蛋白质和氨基酸的测定

5.5蛋白质和氨基酸的测定

5.1 概述

（1）食品中的蛋白质含量及测定意义

（2）蛋白质系数

（3）蛋白质测定方法

5.2 凯氏定氮法

5.3氨基酸氮的测定

自学引导题

1、蛋白质系数是如何计算出来的？

2、蛋白质的测定方法有哪些？国家标准是哪一种方法？

3、为什么说用凯氏定氮法测出的是粗蛋白的含量？

蛋白质的测定意义

测定食品中蛋白质的含量，对于评价食品的营养价值、合理开发利用食品资源、提高产品质量、优化食品配方、指导经济核算及生产过程控制均具有极重要的意义。

蛋白质是复杂的含氮有机化合物，所含的主要化学元素为C、H、O、N,在某些蛋白质中还含有微量的P、Cu、Fe、I等元素，但含氮则是蛋白质区别其他有机化合物的主要标志。

蛋白质系数

不同的蛋白质其氨基酸构成比例及方式不同，故各种不同的蛋白质其含氮量也不同，一般蛋白质含氮量为16%，即一份氮素相当于6.25份蛋白质，此数值（6.25）称为蛋白质系数。

不同种类食品的蛋白质系数有所不同，如玉米，荞麦，青豆，鸡蛋等为6.25，花生为5.46，大米为5.95，大豆及其制品为5.71，小麦粉为5.70，牛乳及其制品为6.38。

蛋白质含量测定最常用的方法

凯氏定氮法是通过测出样品中的总含氮量再乘以相应的蛋白质系数而求出蛋白质的含量，由于样品中含有少量非蛋白质用凯氏定氮法通过测总氮量来确定蛋白质含量，包含了核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉、以及含氮色素等非氮蛋白质含氮化合物，所以这样的测定结果称为粗蛋白。

凯氏定氮法是测定总有机氮量较为准确、操作较为简单的方法之一，可用于所有动、植物食品的分析及各种加工食品的分析，可同时测定多个样品，故国内外应用较为普遍，是个经典分析方法，至今仍被作为标准检验方法。

此法可应用于各类食品中蛋白质含量测定

凯氏定氮法：常量法、微量法及经改进后的改良凯氏定氮法

微量凯氏定氮法样品质量及试剂用量较少，且有一套微量凯氏定氮器。

目前通用以硫酸铜作催化剂的常量、半微量、微量凯氏定氮法。

在凯氏法改良中主要的问题是，氮化合物中氮的完全氨化问题及缩短时间、

简化操作的问题，即分解试样所用的催化剂。

常量改良凯氏定氮法在催化剂中增加了二氧化钛。

凯氏定氮法

(1) 原理

样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以标准盐酸或硫酸溶液滴定。根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。

消化反应方程式如下：

2NH2(CH)2COOH ＋13H2SO4 ＝(NH4)2SO4 ＋6CO2 ＋12SO2 ＋16H2O

浓硫酸具有脱水性，使有机物脱水后被炭化为碳、氢、氮。

浓硫酸又具有氧化性,将有机物炭化后的碳化为二氧化碳，硫酸则被还原成二氧化硫

2H2SO4 ＋C ＝2SO2＋2H2O ＋CO2

二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫，氨随之与硫酸作用生成硫酸铵留在酸性溶液中。

H2SO4＋2NH3 ＝(NH4)2SO4

②蒸馏

在消化完全的样品溶液中加入浓氢氧化钠使呈碱性，加热蒸馏，即可释放出氨气，反应方程式如下：

2NaOH＋(NH4)2SO4＝2NH3＋Na2SO4 ＋2H2O

③吸收与滴定

加热蒸馏所放出的氨，可用硼酸溶液进行吸收，待吸收完全后，再用盐酸标准溶液滴定，因硼酸呈微弱酸性（k＝5.8×10-10），用酸滴定不影响指示剂的变色反应，但它有吸收氨的作用，吸收及滴定的反应方程式如下：

2NH3 + 4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O

(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3

(2)测定方法

①样品消化

：样品消化步骤同常量法。将消化完全的消化液冷却后，完全转入容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀。

观察与思考：

1、样品中加入浓硫酸后，溶液的颜色立即发生什么变化？

2、消化过程中是否有大量的泡冲到瓶颈，原因是什么？

3、瓶颈有什么颜色的有毒烟产生？

4、如何判断消化的终点？

②蒸馏

按图安装好微量定氮蒸馏装置。于水蒸气发生瓶内装水至2/3容积处，加甲基橙指示剂数滴及硫酸数毫升，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。

在接受瓶中加入10ml 40g/L 硼酸及2滴混合指示剂，将冷凝管下端插入液面以下。

③ 滴定

取下接受瓶，以0.01000mol/L 盐酸标准溶液滴定至微红色为终点。

(3) 结果计算

式中W —蛋白质的质量分数，%；

V0—滴定空白蒸馏液消耗盐酸标准液体积，mL ；

V1—滴定样品蒸馏液消耗盐酸标准液体积，mL ；

V2—蒸馏时吸取样品稀释液体积，mL ；

C —盐酸标准液的浓度，mol/L ；

0.014—氮的毫摩尔质量，g/mmol ；

F —蛋白质系数；

m —样品质量，g 。

(4)样品的分解条件

（1）K2SO4或Na2SO4 ：提高溶液的沸点

(2)催化剂 ：CuSO4

氧化汞和汞 良好的催化剂，但剧毒；

硒粉

（3）氧化剂 过氧化氢

硫酸钾的作用

加入硫酸钾可以提高溶液的沸点而加快有机物的分解，它与硫酸钾作用生成硫酸氢钾可提高反应温度其反应式如下：

K2SO4+H2SO4=2KHSO4

2KHSO4=K2SO4+H2O ↑+SO3

一般纯硫酸的沸点在340摄氏度左右，而添加硫酸钾后，可使温度提高到4000C 以上，原因主要在于随着消化过程中硫酸不断地被分解，水分不断逸出而使硫酸钾浓度增大 ，故沸点升高。

但硫酸钾加入量不能太大，否则消化体系温度过高，又会引起已生成的铵盐发生热分解而造成损失：

（NH4）2SO4=NH3↑+(NH4)HSO4

2(NH4)HSO4=2NH3↑+2SO3↑+2H2O

硫酸铜的作用

① 催化剂 2CuSO4=CuSO4+SO2↑+O2

C+2CuSO4=Cu2SO4+SO2↑+O2↑

Cu2SO4+2H2SO4=2CuSO4+2H2O+SO2↑

此反应不断进行，待有机物被消化完后，不再有硫酸亚铜（褐色）生成，溶液呈现清澈的蓝绿色。

② 可以指示消化终点的到达

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