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基因工程复习资料1.基因工程操作的主要对象是2.正丁醇在氯化铯－溴化乙锭连续梯度离心法纯化DNA中的作用3.溴化乙锭是很强的诱变剂，含溴化乙锭的废物可以如何处理后不再有危害性？4.通过凝胶电泳回收的DNA样品，因检测需要而含有的溴化乙锭对后续DNA操作有什么影响？5.在一个DNA分子中，若T所占的摩尔比是28.2%，则C所占的摩尔比为6.有氨基酸对应的密码子有几个？7.终止密码子有哪三个？8.起始密码子是9.高温导致DNA双链解链成单链从面引起变性的原因10.DNA变性的过程与特点？11.几种DNA分子的表示方法12.通常DNA右手双螺旋构象的表示是13.RNA和DNA在碱基组成上的区别14.乙醇在提取DNA过程中的作用？15.复性温度取决于什么条件？16.在何种情况下互补的两条DNA单链会结合成双链17.提取质粒DNA时为了使其与其它染色体DNA分开，细胞裂解液pH值应达到多少？18.碱性SDS法提取质粒DNA的原理与步骤19.碱法提取质粒DNA时，为了去除RNA常采用水解RNA的酶是20.提取大肠杆菌质粒DNA之前要培养菌体，在培养基中加入适量抗菌素的目的是什么？21.限制性内切酶作用的底物是什么？22.限制性核酸内切酶切割哪一类型DNA分子时效率最高23.限制酶的命名原则?24.影响限制性核酸内切酶的催化效率的因素有哪些？25.限制性核酸内切酶切割DNA后在其5’和3’端各自产生什么样的末端？26.大多数限制性核酸内切酶的最适反应温度是27.Ⅱ类限制性核酸内切酶的识别序列特点是什么？28.对一克隆的DNA片段做酶切图谱分析，需要用到哪种酶？29.已知某一内切酶在一个环状 DNA 上有 4个切点，当用此酶切割该环状 DNA ，可以得到的片段数是30.在对目的基因和载体DNA进行同聚物加尾时，需采用哪种酶？31.Pω0 DNA 聚合酶比Taq DNA聚合酶准确是因为它具有什么样的酶活性？32.内切酶产生星号活性的主要原因有哪些？33.限制性核酸内切酶是由细菌产生的. 其生理意义是什么？34.重组DNA技术中实现目的基因与载体DNA拼接的酶是35. E.coli DNA连接酶反应系统中必须的辅助因子是36. E.coli DNA连接酶可以连接哪两种DNA片段？37.T4-DNA 连接酶是通过形成磷酸二酯键将两段 DNA 片段连接在一起，其底物的关键基团是什么？38.TaqDNA聚合酶可以不需要模板，在双链DNA的末端加一个碱基，主要是加39.以mRNA为模板，催化cDNA合成的酶是40.cDNA第一链合成通常所需的引物是41. E.col i连接酶的功能?42.S1核酸酶的功能?43.碱性磷酸酯酶的作用是44.DNA片段5′端脱磷酸化的目的是什么？45.在PCR的引物中，引物的3′端不应有46.进行PCR设计引物时，引物的核苷酸序列必须与模板链的哪一段核苷酸序列互补？47.PCR的原理与反应过程48.PCR 提前进入平台期原因有哪些？49.PCR反应中的复性温度取决于哪些因素？50.如果要扩增10-20kb的DNA片段，需要使用什么类型的PCR？51.琼脂糖凝胶中琼脂糖的浓度取决于c Z′基因在克隆子筛选中的作用53.在显色互补筛选法中，阳性转化子的颜色是54.常用的报告基因有哪些？55.若某质粒带有 lacZ’标记基因，那么与之相匹配的筛选方法是在筛选培养基中加入56.TA质粒克隆载体可以用来直接克隆PCR产物的原理？57.各种克隆载体能克隆外源DNA片段的长度是多少？58.质粒概念及特点描述59.如果要将某植物抗病基因转入十字花科植物中，应选择哪种克隆载体60.质粒克隆载体有哪些？61.基因工程载体应具备哪些主要条件？62.基因治疗的临床实施中，一般多选用的基因载体是63.Cos位点是哪种克隆载体的序列64.λ噬菌体线性 DNA 分子的两端各有一个天然黏性末端，该末端包含的碱基数是65.酵母人工克隆载体是由哪几个部分组成的？66.应用于克隆和分离单链外源DNA片段的克隆载体是67.pUC18 与 pUC19 的区别是什么？68.串联启动子表达载体的目的是什么？69.穿梭克隆载体的组成与特点70.Ep克隆载体可以酵母作为宿主，这是因为它含有哪个质粒的复制起始位点？71.在构建cDNA基因文库时应选择哪种克隆载体？72.构建基因组文库时，第一步是对基因组DNA进行随机切割，其方法有哪些？73.质粒被选为基因运载体的理由有哪些？74.质粒克隆载体中MCS是指75.pBR322是一种改造型的质粒，含有两个抗性基因，其中四环素抗性基因来自哪种质粒？76.Pribnow框是指序列77.真核生物结构基因的组成？78.原核生物结构基因的组成？79.基因的化学合成步骤80.根据已知基因序列分离目的基因有哪些方法？81.首次完成了重组质粒DNA对大肠杆菌转化的科学家是82.重组DNA分子导入植物细胞的方法有哪些？83.mRNA分子在结构上的显著特征有哪些？84.核酸或蛋白质标记中常用的放射性标记有哪些？85.真核生物受体菌的细胞有哪些?86.转化大肠杆菌的方法有哪些？其中转化效率最高的是哪个？87.大肠杆菌作为受体菌的优缺点各有哪些？88.植物细胞作为受体细胞有哪些优点及缺点？89.酵母作为受体细胞有哪些优点及缺点？90.哪一种金属离子常用于诱导大肠杆菌感受态细胞91.提取大肠杆菌质粒DNA之前要培养菌体，在培养基中加入适量抗菌素的目的是什么？92.mRNA差别显示技术的技术特点及步骤93.在cDNA技术中，所形成的发夹环可用酶切除？94.cDNA-RDA的技术特点及步骤95.DNA接头在基因工程中的主要作用是96.启动子具有哪些特征97.Southern印迹杂交作用的对象是98.Northern印迹杂交作用的对象是99.1976年，美国联邦政府授权国立卫生研究院就制定了世界上第一个实验室基因工程法规是100.法国于1997年就明确要求从美国进口的农产品必须标示GMO或非GMO的区别，这里的GMO指的是101.有利于基因的蛋白质产物分泌的元件是102.融合蛋白的特性103.可用于蛋白质进一步分离纯化的方法有哪些？104.基因芯片中所采用样品的标记方法有哪些？105.基因芯片的应用范围106.原核生物基因SD区是指107.哺乳动物乳腺生物反应器的优缺点各有哪些？108.干扰素的主要生理作用表现有哪些？109.DNA达到50％变性的温度称为。
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基因工程复习资料（已修改）基因工程复习资料一、基因工程：概念：基因工程是指采用类似于工程设计的方法，根据人们事先设计的蓝图，人为地在体外将外源目的基因插入质粒、病毒或其他载体中，构成遗传物质的新组合即重组载体DNA分子，并将这种含有目的基因的重组载体分子转移到原先没有这类目的基因的受体细胞中去扩增和表达，从而使受体或受体细胞获得新的遗传特性，或形成新的基因产物。
基本流程：（1）目的基因的分离、获取与制备（2）目的基因与载体连接构建成为重组载体分子（3）重组DNA分子导入到受体细胞（4）外源目的基因阳性克隆的鉴定和筛选（5）外源目的基因的表达二、基因工程的发展简史1、基因工程诞生的背景：（1）发现了生物的遗传物质DNA而不是蛋白质。
（2）明确了DNA的双螺旋结构和半保留复制机制。
（3）遗传密码子的破译。
2、技术上的三大发明：（1）利用限制性核酸内切酶和DNA连接酶体外切割和连接DNA 片段。
（2）质粒改造成载体以携带DNA片段克隆。
（3）逆转录酶的使用打开真核生物基因工程的一条道路。
3、基因工程的诞生标志（P4）三、工具酶1、限制性核酸内切酶常见的类型：BamHⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ、HindⅡ、PstⅠ、SalⅠ、SamⅠ。
2、DNA连接酶常用的类型：大肠杆菌连接酶和T4噬菌体DNA连接酶。
3、DNA聚合酶类4、碱性磷酸酶5、末端脱氧核苷酸转移酶6、其他工具酶四、限制性核酸内切酶依来源分类1、同位酶：即识别相同的序列但切割位点不一样。
2、同尾酶：即识别位点不同但切出的DNA片段具有相同的末端序列。
3、同裂酶：即识别位点和切割位点均相同的酶。
五、影响限制性核酸内切酶酶切的反应条件1、温度：大部分限制性核酸内切酶最适反应温度为37°C，但也有例外，如SamⅠ的反应温度为25°C.降低最适反应温度，会导致只产生切口，而不是切断双链DNA。
2、盐离子浓度：不同的限制性核酸内切酶对盐离子强度有不同的要求，一般按离子浓度不同分为低（0mmol/L）、中（50mmol/L）、高盐（100mmol/L）三类。
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基因工程复习资料一．基因工程：在体外对不同生物的遗传物质进行剪切、重组、连接，然后插入到载体分子中（质粒、病毒、噬菌体DNA）插入微生物、植物、动物细胞内进行无性繁殖、并表达出基因产物。
二．一）1.同裂酶：识别位点的序列相同的限制性内切酶。
同裂酶的类型：1)同序同切酶：识别位点和切点完全相同。
如Hind Ⅲ和Hsu I。
2)同序异切酶：识别位点相同，但切点不同。
如Kpn I 和Acc65 I。
3)同功多位酶：许多识别简并序列的限制酶包含了另一种限制酶的功能。
4）其他：有些限制酶识别的序列交叉。
2 同尾酶：识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。
如BamH I、Bgl Ⅱ、Bcl I、Xho Ⅱ等。
同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能再被原来的酶识别。
3. 限制性内切酶的命名：1）用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名。
2. ）用一个右下标的大写字母表示菌株或型。
如Ecok, EcoR（现在都写成平行，如EcoRI）。
3）如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制与修复系统，用罗马字母表示。
如EcoR I。
EcoR I: E, 属名的第一个字母; co种名的头两个字母;R, 菌株或型号; I,序号；Eco为斜体，R为正体。
4.限制性内切酶产生的末端：1）产生匹配黏端：即黏性末端，识别位点为回文对称结构的序列经限制性内切酶切割后产生的末端。
2）产生平末端：回文对称轴上同时切割DNA的两条链。
3）产生非对称突出末端：识别序列为非对称序列时，切割的DNA产物末端是不同的。
5、常用的DNA聚合酶的：1.）共同特点：把dNTPs连续地加到引物的3‟—OH端。
2. ）主要区别：（1）持续合成能力和外切酶活性不同。
（2）T7 DNA聚合酶可以连续添加数千个dNTPs而不从模板上掉下来。
（3）其它几种DNA聚合酶只能连续添加10多个dNTPs就会从模板上解离下来。
5、星星活性：在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称为星星活性。
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第一章绪论1 •基因工程的定义：在体外对不同生物的遗传物质（基因）进行剪切、重组、连接，然后插入到载体分子中（细菌质粒、病毒或噬菌体DNA）,转入微生物、植物或动物细胞内进行无性繁殖，并表达出基因产物。
2•基因工程理论上的三大发现和技术上的三大发现3 •基因工程的基本步骤（1）目的基因的获取：从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片断。
（2）重组体的制备：将冃的基因的DNA片断插入到能自我复制并带有选择性标记（抗菌素抗性）的载体分子上。
（3）重组体的转化：将重组体（载体）转入适当的受体细胞川。
（4）克隆鉴定：挑选转化成功的细胞克隆（含有目的基因）。
（5）目的基因表达：使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物。
4 •基因工程的意义（1）基因工程在农业生产中的应用：提高植物的光合作用率；提高豆科植物的固氮效率；转基因植物；转基因动物。
（2）基因工程在工业中的应用：1）纤维素的开发利用：克隆各种参与纤维素降解的酶的基因，导入酿酒酵母，就可能利用廉价的纤维素來生产葡萄糖，发酵成酒。
2）酿酒工业：用外源基因改造酿酒酵母，产生优质的啤酒。
或用酿酒酵母生产蛋白质等。
（3）基因工程在医药上的应用：用微生物生产药物；用转基因植物或动物生产药物；设计高效高特异性的生物制剂-疫苗；制造新型疫苗；基因诊断；法医鉴定；基因治疗。
（4）基因工程在环境保护中的作用：1）检测水污染：用重组细菌或转基因鱼等检测水污染2）生物降解：用带有重组质粒的“超级菌〃分解油（烷怪类）、有机农药污染。
（5）基因工程商业化的发展第二章基因工程主要技术原理1. 质粒和基因组DNA的提取方法与纯化步骤，主要试剂是什么质粒的提取和纯化方法最常用的为碱抽提法：原理：闭合环状的质粒DNA,在变性后不会分离，复性快。
染色体线性DNA和或有缺口的质粒DNA变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质-SDS复合物结合在一起, 在离心的时候沉淀下去。
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第一章一．名词解释1、基因工程：按工程学原理，将外源基因切割，及载体结合，导入受体细胞，使其稳定表达的过程。
2、目的基因：开发人们特殊需要的基因产物或及优良性状相关的基因。
3、工具酶：体外进行合成、切割、连接、修饰等过程需要的酶。
4、药物：在受体细胞内表达产物有药理作用或通过定位整合直接抑制致病基因的。
二．基因工程理论依据（1）基因具有相同的物质基础（2）基因可以切割（3）基因可以转移（4）基因及多肽有对应关系（5）基因的密码是通用的（6）基因可以通过复制遗传给下一代三．基因工程研究内容（1）克隆载体的研究（2）受体的研究（3）工具酶的研究（4）目的基因的研究（5）新技术的研究第二章一．名词解释1、变性：在较高温下，双链间氢键断开，形成单链的过程。
2、复性：变性的，降温时恢复为双链的过程。
3、解链温度：让达到50%变性的温度。
4、复制子：从复制起点开始复制出一个分子或片段的核苷酸序列。
5、启动子：不转录，是聚合酶的识别结合位点。
6、转录区：能转录相应，包括编码区和终止子。
7、操纵子：原核生物中两个以上基共用一个启动子。
8、内含子：真核生物转录区中的非编码间隔序列。
9、限制性核酸内切酶：使一个磷酸二酯键断开的脱氧核糖核酸酶。
10、稀切酶：有较长的识别序列和富含或的识别序列的限制性核酸内切酶。
11、同裂酶：不同的酶有相同的识别序列。
12、同尾酶：切割不同识别序列产生相同末端的不同酶。
13、黏性末端：两条链断开位置是交错的，叫黏性末端。
14、平末端：两条链断开位置是平齐的，叫平末端。
15、位点偏爱：某些限制酶对同一介质中的有些位点表现出偏爱性切割，即对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率的现象称作位点偏爱。
16、酶活单位：限制酶最适条件下60分钟切割1所需的酶活性。
17、容积活性：1酶活单位所具有的酶活性。
18、限制酶的活性：一些特定条件下，可以切断及原来识别序列不同的碱基序列，这个现象叫活性。
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一、名词解释1、基因工程工具酶基因工程的操作，是分子水平的操作，它涉及到一系列相互关连的酶促反应，要靠一些重要酶类作工具，对基因进行人工切割和拼接，故称为“工具酶”。
2、限制作用是指宿主细菌可以通过自身限制酶的作用，破坏入侵的外源DNA(如噬菌体DNA等)，使得外源DNA对生物细胞的入侵受到限制，而保护了宿主菌。
3、修饰作用而生物细胞(如宿主)的DNA分子合成后，通过自身修饰酶的作用，使特定位置上的碱基发生甲基化而得到了修饰，可免遭自身限制性酶的破坏4、限制性核酸内切是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶5、3′粘性末端粘性末端是指DNA分子在限制酶的作用下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构（若是-3），它们能够通过互补碱基间的配对而重新连结起来。
6、平端切割频率是指某限制性核酸内切酶在DNA分子中预期的切割概率。
7、同裂酶来源不同的限制酶识别序列相同，产生同样的切割，形成同样的末端8、同尾酶来源不同，识别的靶序列也各不相同,但都能产生相同的粘性末端10、DNA分子的限制性图谱（限制性酶的识别序列位点）根据用一种或多种限制酶酶切的结果，可以在DNA分子上标识出各种酶切识别序列位点，这种限制性酶切位点的分布图谱11、DNA连接酶能够催化在2条DNA链之间形成磷酸二酯键的酶12、Taq DNA聚合酶（耐热DNA聚合酶）用于DNA的体外扩增，经25次循环后进入酶的反应稳定期，最适反应温度75摄氏度，对95 摄氏度具有良好稳定性，这个酶只有5′→3′DNA聚合酶活性和5′→3′的外切酶活性，缺少3′→5′的外切酶活性。
13、RNase H （核糖核酸酶H）一种核糖核酸内切酶，可以特异性地水解DNA-RNA杂合链中的RNA。
RNase H不能水解单链或双链DNA 或RNA中的磷酸二酯键，即不能消化单链或双链DNA或RNA。
14、F因子雄性致育因子，所以F+细胞又叫雄性细胞，与此相应的F—细胞则叫做雌性细胞。
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基因工程复习资料第一章核酸的制备1.主要步骤：分、切、接、转、筛、表2.基因工程的概念：基因工程又称基因堆叠技术和dna重组技术，就是以分子遗传学为理论基为础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种dna分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。
第二章基因工程工具酶1.生物催化剂：核酶、抗体酶、模拟酶。
2.限制性内切核酸酶：定义：限制性内乌核酸酶就是一类能够辨识双链dna中特定核苷酸序列（辨识序列），并在识别序列上使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。
命名：限制性内乌核酸酶通常就是以第一次抽取至这类酶的生物的种名的第一个字母和种名的第一、第二个字母命名的，有的在后面还加菌株（型）代号中的一个字母。
如果从同一种生物中先后提取到多种限制性内切核酸酶，则依次用罗马数字ⅰ、ⅱ、ⅲ表示。
并且名称的前三个字母须用斜体，第一个字母用大写。
3.dna连接酶：定义：dna连接酶也称dna黏合酶，在分子生物学中扮演一个既特殊又关键的角色，那就是连接dna链3‘-oh末端和，另一dna链的5’-p末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的dna链连成完整的链的一种酶。
种类：大肠杆菌dna连接酶、t4dna连接酶、tscdna连接酶、真核生物细胞辨认出的连接酶，例如酶ⅰ、酶ⅱ、酶ⅲ等多种类型。
4.dna片段的相连接方法：①具互补黏性末端dna片段之间的连接：可用e?colidna连接酶，也可用t4dna连接酶。
②尼奥罗末端dna片段之间的相连接：就可以用t4dna连接酶，并且必须减少酶的用量。
③dna片段末端修饰后进行连接：dna片段末端同聚物加尾后进行连接，可按互补粘性末端片段之间的连接方法进行连接；粘性末端修饰成平末端后进行连接；dna片段5′端脱磷酸化后进行连接；dna片段加连杆或衔接头后连接。
5.dna聚合酶：①定义：dna聚合酶就是指用dna单链为模板，以4种脱氧核苷酸为底物，催化剂制备一条与模板链序列优势互补的dna新链的酶。
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1、基因工程（genetic engineering）：就是在分子水平上，提取（或合成）不同生物的遗传物质（基因），在体外切割，再和一定的载体拼接重组，然后把重组的DNA 分子引入细胞或生物体内，使这种外源DNA（基因）在受体细胞中进行复制与表达，按人们的需要繁殖扩增基因或生产不同的产物或定向地创造生物的新性状，并能稳定地遗传给下代。
2、基本技术路线：分（离目的基因）切（割目的基因和载体）接（连目的基因和载体）转（入宿主细胞）筛（选阳性克隆）表（达目的基因）3、基因工程的基本要素：目的基因、克隆载体、工具酶、受体细胞4、载体(vector)：基因工程中，携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。
5、作为克隆载体必须具备的条件：至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物体中自主复制。
应有一个或几个限制性内切酶的单一识别位点，以供外源DNA的插入。
应有一个或多个利于检测的遗传表型，易于识别和筛选。
如抗药性、显色表型等，以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞。
适当的拷贝数。
6、载体的分类：按载体的来源分：质粒载体、噬菌体载体、粘粒载体、植物病毒载体、动物病毒载体、人工染色体等。
按用途分：克隆载体（clone vector）：主要用于扩增或保存DNA 片段，是最简单的载体，其上有复制子即可。
表达载体（expression vector）：用于一个基因的蛋白表达，是在常规载体的基础上衍生而来，这类载体既有复制子，更要有强启动子。
穿梭载体（shottle vector）：含有两个不同的复制子，能在两类不同的受体细胞中复制。
7、质粒载体的生物学特性：独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的双链共价闭合的环状DNA分子，依赖宿主细胞的存在。
8、pBR322的优点：1、具有较小的分子量，4363bp 。
2、具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号：Tetr Ampr 插入失活效应3、具有较高的拷贝数。
9、pBR322质粒的结构来源：来自pSCl01 的四环素抗性基因Tetr ；来自ColEl 的衍生物pMBl 的松弛复制起点ori ；来自pSF2124的氨苄青霉素抗性基因Ampr。
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细菌的限制—修饰作用
核酸限制性内切酶的类型及主要特性
一个单位的限制性核酸内切酶定义为：在合适的温度和缓冲液中，在50uL反应体系中，1h完全降解1ug底物DNA所需要的酶量。
星号（*）活性：如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，内切酶出现切割与识别位点相似但不完全相同的序列，这一现象称为星号（*）活性。
同位酶：识别位点相同，但切点不同。
同裂酶：识别位点和切点均相同，但来源不同。
同尾酶：识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端
两种DNA连接酶
（1）大肠杆菌DNA连接酶：只能连接粘性末端。
分子质量为68ku
（2）T4噬菌体DNA连接酶：不但能连接粘性末端，还能连接平齐末端。
分子质量为75ku
p35页表2-4
简述DNA连接酶的作用机制及其特点
说明使用切口位移法进行DNA标记的原理及其步骤
基因工程载体根据来源和性质不同可分为质粒载体，噬菌体载体，黏粒载体，噬菌粒载体，病毒载体，人工染色体等
质粒的概念：质粒（plasmid)是一种存在于细菌或真菌染色体外的小型环状（线型质粒DNA
分子—眼虫、衣藻等）双链DNA 分子（酵母的“杀伤质粒”是RNA），可自身复制和表达。
共价闭合环状DNA（SC构型）开环DNA（ oc构型）线形DNA （L构型）同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同：
SC DNA最快、L DNA次之、OC DNA最慢。
理想质粒载体的必备条件：
A、具有较小的分子质量和较高的拷贝数
B、具有若干限制性核酸内切酶的单一酶切位点（多克隆位点）
C、具有两种以上的选择标记基因
D、缺失mob基因（载体的安全性：质粒不能随便转移、条件致死突变）
E、插入外源基因的重组质粒较易导入宿主细胞并复制和表达（复制起点）、较小的宿主范围
蓝白班筛选原理
穿梭质粒载体(shuttle vector) ：由人工构建的具有两种不同复制子起点和选择性标记基因
黏粒载体也称柯斯质粒载体：它是一类含有λ噬菌体的cos序列的质粒载体
噬菌体载体的优越性p69
黏粒载体的基本特点 (P70)
具有λ噬菌体的特性(体外包装，高效感染等)；
具有质粒载体的特性(易于克隆操作、选择及高拷贝等)；
具有较高容量（35kb-45 kb）的克隆能力；
具有与同源性序列的质粒进行重组的能力。
表达载体构建的一般原则
1. 阅读框架与外源基因高效表达
2. 启动子与外源基因高效表达
3. 转录的有效延伸和终止与外源基因高效表达
4. 有效的翻译起始与外源基因高效表达
5. 终止密码子选择与外源基因高效表达
6. 外源蛋白的稳定性与外源基因高效表达
报告基因：用于检测与其组装在一起的嵌合基因在导入细胞后是否表达的一种指示基因
探针：指经放射性或放射性物质标记的已知或特定的DNA或RNA序列
p115第八题
PCR引物设计的一般原则：
①引物长度一般在15~30碱基之间，Tm接近72℃较佳。
②碱基要随机分布，避免出现一连串的单一碱基或产生二级结构。
③ G+C含量在45%~55%之间。
④两个引物在3′端均必须与模板互补， 5′端可以不互补。
⑤引物自身不能有连续4个碱基的互补，以免形成发夹结构。
⑥引物之间不能有连续4个碱基的互补，以免形成引物二聚体。
⑦引物末位最好选A/G/C，不要选T，引物3′端要避开密码子的第3位。
反转录PCR（RT-PCR)：利用反转录酶，把RNA反转录成cDNA，再以cDNA 为模板进行PCR扩增。
快速扩增cDNA末端技术：PCR用于扩增代表mRNA转录物某单一位点与其3’或5’末端之间区域的部分cDNA称为快速扩增cDNA末端技术
基因文库：用分子克隆方法将某种生物或其组织的所有DNA片段插入适当的载体，转化适当宿主菌后，进行保存的克隆集合。
p141
cDNA文库的构建：以mRNA为模板，将体外反转录的cDNA、与适当的载体连接后转化受体菌，这种包括特定组织细胞所有mRNA信息的cDNA克隆的集合称为该组织细胞的cDNA文库
cDNA第二链的合成（作业p154）
化学合成DNA方法有：磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、自动化合成法固相合成
从基因文库中获取目的基因的方法有核酸杂交法差示杂交法 PCR筛选法表达文库的免疫学筛选
染色体步移的基本过程
1) 用遗传作图将目标基因定位在染色体的特定位置;
2) 找到与目标基因紧密连锁的分子标记;
3)构建含有大插入片段的基因组文库(ＢＡＣ库或ＹＡＣ);
4)以与目标基因连锁的分子标记为探针筛选基因组文库;
5)用获得阳性克隆构建目的基因区域的跨叠群;
6)通过染色体步行获得含有目标基因的大片段克隆;
7)通过亚克隆获得含有目的基因的小片段克隆;
同聚物加尾法：DNA末端转移酶能在没有模板的情况下给DNA的3’-OH端加上脱氧核苷酸。
人工接头连接法p168
外源DNA片段与载体DNA的重组主要有哪几种方法？各有何优缺点？（一）黏性末端连接法
（二）平头末端连接法：①同聚物加尾连接；
②人工接头连接等。
黏性末端连接法优点：黏性末端连接可抑制载体和目的DNA分子的自连，因而可大大提高连接的效率。
更重要是不同限制性酶切位点的黏性末端连接可以控制目的DNA和载体DNA的连接方向。
缺点：载体易自身环化；不易定向克隆；产生串联重组体；难以插入特定的基因；大片段DAN的重组率低
DNA接头（adapter）连接法优点：连上后就能用。
缺点：接头与接头以粘末端连接，形成二(多)聚体，影响与DNA片段的连接同聚物加尾法优点：能把任何片段连接起来
缺点：操作繁琐；外源片段难以回收；同聚物尾巴影响外源基因表达。
转化子：就是导入外源DNA后或得了新的遗传标志的细菌细胞或其他受体细胞。