 提高酶的稳定性，延长使用寿命；2. 方便酶的回收和重复利用；3. 易于控制反应条件，提高催化效率。
固定化酶的制备方法主要有吸附法、包埋法和结合法。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：纤维素、琼脂糖、聚丙烯酰胺、酶、底物、缓冲液等。
2. 实验仪器：离心机、烘箱、恒温水浴锅、显微镜、酶标仪等。
四、实验步骤1. 吸附法固定化酶（1）将纤维素或琼脂糖溶解于缓冲液中，配制成一定浓度的溶液。
（2）将酶溶液与纤维素或琼脂糖溶液混合，搅拌均匀。
（3）将混合液倒入培养皿中，置于烘箱中干燥，形成凝胶。
（4）将凝胶用离心机离心，去除未固定的酶。
（5）将固定化酶洗涤、干燥，备用。
2. 包埋法固定化酶（1）将聚丙烯酰胺溶解于缓冲液中，配制成一定浓度的溶液。
（2）将酶溶液与聚丙烯酰胺溶液混合，搅拌均匀。
（3）将混合液倒入培养皿中，置于烘箱中干燥，形成凝胶。
（4）将凝胶用离心机离心，去除未固定的酶。
（5）将固定化酶洗涤、干燥，备用。
3. 结合法固定化酶（1）将酶蛋白分子与不溶性固相支持物（如离子交换树脂）进行离子键结合。
（2）将结合后的酶蛋白分子与底物反应，观察催化效果。
五、实验结果与分析1. 吸附法固定化酶：通过吸附法固定化酶，酶的活性保持较好，但固定化酶的稳定性较差，易受外界环境因素影响。
2. 包埋法固定化酶：通过包埋法固定化酶，酶的活性保持较好，稳定性较高，但固定化酶的催化效率较低。
3. 结合法固定化酶：通过结合法固定化酶，酶的活性保持较好，稳定性较高，且催化效率较高。
六、实验结论1. 固定化酶的制备方法有吸附法、包埋法和结合法，各方法有其优缺点。
实验五 固定化脲酶活力的测定
实验五固定化脲酶活力的测定一、实验原理固定化酶的活力测定方法，有振荡测定法、酶柱测定法和连续测定法等多种方法。
常用的振荡测定法，是将一定质量的固定化酶放在一定形状和大小的容器中，加入一定量的底物溶液，在固定化酶的最适反应条件下，振荡或搅拌反应系统，反应一定的时间后，取出一定量的反应液，进行酶活力测定。
酶活力测定的反应原理和方法与溶液酶活力的测定方法相同：脲酶催化尿素水解生成氨和二氧化碳，最适反应pH 7.0。
氨与纳氏试剂反应生成黄色配合物，其吸光度与氨浓度成正比。
故可测定脲酶活力的大小。
二、仪器和试剂1、水浴锅，分光光度计，移液管，比色皿及其他常规仪器2、实验四制备的固定化脲酶3、磷酸缓冲液（pH 7.0）：6.7 g Na2HPO4.2H2O，3.25 g KH2PO4，溶于蒸馏水并定容至100 ml4、3%尿素溶液：3 g尿素溶于磷酸缓冲液中，并定容至100 ml5、标准氨溶液：称取在60℃干燥至恒重的分析纯硫酸铵1.322 g，蒸馏水溶解并定容至100 ml。
此溶液含NH3为40 µM6、1 M H2SO4溶液：56 ml浓硫酸，缓慢加入盛有600 ml蒸馏水容量瓶中，冷却后加水定容至1000 ml7、纳氏试剂：称取16 g氢氧化纳，溶于50 mL水中，充分冷却至室温。
另称取7 g碘化钾和10 g碘化汞(HgI2)溶于水，然后将此溶液在搅拌下徐徐注入氢氧化纳溶液中，用水稀释至100 mL，过夜澄清后，倒出上清液贮于棕色瓶中，密塞保存。
三、实验步骤1、将实验四中得到的凝胶包埋脲酶重新称重（m1）。
取0.3-0.5 g，切碎。
2、取两支试管编号（1号空白管，3号样品管），分别称取凝胶包埋脲酶100mg（m2）置于两管中，各加入蒸馏水9 ml，磷酸缓冲液1 ml，于30℃水浴中保温5 min。
3、向3号管加入30℃预保温的3%尿素溶液1 ml，并准确开始计时；向1号管加蒸馏水1 ml，于30℃水浴中反应20 min（t），并不断振摇。
酶固定化实验报告
一、实验目的1. 了解酶固定化的原理和方法。
2. 掌握酶固定化过程中的关键步骤。
3. 分析固定化酶的性能及其影响因素。
二、实验原理酶固定化是将酶固定在固体载体上，使其在反应过程中保持活性，便于重复使用。
固定化酶具有以下优点：1. 提高酶的稳定性，延长酶的使用寿命。
2. 降低酶的生产成本，提高生产效率。
3. 方便酶的分离和回收，减少环境污染。
三、实验材料1. 酶：青霉素酰化酶（PGA）2. 固定化载体：海藻酸钠、明胶、壳聚糖等3. 试剂：NaCl、CaCl2、HCl、NaOH、磷酸盐缓冲液等4. 仪器：恒温水浴、pH计、分光光度计、移液器、离心机等四、实验步骤1. 酶的活化将青霉素酰化酶溶于磷酸盐缓冲液，调节pH值为7.0，在37℃下活化30分钟。
2. 载体的准备将海藻酸钠、明胶、壳聚糖等载体分别溶解于磷酸盐缓冲液中，制备成浓度为1%的溶液。
3. 酶的固定化将活化后的酶与载体溶液混合，搅拌混合均匀。
将混合液滴入CaCl2溶液中，使酶与载体形成凝胶珠。
4. 固定化酶的洗涤用磷酸盐缓冲液反复洗涤固定化酶凝胶珠，去除未固定的酶和杂质。
5. 固定化酶的活化将洗涤后的固定化酶凝胶珠放入磷酸盐缓冲液中，在37℃下活化30分钟。
6. 酶活性的测定采用比色法测定固定化酶的活性。
以青霉素G为底物，在37℃下反应30分钟，用紫外分光光度计测定反应液中的青霉素G浓度，计算酶活性。
7. 固定化酶的稳定性测试将固定化酶凝胶珠分别在不同温度、pH值、离子强度等条件下进行稳定性测试。
五、实验结果与分析1. 酶的固定化效果通过比色法测定，固定化酶的活性与游离酶活性相近，表明固定化过程未对酶活性产生显著影响。
2. 固定化酶的稳定性固定化酶在不同温度、pH值、离子强度等条件下均表现出良好的稳定性，表明固定化酶具有良好的耐温、耐酸碱、耐盐等性能。
3. 固定化酶的重复使用性固定化酶经过多次反应和洗涤后，仍保持较高的酶活性，表明固定化酶具有良好的重复使用性。
实验四 α-淀粉酶的固定化及其酶活测定
酶活力测定
吸取20.0 mL可溶性淀粉溶液于烧杯中，加入磷酸缓冲液
5 mL，摇匀后，置于40℃±0.2℃恒温水浴中预热8 min；
加入1g固定化酶，立即计时，100r/min条件下准确反应5 min；
立即用移液管吸取1.0 mL反应液，加到预先盛有0.5 mL
盐酸溶液和5. 00 mL稀碘液的试管中，摇匀，并以0.5 mL 盐酸溶液和5.00 mL稀碘液为空白，于660 nm波长下，用 10 mm比色皿迅速测定其吸光度(A)。根据吸光度查表A.1， 求得测试酶液的浓度。
三、仪器和试剂
仪器：
电子天平、分光光度计、水浴锅、烧杯、玻棒、 量筒、试管、量筒、移液管、注射器（带7号针 头）、纱布等。 试剂：
海藻酸钠、无水氯化钙、无水磷酸氢二钠、氯 化钠、苯甲酸、可溶性淀粉、碘酸钾、碘化钾、 浓盐酸。
四、实验方法
配A液：
取0.75 g海藻酸钠溶在25 ml蒸馏水中， 沸水浴（勿用电炉直接加热）充分溶胀。自 然冷却。
作中Ca2+的作用有何区别？
酶的固定化方法
海藻酸钙凝胶包埋法
称取一定量的海藻酸钠，溶于水，配制成一定浓 度的海藻酸钠溶液一定浓度的氯 化钙溶液中，形成球状固定化酶胶粒。
海藻酸钙凝胶包埋法制备固定化酶的操作简便， 条件温和，通过改变海藻酸钠的浓度可以改变凝 胶的孔径，还适合于多种细胞的固定化。
五、酶活力计算
中温α-淀粉酶制剂的酶活力按下式计算: X1 = c× n 式中: X1—样品的酶活力，u/mL或u/g c—测试酶样浓度，u/mL或u/g n—样品的稀释倍数（可通过反应时间和加入 固定化酶的量来控制） 。 所得结果表示至整数。 允许差： 平行试验相对误差不得超过5%
六、思考题
固定酶的实验报告
一、实验目的1. 了解固定酶的概念、原理和特点；2. 掌握固定酶的制备方法；3. 探究固定酶在酶促反应中的催化活性。
二、实验原理固定酶是指将酶固定在固体载体上，使其在催化反应过程中保持稳定性和重复使用性的酶。
固定酶具有以下特点：1. 催化活性高，稳定性好；2. 可重复使用，降低成本；3. 便于分离、纯化和回收。
固定酶的制备方法主要有吸附法、交联法和包埋法等。
本实验采用吸附法固定酶。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 蛋白酶- 牛奶- 硅胶- 酶反应缓冲液- pH试纸- 移液器- 离心机- 酶标仪2. 实验仪器：- 烧杯- 玻璃棒- 移液管- 恒温水浴锅- 酶标仪四、实验步骤1. 准备固定化蛋白酶（1）将蛋白酶溶液与硅胶混合，比例为1:10；（2）搅拌均匀，使蛋白酶充分吸附在硅胶表面；（3）将混合液倒入烧杯中，加入适量的酶反应缓冲液，调节pH值至蛋白酶的最佳pH值；（4）将烧杯放入恒温水浴锅中，恒温30分钟；（5）取出烧杯，用玻璃棒搅拌，使固定化蛋白酶充分分散；（6）用离心机离心，去除未吸附的蛋白酶溶液；（7）收集固定化蛋白酶，备用。
2. 酶促反应（1）将固定化蛋白酶与牛奶混合，比例为1:10；（2）用pH试纸检测混合液的pH值，确保在蛋白酶的最佳pH值范围内；（3）将混合液放入恒温水浴锅中，恒温30分钟；（4）取出混合液，用酶标仪检测酶促反应的活性。
五、实验结果与分析1. 固定化蛋白酶的制备通过吸附法固定蛋白酶，成功制备了固定化蛋白酶。
固定化蛋白酶在离心后，与未吸附的蛋白酶溶液分离，说明固定化效果良好。
2. 酶促反应活性在酶促反应中，固定化蛋白酶对牛奶中的蛋白质具有催化分解作用。
通过酶标仪检测，固定化蛋白酶的酶促反应活性较高，表明固定化酶具有良好的催化效果。
六、实验结论1. 固定酶是一种具有催化活性高、稳定性好、可重复使用等特点的酶；2. 吸附法是一种有效的固定酶制备方法；3. 固定酶在酶促反应中具有较好的催化效果。
固定化酶制备及酶活力测定
馏水，充分摇匀。 （4） 用721型分光光度计，以0号管作对照，在680 nm 处测定光密度。 （5） 以光密度为纵坐标，酪氨酸含量（微克数）为横坐标，绘制标准曲线。
表1-1 不同含量酪氨酸溶液的配制
试管编号
0 1 2 3 4 5 6
酪氨酸含量 （μg） 0 100 200 300 400 500 600
1 克碱性蛋白酶粉在pH 10，40℃的条件下，每分钟水解酪蛋白能产生1 微克酪氨酸， 定为一个酶活力单位（U）。
本实验中碱性蛋白酶活力单位的计算： 每克碱性蛋白酶的活力单位= m / t × f M：样品所测定的光密度值，经查标准曲线求得的酪氨酸量（μg）； t：酶促反应的时间（15 min）； f：酶的稀释倍数，本实验中f =1000
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固定化酶制备及酶活力测定
实验者：张伟达 绿色制药1402班 201430360226 同组者：张朝焕、张颖琼 实验日期：2016年5月30日 报告完成日期：2016年6月1日 指导老师：易 喻
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1mg/mL 酪氨酸 标准溶液（mL）
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
蒸馏水 （mL）
2.0 1.9 1.8 1.7 1.6 1.5 1.4
1.2.2.2 固定化酶活力测定 上述固定化的蛋白酶或相当量的游离蛋白酶（20 mL）置于盛有20 mL pH 10缓冲液的 三角瓶中，加20 mL 1%酪蛋白溶液，于40℃水浴保温15 min后，取3 mL置于试管中，加3 mL，三氯醋酸溶液。对照管为1 mL缓冲液＋1 mL蛋白酶液＋3 mL三氯醋酸溶液＋1 mL 1% 酪蛋白溶液（顺序不可颠倒），于40℃水浴保温15min。摇匀后，各管分别过滤，吸取滤液 1mL，加入0.4 mol/L 碳酸钠溶液5mL，福林试剂1 mL，充分摇匀，于40℃水浴保温5min， 然后每管各加入3 mL 蒸馏水，摇匀。用721 型分光光度计在波长680 nm处，以对照管为
0.7
0.6
y = 0.0009 x + 0.0166
R² = 0.9941
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0
100
200
300
400
500
600
700
根据表格数据用计算机拟合得到OD值与酪氨酸含量的标准曲线为y = 0.0009 x + 0.0166
2.1.1 酪氨酸标准曲线的绘制
本实验中碱性蛋白酶活力单位的定义：
1
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1. 实验过程
1.1 试剂与仪器 1.1.1 试剂 ①海藻酸钠，0.3%氯化钙 ②碱性蛋白酶（1.0 mg/mL） ③福林试剂 ④1%酪蛋白溶液 ⑤ pH 10 缓冲液 ⑥标准酪氨酸溶液 ⑦0.4mol/L 碳酸钠溶液，0.4molห้องสมุดไป่ตู้L 三氯醋酸溶液 1.1.2 仪器
馏水，充分摇匀。 （4） 用721型分光光度计，以0号管作对照，在680 nm 处测定光密度。 （5） 以光密度为纵坐标，酪氨酸含量（微克数）为横坐标，绘制标准曲线。
表1-1 不同含量酪氨酸溶液的配制
试管编号
0 1 2 3 4 5 6
酪氨酸含量 （μg） 0 100 200 300 400 500 600
1 克碱性蛋白酶粉在pH 10，40℃的条件下，每分钟水解酪蛋白能产生1 微克酪氨酸， 定为一个酶活力单位（U）。
本实验中碱性蛋白酶活力单位的计算： 每克碱性蛋白酶的活力单位= m / t × f M：样品所测定的光密度值，经查标准曲线求得的酪氨酸量（μg）； t：酶促反应的时间（15 min）； f：酶的稀释倍数，本实验中f =1000
实验结果表明：固定化酶能够增强酶的稳定性，便于酶和底物的分离，但多次使用可 能会降低酶活力，但具体情况还有待更多相关实验的测定。本组固定化酶的酶活力大约是 游离酶活力的60%，说明固定化酶的活力明显低于游离酶的活力，这也印证了酶固定化过 程中有部分酶损失或者包埋不彻底，以及部分处理操作方法影响了酶的活性甚至使部分酶 失活。在实际生产中，固定化酶虽然活性不及游离酶，但是却有着游离酶不可比拟的优 势，因此我们要找到酶活与量的平衡点，找到一个最经济却最实用的量。
【前 言】酶的固定化是指在一定的空间范围内起催化作用，并能反复和连续使用的酶。通 常酶催化反应都是在水溶液中进行的，而固定化酶是将水溶性酶用物理或化学方法处理，使 之成为不溶于水的，但仍具有酶活性的状态。酶活力指酶催化某些反应的能力。酶活力可用 一定条件下它催化的某一化学反应的反应速度来表示。为了灵敏起见，通常测定单位时间内 产物的生成量。由于酶促反应速度随时间推移而降低，为正确测得其活力，必须测定反应的 初速度。碱性蛋白酶在碱性条件下可以催化酪蛋白水解生成酪氨酸。酪氨酸为含有酚羟基的 氨基酸，可以福林试剂（磷钨酸与磷钼酸的混合物）发生福林酚反应。利用比色法测定酪氨 酸的量，用碱性蛋白酶在单位时间内水解酪蛋白产生的酪氨酸的量来表示酶活力。
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固定化酶制备及酶活力测定
实验者：张伟达 绿色制药1402班 201430360226 同组者：张朝焕、张颖琼 实验日期：2016年5月30日 报告完成日期：2016年6月1日 指导老师：易 喻
【摘 要】酶的固定化技术是用物理或化学方法处理水溶性酶使之成为不溶于水或溶于固定 相载体后仍具有活性的酶的衍生物，固定化酶不但具有一般酶的特性，而且还可以长期重复 使用，具有较高的经济效益。本实验采用包埋法进行酶的固定化，并使用福林酚法测定碱性 蛋白酶的酶活力（即酶所催化的化学反应的速度）。根据实践可知：包埋法固定化酶条件相 对温和，能够重复使用，但方法本身会一定程度上造成酶的活力的降低。
①磁力搅拌棒
②恒温水浴锅
③注射器 ④烧杯（100mL，500mL） ⑤布氏漏斗
⑥分析天平
⑦容量瓶
⑧移液管 ⑨721 分光光度计 1.2 操作步骤 1.2.1 酶的固定化 称取 1.00g 海藻酸钠于盛有 30mL 蒸馏水的烧杯中，加热至沸腾完全溶解后，放置室温 渐冷却至 38℃左右，加入预先制备好的碱性蛋白酶溶液 20mL。 用注射器抽取海藻酸钠－酶混合物，将混合物缓慢滴入盛有 200mL3.0％氯化钙溶液的 烧杯中，同时烧杯置于磁力搅拌器上匀速搅拌，滴完后静置硬化 30min，倾去氯化钙溶液， 用适量蒸馏水洗涤 2~3 次，除去漂浮的空化珠状颗粒后，即制备得到固定化的碱性蛋白酶。 1.2.2 酶活力的测定 1.2.1.1 制备酪氨酸标准曲线 （1） 取7 支试管，编号，按下表配制不同含量的酪氨酸溶液。（见下表） （2） 在上述7 支试管中，分别加入1%酪蛋白溶液1mL，于40℃水浴中保温15 min，
5
取出后，加入0.4 mol/L 三氯醋酸3 mL，充分摇匀，各管分别用滤纸过滤。
2
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（3）分别吸取滤液1mL 放入另7 支试管中，加入0.4 mol/L 碳酸钠溶液5 mL，福林试 剂1 mL，充分摇匀，于40℃水浴中保温15 min，然后于每管中各加入3 mL 蒸
3. 注意事项与心得总结
3.1 注意事项 （1）酶液与加热溶解的海藻酸钠混合时，海藻酸钠溶液一定要冷却至40℃以下后再加 入酶液，以免高温导致碱性蛋白酶酶失活。 （2）固定化酶颗粒制备中，海藻酸钠－酶混合物向CaCl2 溶液滴加的速度不要过快， 混合物要呈颗粒进入CaCl2 溶液，以免形成念珠状颗粒。 （3）在制备酶活力测定的空白对照时要先加入三氯醋酸使酶失活，再加入酪蛋白溶液， 顺序不可以颠倒。 （4）在酶活力测定是要严格控制水浴保温的时间一致，控制变量，减少实验误差。 （5）每次使用比色皿测吸光度值时要保证比色皿充分洗干净，最好在乙醇溶液中浸泡 一下。 3.2 心得体会 固定化酶拥有不可比拟的优点，具有很强的实用性和经济效益。本实验通过包埋法进 行了固定化酶的制备及固定酶与游离酶的酶活力比较，发现固定酶虽然能够增强酶的稳定 性，便于酶和底物的分离，但是会造成酶量的损失，使酶活力降低。所以需要寻求一种能 提高酶结合率的固定方法。我们在有条件时还可以尝试其他方法进行酶的固定化，比如交 联法、载体结合法等进行尝试。 致谢： 感谢队友们的合作共同进步以及易喻老师的耐心指导！
【关键词】固定化酶技术 酶 包埋法 福林酚法 酶活力 【Abstract】Technology of immobilized enzyme is physical or chemical methods were used to deal with water soluble enzyme to become insoluble in water or dissolved in stationary phase carrier still has derivatives of the activity of the enzyme, immobilized enzyme not only has general enzymatic properties, but also can be repeatedly used for a long time, has high economic benefit. In this experiment the embedding method of enzyme immobilization, and using the Folin phenol method for the determination of the enzyme activity of alkaline protease (i.e., the enzyme that catalyzes the chemical reaction speed). According to the practice, it can be known that the condition of immobilized enzyme is relatively mild, and can be used repeatedly, but the method itself will cause the enzyme activity to be reduced to a certain extent.
表2-2 固定酶与游离酶活力的测定比较表
空白 固定酶 游离酶
酶量 （mg）
1.0
1.0 1.0 1.0 1.0
OD值
0.000 0.279 0.275 0.438 0.428
酪氨酸量 （μg）
0.00
291.56 287.11 462.67 457.11
碱性蛋白酶活力单位 （U） 0.00
19437.04 19140.74 30844.44 30474.07
19288.89 30659.26
酶结合效率 （%）
62.91
2.2 实验讨论 本实验中标准曲线绘制时得到的R2>0.99，线性关系良好。部分实验误差的来源可能来
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