第八章植物基因工程.pptx
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高等植物基因工程PPT课件
细胞中。
辅助Ti质粒
微型Ti质粒
2019/12/5
14
根癌农杆菌转化的一般步骤
转化程序 （1）选择外植体
叶片、子叶、胚轴、… 选择转化能力较强幼期外植体 最佳感受态时期 外植体易于组培，再生 外植体要暴露分生组织细胞，增加农杆菌
与分生组织细胞接触面。
HE Wenxing
UN2IV0E1R9S/IT1Y2/O5F Jinan
2019/12/5
2
Ti质粒（Tumor induced plasmid）
T-DNA
ห้องสมุดไป่ตู้
25 bp 重复区
Vir
分裂素
Opine 合成
25 bp 重复区
Ti 质粒 tra
(160-250 kb)
分解
Rep
tra
2019/12/5
3
T-DNA
T-DNA长约23kb （ 15kb-30kb ） ，共 有三套基因：
15
（2）共培养
农杆菌溶液接种到外植体损伤切面浸泡一段时间。然后洗 掉非伤面菌液转到培养基上共培养（将接种农杆菌的外植体 置于诱导培养基上，此时农杆菌随外植体的细胞分裂而繁殖 并进行侵染，T-DNA转移整合，此过程叫共培养）。
植物中一般不存在质粒，为利用农杆菌的Ti质粒，发展了一 元载体系统和双元载体系统，避免了在大的Ti质粒上进行分 子重组操作的困难。
HE Wenxing
UN2IV0E1R9S/IT1Y2/O5F Jinan
9
用于植物基因转化的Ti质粒载体系统
一元载体系统/共整合载体系统 双元载体系统
HE Wenxing
c. Ti质粒过大，重组操作非常困难，也很难找到单一的 酶切位点。
辅助Ti质粒
微型Ti质粒
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14
根癌农杆菌转化的一般步骤
转化程序 （1）选择外植体
叶片、子叶、胚轴、… 选择转化能力较强幼期外植体 最佳感受态时期 外植体易于组培，再生 外植体要暴露分生组织细胞，增加农杆菌
与分生组织细胞接触面。
HE Wenxing
UN2IV0E1R9S/IT1Y2/O5F Jinan
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2
Ti质粒（Tumor induced plasmid）
T-DNA
ห้องสมุดไป่ตู้
25 bp 重复区
Vir
分裂素
Opine 合成
25 bp 重复区
Ti 质粒 tra
(160-250 kb)
分解
Rep
tra
2019/12/5
3
T-DNA
T-DNA长约23kb （ 15kb-30kb ） ，共 有三套基因：
15
（2）共培养
农杆菌溶液接种到外植体损伤切面浸泡一段时间。然后洗 掉非伤面菌液转到培养基上共培养（将接种农杆菌的外植体 置于诱导培养基上，此时农杆菌随外植体的细胞分裂而繁殖 并进行侵染，T-DNA转移整合，此过程叫共培养）。
植物中一般不存在质粒，为利用农杆菌的Ti质粒，发展了一 元载体系统和双元载体系统，避免了在大的Ti质粒上进行分 子重组操作的困难。
HE Wenxing
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9
用于植物基因转化的Ti质粒载体系统
一元载体系统/共整合载体系统 双元载体系统
HE Wenxing
c. Ti质粒过大，重组操作非常困难，也很难找到单一的 酶切位点。
植物基因工程共118页
36、自己的鞋子，自己知道紧在哪里。——西班牙
37、我们唯一不会改正的缺点是软弱。——拉罗什福科
xiexie! 38、我这个人走得很慢，但是我从不后退。——亚伯拉罕·林肯
39、勿问成功的秘诀为何，且尽全力做你应该做的事吧。——美华纳
40、学而不思则罔，思而不学则殆。——孔子
梦 境
植物基因工程
1、不要轻言放弃，否则对不起自己。
2、要冒一次险!整个生命就是一场冒险。走得最远的人，常是愿意 去做，并愿意去冒险的人。“稳妥”之船，从未能从岸边走远。-戴尔．卡耐基。
3、人生就像一杯没有加糖的咖啡，喝起来是苦涩的，回味起来却有 久久不会退去的余香。
4、守业的最好办法就是不断的发展。
5、当爱不能完美，我宁愿选择无悔，不管来生多么美丽，我不愿失 去今生对你的记忆，我不求天长地久的美景，我只要生生世世的轮 回里有你。
谢谢！
植物基因工程
转化体的鉴定
转基因植物的鉴定主要集中在DNA、RNA和目的蛋白三个层面上。 1.DNA水平
southern 杂交；斑点杂交（dot blotting）:是在southern 杂交基础上发展而来的
快速检测特异核酸的方法。其基本的原理是通过抽真空的方式将加在多孔过滤进样器 上的核酸样品直接转移到杂交膜上，然后再按southern 杂交法进行杂交；PCR。 2. RNA水平 Northern 杂交；RT-PCR（逆转录PCR）：先将mRNA转录成cDNA，再设计一对 引物扩增杂交分子。 3.蛋白质水平 western 杂交,elisa等。
• 后来的研究表明，在Ti质粒中，只有一小
Ti质粒的构成 Ti质粒的基因结构：T-DNA区、Vir区、 Onc区和Ori区共4个区段。 1 、Vir区(毒性区) 在Ti质粒T-DNA区的上游的一组基 因。表达产物激活T-DNA向植物细 胞转移，使植物引发肿瘤。 2、 Onc区 含有农杆菌之间接合转移有关的基
•构建植物基因Biblioteka 程载体 •将外源基因导入植物受体 •转基因植物的鉴定
1.目的基因的分离和克隆
已知基因的获得： • 化学合成法 • PCA显示差异技术筛选差异表达基因， • 差异蛋白谱表达技术筛选功能基因
2.构建植物基因工程的载体
导入体细胞，是否启动表达的一类特殊用途的基因。它应用不依赖于外界选 择压力的存在，这一点也是它与选择基因的区别之处。 理想报告基因的基本要求： 受体细胞不存在相应的内源等位基因的活性。 它的产物是唯一的，且不会损害受体细胞。 具有快速、廉价、灵敏、定量和可重复性的检测特性。
最常用的报告基因
ß -葡萄糖苷酸酶基因（gus）; 氯霉素乙酰转移酶基因； 荧光素酶基因; 分泌型碱性磷酸酶 ; 荧光蛋白家族
第八章 植物基因工程
图11-4 用二元载体系统将多聚半乳糖醛酸酶的反义 基因导入蕃茄细胞
第三节 植物外源基因的表达
一、植物表达病毒的外壳蛋白、核酶和反义 ＲＮＡ提高植物的抗病毒的能力。
二、植物表达微生物毒素提高对昆虫的抗性 三、物表达抗除草剂基因提高对除草剂 的
抗性 四、植物表达不同影响花的颜色、形态和生
长特性的基因产生新的花卉品种
复制的质粒克隆位点上。 • ２、将一中间穿梭质粒引入大肠杆菌细胞，通过在pBR322序列上编
码的氨苄青霉素抗性基因选择转化子。
• ３、然后通过大肠杆菌和土壤农癌杆菌的交配特此质粒转移到土壤农 癌杆菌细胞内。
• ４、两种质粒上的T-DNA序列发生同源重组，穿梭质粒（中间载体） 整合入整合质粒（pＧＶ３８５０）。这一过程使穿梭质粒全部融入 T-DNA的左右边界内。没有整合的质粒不会累积，因为它们不含土壤 农癌杆菌的复制起点。
1、培育抗病毒作物
• (1)、 外壳蛋白介导的抗性 • (2)、 反义RNA介导的抗性 • (3)、 利用缺损的复制酶 • (4)、 干扰运动蛋白 • (5)、 卫星RNA介导的抗性
• 烟草花叶病毒(TMV)是一种6．5kb大小的 RNA病毒。通过克隆病毒cDNA，发现该病 毒基因组编码4种多肽：两种复制酶亚单位， 一种外壳蛋白和一种与细胞间运动有关的
下来。
•
（３）、植物可产生大量的后代，稀有突变体和重组体就得以保
留。
•
（ment)，它们可用作
载体或作为插入诱变剂。
•
（５）、可利用植物的再生能力，可由单个细胞再生成一个完整
的植株。
• ２、缺点
• （１）、许多植物是多倍体，因而具有庞 大的基因组。
重要蛋白。转基因植物在土壤农癌杆菌基 因转移介质中将表达TMV的外壳蛋白 (CP)(图10—11)。
植物基因工程
主要的应用方向
? 1 植物抗虫基因工程 ? 苏云金芽孢杆菌 Bt晶体毒素蛋白基因 ? 2 抗病基因工程 ? 抗水稻白叶枯病、马铃薯软腐病、花生和番茄的青枯
病、大白菜软腐病 ? 3 植物抗逆基因工程 ? 将BADH基因导入水稻，获得的水稻有较高的耐盐性 ? 4 植物品质改良的基因工程 ? 将编码必需氨基酸的基因转入马铃薯，获得含高必需
? 4．非生物胁迫抗性基因
? 重金属抗性基因 、抗盐基因 、抗冻基因 、 抗氧化胁迫基因
? 5．产物质量修饰基因
? 2．报告基因
? 报告基因(reporter gene)，指其编码产物能 够被快速地测定、常用来判断外源基因是否 已经成功地导入寄主细胞(器官或组织)并检 测其表达活性的一类特殊用途的基因
? 荧光素酶(luciferase)基因 ? β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)基因 ? 绿色荧光蛋白质(green fluorescent protein)
氨基酸的马铃薯品系 ? 5 植物叶绿体基因工程 ? 将Bt基因导入烟草叶绿体中，植物杀虫效果显著 ? 6 植物生物反应器 ? 将乙型肝炎病毒表面抗原基因导入马铃薯和蕃茄，饲
喂小鼠试验检测到较高的保护性抗体 。
植物基因工程的主要内容
? 1、从种类繁多的植物基因群体中(总数可高 达5X106以上)分离出有用的目的基因； 2、寻找或构建能够承受人们感兴趣的外源 基因的插入和进行遗传转化等特性的克隆载 体； 3、将重组的载体通过体外转化等方法导入 植物受体细胞，并整合到寄主染色体的基因 组上； 4、使获得带有外源目的基因之重组载体 DNA的植物细胞或组织，再生成形态正常的 健康能育的植株； 5、在理想的情况下，使这些植物能够通过 有性过程，将外源目的基因持续地传递给后 代。
基因工程-第八章植物基因工程
第八章植物基因工程因原文件较大，特转换为灰色PDF格式，有需要PPT 格式的，请下载后索取。
QQ:312161752植物基因工程研究内容▪1、从植物群体中分离有用的目的基因▪2、寻找或构建能够承受人们感兴趣的外源基因的插入和进行遗传转化等特性的克隆载体▪3、将重组载体通过体外转化等方法导入植物受体细胞，并整合到寄主染色体上▪4、使有重组载体DNA的植物细胞或组织，再生形成形态正常的后代▪5 、理想的情况下，使这些植物能够通过有性过程，将外源目的基因持续的传给后代第一节高等植物的转化系统▪有三大类植物转基因方法：▪质粒整合▪病毒感染▪物理转移一、Ti质粒介导的整合转化系统土壤杆菌属和根瘤菌属的细菌，是同属于根瘤菌科的格兰氏阴性菌，在土壤中的含量极为丰富。
土壤杆菌区别于绝大多数其它细菌最主要的特征是，它们能够诱发植物产生肿瘤能够引发冠瘿的土壤杆菌分类为根瘤土壤杆菌，而能够诱发茎瘿的土壤杆菌分类为毛根土壤杆菌，它们是分布广泛的植物疾病“冠瘿病”、“毛根病”的病原菌，又称为毒性菌株。
▪病原土壤杆菌▪这些细菌所携带的特殊质粒，具有用作植物基因克隆载体的潜在可能性。
其中有两种土壤杆菌,即根瘤土壤农癌杆菌(Agrobacterium tumefaciens)发根土壤农癌杆菌(Agrobacterium rhizogenes)▪冠瘿瘤是由一种土壤农癌杆菌细菌在感染部位形成的植物肿瘤。
当受伤的植物被土壤农癌杆菌感染时，土壤农癌杆菌并不进入植物细胞，而是把一种环状染色体肿瘤诱导质粒(Ti)中的T-DNA片段转移入细胞。
▪来自天然Ti质粒的基因表达，其表达产物刺激细胞无休止分裂，由快速分裂的细胞形成的结构即为冠瘿瘤。
冠瘿瘤细胞可获得独立、非调节性生长特性。
培养时，这些细胞可在正常细胞无法生长的缺乏植物激素的培养基上生长。
T-DNA能够进行高频转移，而且这种转移常常是以未发生变化的完整形式整合到植物的核基因组上。
同时，Ti质粒几乎不存在包装的限制问题，大到50kb的外源DNA也能被顺利的包装和转移。
植物基因工程课件ppt
微管注射法
利用显微操作技术将外源 基因直接注入植物细胞， 实现基因转移。
基因表达与调控
启动子选择
选择合适的启动子，以调 控外源基因在植物中的表 达水平。
转录因子应用
利用转录因子调控植物基 因的表达，实现植物性状 的改进。
表观遗传修饰
通过DNA甲基化、组蛋白 修饰等手段，调控植物基 因的表达。
基因编辑技术
植物基因工程课件
汇报人： 202X-12-30
目录
• 植物基因工程简介 • 植物基因工程基本技术 • 植物基因工程应用 • 植物基因工程面临的挑战与前景 • 案例分析
01
植物基因工程简介
Chapter
定义与特点
定义
植物基因工程是利用重组DNA技术 对植物基因进行操作和修饰的一门科 学。
特点
具有高度精确性和可操作性，可以实 现植物性状的定向改进，提高抗逆性 、产量和品质等。
转基因玉米的研发与应用
总结词
转基因玉米是利用基因工程技术改进玉米性状，提高产量、抗逆性和品质的玉米新品种 。
详细描写
转基因玉米的研发主要针对抗虫、抗病、抗旱等性状进行改进。通过导入外源抗虫基因 和植酸酶基因等，转基因玉米表现出较好的抗虫性和产量。同时，转基因玉米还具有较 好的耐旱、耐盐碱等特性，能够适应不同环境条件下的生长。转基因玉米的应用提高了
安全性问题
对生态环境的影响
转基因植物可能成为入侵物种，破坏生态平衡。
对非目标生物的影响
转基因植物可能产生抗药性，影响农药效果。
食品安全问题
转基因食品的安全性尚未得到充分验证，可能对人体健康产生潜 伏风险。
法规与伦理问题
国际法规不统一
各国对转基因技术的法规和监管标准不统一，导致跨国合作困难。
植物基因工程ppt课件
1.5.1 Vir基因的诱导 1.5.2 VirA和VirG被构造性表达 1.5.3 T－DNA的加工及转移 1.5.4 T-DNA链整合植物基因组
片段，占Ti 的7-15％，两边有23bp的定向 反复序列。
章鱼碱型的T-DNA区分为两部分，左区 〔TL-DNA〕为13kb的单拷贝序列，是诱发 和维持肿瘤所必需的。右区〔TR-DNA〕为 7kb的多拷贝序列。
T-DNA通常较完好的且序列不改动地被 整合到植物基因组中。
1.3 T－DNA
1.3.2 T-DNA携带的遗传信息 〔1〕致瘤基因：用于转化植物细胞的基因，
1.2 Ti质粒
1.2.2 Ti质粒的物理图谱 物理图谱：限制性内切酶酶切片段在Ti-DNA
上的陈列顺序。
Ti物理图谱构建：经限制性内切酶处置之后 的Ti质粒DNA，用琼脂糖凝胶电泳作片段分 别，便可显示出有20多条大小不同的DNA 酶切片段。然后将这些酶切片段进展分子 杂交分析，测定顺序，再陈列成完好的物 理图。
1.1植物冠瘿瘤——植物的一种癌症
1.1冠瘿瘤
植物与人一样，可以产生各种各样的瘤和癌。其中一类瘤 被叫作瘿，瘿的种类很多。引起瘿的要素有：受伤、昆虫、 病毒、细菌和特定的基因组织表达等。人们最感兴趣的瘿 是冠瘿瘤。
1.1.1冠瘿瘤的原因 由根癌农杆菌〔Agrobacterium tumefaciens〕[属根瘤菌科〔Rhizobiaceat〕]对植物的侵 染而引起。
植物基因工程
1.根癌农杆菌与植物转化的分子生物学 2.植物基因工程中Ti载体及其构建 3.植物基因转化受体系统 4.根癌农杆菌转化程序 5.植物病毒介导的基因转化
1.根癌农杆菌与植物转化的分子生物学
1.1 植物冠瘿瘤－植物的一种癌症 1.2 Ti质粒 1.3 T－DNA 1.4 Vir区的基因构造与功能 1.5 农杆菌Ti质粒基因转化机理
片段，占Ti 的7-15％，两边有23bp的定向 反复序列。
章鱼碱型的T-DNA区分为两部分，左区 〔TL-DNA〕为13kb的单拷贝序列，是诱发 和维持肿瘤所必需的。右区〔TR-DNA〕为 7kb的多拷贝序列。
T-DNA通常较完好的且序列不改动地被 整合到植物基因组中。
1.3 T－DNA
1.3.2 T-DNA携带的遗传信息 〔1〕致瘤基因：用于转化植物细胞的基因，
1.2 Ti质粒
1.2.2 Ti质粒的物理图谱 物理图谱：限制性内切酶酶切片段在Ti-DNA
上的陈列顺序。
Ti物理图谱构建：经限制性内切酶处置之后 的Ti质粒DNA，用琼脂糖凝胶电泳作片段分 别，便可显示出有20多条大小不同的DNA 酶切片段。然后将这些酶切片段进展分子 杂交分析，测定顺序，再陈列成完好的物 理图。
1.1植物冠瘿瘤——植物的一种癌症
1.1冠瘿瘤
植物与人一样，可以产生各种各样的瘤和癌。其中一类瘤 被叫作瘿，瘿的种类很多。引起瘿的要素有：受伤、昆虫、 病毒、细菌和特定的基因组织表达等。人们最感兴趣的瘿 是冠瘿瘤。
1.1.1冠瘿瘤的原因 由根癌农杆菌〔Agrobacterium tumefaciens〕[属根瘤菌科〔Rhizobiaceat〕]对植物的侵 染而引起。
植物基因工程
1.根癌农杆菌与植物转化的分子生物学 2.植物基因工程中Ti载体及其构建 3.植物基因转化受体系统 4.根癌农杆菌转化程序 5.植物病毒介导的基因转化
1.根癌农杆菌与植物转化的分子生物学
1.1 植物冠瘿瘤－植物的一种癌症 1.2 Ti质粒 1.3 T－DNA 1.4 Vir区的基因构造与功能 1.5 农杆菌Ti质粒基因转化机理
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• （２）、组织培养的植物细胞由于多倍体 的原因可能会引起体细胞克隆变异 (somaclonal variation)现象。
• 二、 单个细胞可生长成完整植株
• 当植物受到机械损伤时，在损伤处将长出一片软 细胞称作愈伤组织(callus)。若将一片幼嫩的愈伤 组织取下并放置于含有适当营养成分和植物激素 的培养基中培养，细胞将继续生长和分化成为悬 浮培养物(悬浮在液体培养基中，含有单个细胞或 小细胞团的培养物)。这些细胞取出后置于平板上， 将形成新的愈伤组织。有时需要用其他细胞作为 保育培养(nurse culture)，相似于用作哺乳类细胞 培养中的细胞滋养层。然后愈伤组织会分化出根 和茎，最后生长成一个完整的开花植株。
•
图11-5 共整合载体克隆外源基因的过程
双元载体系统
• 两个分别含有T-DNA和Vir区的相容性突变T i质粒，即微型Ti质粒和辅助Ti质粒。
• 微型Ti质粒是含有T-DNA边界，缺失V ir基 因的Ti质粒，为一个广谱质粒，能够在大肠 杆菌和农杆菌中进行复制。还含有选择标 记基因。
• 辅助Ti质粒含有Vir区段，T-DNA缺失的突 变型质粒，完全丧失了致瘤功能。
第一节 再生植株
•
一、植物在遗传工程方面的优缺点
•
１、优点
•
（１）、拥有在分子水平上可加以利用的大量植物品种，这些
品种携带有遗传上各具特点的突变。
•
（２）、许多植物可自体受精，使其特别适合于遗传操作。当一
具有某一突变的植物杂合子自体受精时，谱系中就包含了野生型
植株、杂合型植株和含有突变的纯合型植株，这样突变就保留了
• 三、用叶盘再生植株
• １、叶盘在含有土壤农癌杆菌的培养基中短暂培 养后，叶盘边缘的细胞开始再生，这些细胞就充 分暴露在转染剂中(图10—2)。
• ２、将叶盘转移至含有刺激茎枝发育的营养培养 基中培养数日。
• ３、携带质粒的细胞通过刺激茎枝发育培养基中 的适宜抗生素如卡那霉素加以选择。
• ４、茎枝发育几周后，可移至含刺激根生长的培 养基中诱发根的形成。
• （３）、T-DNA从细菌细胞到植物细胞的转移类似于细菌 的接合过程，就像土壤农癌杆菌与植物细胞的交配。
• （４）、多拷贝T-DNA以单个随机位点整合入植物染色体。
• （三）、 T-DNA经过改造后作为基因载体 • 一种称作共整合(cointegration)的方法最初用来与土壤农癌杆菌系统
中的Ti质粒上的T-DNA一起进行基因转移(图10—5)。 • 1、把克隆的基因首先插入到含有T-DNA片段、且能够在大肠杆菌中
第八章 植物的基因工程
• 植物育种已成为应用遗传学的一个非常重要的分 支。传统的植物育种方法速度慢，且具不确定性。 要引入一个或一套所需基因，传统的方法需要两 系间的有性杂交，然后进行杂种后代与一亲本间 的重复回交，直到植物获得所需性状。
• 重组DNA技术的出现突破了上述限制。植物遗传 专家可将所需性状的基因(如抗虫害基因)克隆， 并将此类基因引入到有价值的植物品种当中。
复制的质粒克隆位点上。 • ２、将一中间穿梭质粒引入大肠杆菌细胞，通过在pBR322序列上编
码的氨苄青霉素抗性基因选择转化子。
• ３、然后通过大肠杆菌和土壤农癌杆菌的交配特此质粒转移到土壤农 癌杆菌细胞内。
• ４、两种质粒上的T-DNA序列发生同源重组，穿梭质粒（中间载体） 整合入整合质粒（pＧＶ３８５０）。这一过程使穿梭质粒全部融入 T-DNA的左右边界内。没有整合的质粒不会累积，因为它们不含土壤 农癌杆菌的复制起点。
• ２、Ｔ－ＤＮＡ整合进植物染色体的机制
• （１）、土壤农癌杆菌中的vir基因被植物细胞伤口产生 的化学物质所开启(图10—4)。
• （２）、Vir基因的活动，T-DNA因子脱离开质粒DNA。 T-DNA两侧是Ｔi质粒序列，各25如长。这些傍侧序列称 作边界(border)，它们参与T-DNA序列的切割。使T-DNA 以单股链形式脱离。
重要蛋白。转基因植物在土壤农癌杆菌基 因转移介质中将表达TMV的外壳蛋白 (CP)(图10—11)。
第二节 植物基因转移的途径
• 一、土壤农杆菌法 • 土壤农癌杆菌(Agrobacterium tumefaciens)
是一种革兰氏阴性菌，它的质粒转入植物 之后导致植物产生冠瘿瘤(crown gall)。这 个菌一般只侵染双子叶植物。
• （一）、土壤农杆菌的Ti质粒引起冠瘿瘤
• 冠瘿瘤是由一些土壤农癌杆菌细菌在感染 部位形成的植物肿瘤(图10－3)。
1、培育抗病毒作物
• (1)、 外壳蛋白介导的抗性 • (2)、 反义RNA介导的抗性 • (3)、 利用缺损的复制酶 • (4)、 干扰运动蛋白 • (5)、 卫星RNA介导的抗性
• 烟草花叶病毒(TMV)是一种6．5kb大小的 RNA病毒。通过克隆病毒cDNA，发现该病 毒基因组编码4种多肽：两种复制酶亚单位， 一种外壳蛋白和一种与细胞间运动有关的
图11-4 用二元载体系统将多聚半乳糖醛酸酶的反义 基因导入蕃茄细胞
第三节 植物外源基因的表达
一、植物表达病毒的外壳蛋白、核酶和反义 ＲＮＡ提高植物的抗病毒的能力。
二、植物表达微生物毒素提高对昆虫的抗性 三、物表达抗除草剂基因提高对除草剂 的
抗性 四、植物表达不同影响花的颜色、形态和生
长特性的基因产生新的花卉品种
下来。
•
（３）、植物可产生大量的后代，稀•
（４）、可用可移动因子(transporsable element)，它们可用作
载体或作为插入诱变剂。
•
（５）、可利用植物的再生能力，可由单个细胞再生成一个完整
的植株。
• ２、缺点
• （１）、许多植物是多倍体，因而具有庞 大的基因组。
• （二）、Ti质粒的T-DNA部分转移至植物
• １、3种成分与Ti质粒肿瘤诱导有关(图10—4)。
• （1）、T-DNA，它可转移至宿主细胞，是一种可 移动因子。
• （２）、vir基因(virulence的缩写)可产生转移活 动蛋白，它对增强植物细胞的转化是必须的。
• （３）、间接参与转化的基因，它们位于土壤农 癌杆菌染色体上，负责将细菌细胞接合于植物上。
• 二、 单个细胞可生长成完整植株
• 当植物受到机械损伤时，在损伤处将长出一片软 细胞称作愈伤组织(callus)。若将一片幼嫩的愈伤 组织取下并放置于含有适当营养成分和植物激素 的培养基中培养，细胞将继续生长和分化成为悬 浮培养物(悬浮在液体培养基中，含有单个细胞或 小细胞团的培养物)。这些细胞取出后置于平板上， 将形成新的愈伤组织。有时需要用其他细胞作为 保育培养(nurse culture)，相似于用作哺乳类细胞 培养中的细胞滋养层。然后愈伤组织会分化出根 和茎，最后生长成一个完整的开花植株。
•
图11-5 共整合载体克隆外源基因的过程
双元载体系统
• 两个分别含有T-DNA和Vir区的相容性突变T i质粒，即微型Ti质粒和辅助Ti质粒。
• 微型Ti质粒是含有T-DNA边界，缺失V ir基 因的Ti质粒，为一个广谱质粒，能够在大肠 杆菌和农杆菌中进行复制。还含有选择标 记基因。
• 辅助Ti质粒含有Vir区段，T-DNA缺失的突 变型质粒，完全丧失了致瘤功能。
第一节 再生植株
•
一、植物在遗传工程方面的优缺点
•
１、优点
•
（１）、拥有在分子水平上可加以利用的大量植物品种，这些
品种携带有遗传上各具特点的突变。
•
（２）、许多植物可自体受精，使其特别适合于遗传操作。当一
具有某一突变的植物杂合子自体受精时，谱系中就包含了野生型
植株、杂合型植株和含有突变的纯合型植株，这样突变就保留了
• 三、用叶盘再生植株
• １、叶盘在含有土壤农癌杆菌的培养基中短暂培 养后，叶盘边缘的细胞开始再生，这些细胞就充 分暴露在转染剂中(图10—2)。
• ２、将叶盘转移至含有刺激茎枝发育的营养培养 基中培养数日。
• ３、携带质粒的细胞通过刺激茎枝发育培养基中 的适宜抗生素如卡那霉素加以选择。
• ４、茎枝发育几周后，可移至含刺激根生长的培 养基中诱发根的形成。
• （３）、T-DNA从细菌细胞到植物细胞的转移类似于细菌 的接合过程，就像土壤农癌杆菌与植物细胞的交配。
• （４）、多拷贝T-DNA以单个随机位点整合入植物染色体。
• （三）、 T-DNA经过改造后作为基因载体 • 一种称作共整合(cointegration)的方法最初用来与土壤农癌杆菌系统
中的Ti质粒上的T-DNA一起进行基因转移(图10—5)。 • 1、把克隆的基因首先插入到含有T-DNA片段、且能够在大肠杆菌中
第八章 植物的基因工程
• 植物育种已成为应用遗传学的一个非常重要的分 支。传统的植物育种方法速度慢，且具不确定性。 要引入一个或一套所需基因，传统的方法需要两 系间的有性杂交，然后进行杂种后代与一亲本间 的重复回交，直到植物获得所需性状。
• 重组DNA技术的出现突破了上述限制。植物遗传 专家可将所需性状的基因(如抗虫害基因)克隆， 并将此类基因引入到有价值的植物品种当中。
复制的质粒克隆位点上。 • ２、将一中间穿梭质粒引入大肠杆菌细胞，通过在pBR322序列上编
码的氨苄青霉素抗性基因选择转化子。
• ３、然后通过大肠杆菌和土壤农癌杆菌的交配特此质粒转移到土壤农 癌杆菌细胞内。
• ４、两种质粒上的T-DNA序列发生同源重组，穿梭质粒（中间载体） 整合入整合质粒（pＧＶ３８５０）。这一过程使穿梭质粒全部融入 T-DNA的左右边界内。没有整合的质粒不会累积，因为它们不含土壤 农癌杆菌的复制起点。
• ２、Ｔ－ＤＮＡ整合进植物染色体的机制
• （１）、土壤农癌杆菌中的vir基因被植物细胞伤口产生 的化学物质所开启(图10—4)。
• （２）、Vir基因的活动，T-DNA因子脱离开质粒DNA。 T-DNA两侧是Ｔi质粒序列，各25如长。这些傍侧序列称 作边界(border)，它们参与T-DNA序列的切割。使T-DNA 以单股链形式脱离。
重要蛋白。转基因植物在土壤农癌杆菌基 因转移介质中将表达TMV的外壳蛋白 (CP)(图10—11)。
第二节 植物基因转移的途径
• 一、土壤农杆菌法 • 土壤农癌杆菌(Agrobacterium tumefaciens)
是一种革兰氏阴性菌，它的质粒转入植物 之后导致植物产生冠瘿瘤(crown gall)。这 个菌一般只侵染双子叶植物。
• （一）、土壤农杆菌的Ti质粒引起冠瘿瘤
• 冠瘿瘤是由一些土壤农癌杆菌细菌在感染 部位形成的植物肿瘤(图10－3)。
1、培育抗病毒作物
• (1)、 外壳蛋白介导的抗性 • (2)、 反义RNA介导的抗性 • (3)、 利用缺损的复制酶 • (4)、 干扰运动蛋白 • (5)、 卫星RNA介导的抗性
• 烟草花叶病毒(TMV)是一种6．5kb大小的 RNA病毒。通过克隆病毒cDNA，发现该病 毒基因组编码4种多肽：两种复制酶亚单位， 一种外壳蛋白和一种与细胞间运动有关的
图11-4 用二元载体系统将多聚半乳糖醛酸酶的反义 基因导入蕃茄细胞
第三节 植物外源基因的表达
一、植物表达病毒的外壳蛋白、核酶和反义 ＲＮＡ提高植物的抗病毒的能力。
二、植物表达微生物毒素提高对昆虫的抗性 三、物表达抗除草剂基因提高对除草剂 的
抗性 四、植物表达不同影响花的颜色、形态和生
长特性的基因产生新的花卉品种
下来。
•
（３）、植物可产生大量的后代，稀•
（４）、可用可移动因子(transporsable element)，它们可用作
载体或作为插入诱变剂。
•
（５）、可利用植物的再生能力，可由单个细胞再生成一个完整
的植株。
• ２、缺点
• （１）、许多植物是多倍体，因而具有庞 大的基因组。
• （二）、Ti质粒的T-DNA部分转移至植物
• １、3种成分与Ti质粒肿瘤诱导有关(图10—4)。
• （1）、T-DNA，它可转移至宿主细胞，是一种可 移动因子。
• （２）、vir基因(virulence的缩写)可产生转移活 动蛋白，它对增强植物细胞的转化是必须的。
• （３）、间接参与转化的基因，它们位于土壤农 癌杆菌染色体上，负责将细菌细胞接合于植物上。