解及其降解性质粒的研究
持久性有机污染物微生物降解研究进展
第 ２ 卷 第 ３期 １ ２０ ０ ７年 ６月
江 苏 科 技 大 学 学 报（ 自然科学版 ）
Ｊｕｎ ｌ ｆ ｉｎ ｓ ｎ ｅｓ ｙｏ ｃ ｎ ｅａ ｄ Ｔ ｃ ｎ ｌ ｙ Ｎ ｔｒｌ ｃ ｎ ｅ Ｅ ｉ ｏ ） ｏ ｒａ ｏ ａ ｇｕ Ｕ ｉ ｒｉ ｆ ｉ ｃ ｎ ｅｈ ｏ ｇ （ ａｕａ Ｓ ｉ ｃ ｄｔ ｎ Ｊ ｖ ｔ Ｓ ｅ ｏ ｅ ｉ
ｂ ｓ ｄ ｏ ｈ ｅ ｒ ｄ ｔ ｎ ｂｙ ｍ ｃ ｏ ｅ ｄ ｔ ｅ ＰＯＰｓｃ ｎ ｒ ｌｂ ｌ ｍｉ ｒ ｘ ｌｉ ｅ ． ａ ｅ ｎ ｔ ｅ ｄ ｇ ａ ａ ｉ ｒ ｂ ｓａ ｈ ｏ ｉ ｎ ｏ ｔｏ ｙ ｐ ａ ｄ ａ ｅ ｅ ｐ ａｎ ｄ ｓ
Ｋ ｙｗ ｒ ｓ ｐ ｒ ｓ ｎ ｏｇｎｃｐ ｌ ｔ ｔ ｅ ａａｉ ｙｏｇｎｓ ｂｏｎ ｎｅｉｇ ｐａｍ ｄ ｅ ｏｄ ： ｅ ｉｅ ｔ ｒａｉ ｏｌ ａ ；ｄｇ ｄ ｔ ｎｂ ｒａ ｉ ｓｔ ｕ ｎ ｒ ｏ ｍ； ｉ ｇ ｅｒ ； ｌ ｉ ｅｉ ｎ ｓ
０ 引 言
随着工农业 生产的发展 ， 久性有机 物对环 境 的污染 及 带来 的危 害越来 越 引起 人们 的关 注 。现代工 持
ｍ ｃ ａｉ ｅｖｅ ｐ ｉｔ ｆ ｉ ｎ ｎ ｅ ｎ ．Ｔ ｅａ ｖｎ ｇｓａｄ ｔ ｅｅ ｐ ｅ ｔ ｅｄ ｎｙｏ ｅｔ ｈ ｉｕ ｅｈ ｓ ｉ ｔ ｉ ｏｎ ｏ ｏ ｇ ｅｒ ｇ ｈ ｄａ ｔ ｅ ｎ ｅｄ ｖｌ ｍ ｎ ｔ ｅ ｃ ｆ ｈ ｅ ｎｑ ｅ ｎ ｍ ｎｈ ｗ ｂ ｅｉ ｉ ａ ｈ ｏ ｎ ｔ ｃ
Ｖｏ ． Ｎｏ ３ １ ２１ ．
Ｊｎ ０ ７ ｕ ．２ ０
文 章 编 号 ： ６ ３— ８７ ２０ ）３—０７ Ｏ １７ ４ ０ （０ ７ Ｏ ０ ３一 ６
难降解有机物质的生物降解技术分析
技术应用与研究2018·0149Chenmical Intermediate当代化工研究难降解有机物质的生物降解技术分析＊丁智晖 董子萱 于水利（同济大学 上海 200092）摘要：广泛存在于人们生产生活中的难降解化学物质，一方面为人们的物质生活提供方便，另一方面因难降解的特性长期滞留于人们的生活空间，因致癌、致畸、致突变的特性给人类健康带来了潜在危险。
为了减轻难降解有机物质对生态环境的影响与危害，国内外对难降解有机物的处理方法进行了大量研究，目前，主要方法包括生物法、物化法、化学氧化法等。
本文将根据国内外生物处理难降解有机物的进展作一简要介绍。
关键词：生物降解；难降解有机物；技术进展中图分类号：Q 文献标识码：AThe analysis of Biodegradation Technology in the field of Refractory organic mattersDing Zhihui, Dong Zixuan, Yu Shuili（Tongji University, Shanghai, 200092）Abstract：The refractory chemicals Widely existing in people's production life not only provide convenience for people,but also pose a potential danger to human health due to their carcinogenic, teratogenic, mutagenic properties and long-retention. In order to reduce the influence and harm by refractory organic matters to the environment, a large number of studies have been done on the treatment of refractory organic matters both at home and abroad, mainly including biological method, physicochemical method, chemical oxidation method and so on. In this paper, the research progress of biodegradation methods at home and abroad will be introduced briefly.Key words：biodegradation；refractory organic matters；technical progress1.前言进入工业时代以来，每年都有新型化学物质问世。
碱裂解法提取质粒DNA的研究
碱裂解法提取质粒DNA的研究碱裂解法是一种常用的提取质粒DNA的方法。
该方法通过将大肠杆菌等细菌细胞进行碱性处理，使其细胞壁溶解，并释放出质粒DNA。
以下是对碱裂解法提取质粒DNA的研究进行详细介绍。
首先，进行实验前的准备工作。
实验材料包括大肠杆菌含质粒的培养液，碱性裂解液，中和液，以及一些常规实验室工具。
准备条件优化的培养基，如Luria-Bertani培养基，以获得高质量的质粒DNA。
将培养的大肠杆菌细胞进行离心，取得细菌细胞的沉淀，并将其重悬于适量的碱性裂解液中。
碱性裂解液的配制对提取质粒DNA的质量具有重要影响。
通常，碱性裂解液包括Tris-HCl缓冲液（pH 8.0-8.5）、EDTA （0.1M，pH 8.0）以及SDS（0.5%-1.0%）。
在碱性裂解液中，细胞壁受到破坏，并且其中的DNA被释放出来。
为了进一步提取质粒DNA，需要添加RNase A（最终浓度为20μg/mL）来降解细胞中的RNA。
此外，可以根据需要添加蛋白酶K（最终浓度为100μg/mL）来去除大部分的蛋白质。
接下来，使用酒精沉淀法来纯化质粒DNA。
首先，加入等体积的冰冷异丙醇，使DNA和异丙醇充分混合，然后进行离心。
在高速离心后，离心管底部会形成一个白色的DNA沉淀。
利用移液枪将上层液体倒掉，然后用70%的乙醇洗涤DNA沉淀，移液枪将乙醇沉淀洗涤掉。
最后，利用离心机将样品离心至全速，将乙醇溶液除去，并风干沉淀。
最后，使用合适的缓冲液溶解DNA，以达到所需的浓度。
为了确定提取的质粒DNA的纯度和浓度，可以使用紫外光谱仪来测定其260nm和280nm的吸光度比值。
这个比值可用于评估质粒DNA中的蛋白质污染情况。
如果蛋白质污染特别严重，可以使用氯仿、酒精沉淀等方法进行进一步清除。
此外，还可以使用琼脂糖凝胶电泳来检测提取的质粒DNA的大小和完整性。
通过比较不同样品的DNA迁移位置，可以快速确定质粒DNA的大小。
总结：碱裂解法是一种非常常用且简单的提取质粒DNA的方法。
质粒的研究进展概况综述
质粒的研究进展概况综述前言：质粒(plasmid)为细菌胞浆中独立于染色体外的遗传单位，它能自主复制。
质粒以环状双链DNA形式存在，分子链末端以共价键与各自的另一粘末端相结合，呈闭合环或共价闭合环(covaiently closed circle，ccc)，如果在提取过程中受损，部分质粒的ccc可转变为开环(open circle，oc)，或线形(L)结构。
在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。
摘要：本文对国内外报道的霍乱弧菌中的质粒、降解质粒、稀有放线菌质粒及目前对于线性质粒的研究进展进行综合叙述。
通过对于这些特殊质粒的研究进展分析，从中得到重要信息以运用于基因工程技术和分子生物学技术及发酵生产和环境工程，而造福全人类。
一、霍乱弧菌中质粒生物学特性研究霍乱弧菌中质粒的生物学特性质粒DNA只占正常细菌DNA的5%以下，在一般情况下，对宿主细菌的生存不是必需的。
但质粒含有某些基因,可以补充细菌基因的不足，有利于细菌的生长。
质粒可以编码很多重要的生物学性状，编码有性生殖的质粒称致育质粒或F质粒，编码细菌毒力的质粒称毒力质粒或Vi质粒，细菌对抗生素或重金属盐类的耐药性由R 质粒编码，一种质粒还可以同时决定几种功能。
霍乱弧菌中的质粒一般具有以下几方面的功能。
1、耐药性大多数研究证明，霍乱弧菌中的质粒与菌株的耐药性存在一定的联系。
由于菌株分离的地区和年代不同，耐药谱可有一些差异,但经结合转移试验表明，相当一部分菌株的耐药性是由质粒介导的。
霍乱弧菌的质粒有大有小，一般来说，耐药性往往与较大分子量的质粒有关，并且往往决定一种以上的抗性。
2、致病性霍乱弧菌的致病因素包括毒素和定居因子。
毒素包括霍乱肠毒素(CT)、zot、ace、溶血素以及志贺样毒素等；定居因子包括脂多糖、毒素协同调节菌毛(TcpA)、血凝素等。
人们在研究霍乱弧菌中质粒的同时，也考虑到了质粒与菌株致病性的关系。
3、小结质粒作为染色体外的一种遗传因子，普遍存在于真核和原核生物细胞中，为微生物的感染致病和防治增添了分子生物学的理论基础。
鞘氨醇单胞菌在生物降解方面的研究进展
鞘氨醇单胞菌在生物降解方面的研究进展台喜生; 冯佳丽; 李梅; 李师翁【期刊名称】《《湖南农业科学》》【年(卷),期】2011(000)007【总页数】5页(P21-25)【关键词】鞘氨醇单胞菌; 生物降解; 环境污染物【作者】台喜生; 冯佳丽; 李梅; 李师翁【作者单位】兰州交通大学化学与生物工程学院甘肃兰州 730070【正文语种】中文【中图分类】Q939.1鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas sp.）[1]属于变形菌门（Proteobacteria）的α-4-亚门，细胞膜组成中含有鞘糖脂，是典型的好氧，化能自养，革兰氏阴性，杆状，通常菌落呈黄色的细菌。
鞘氨醇单胞菌广泛分布于水生和陆生环境中。
鞘氨醇单胞菌属的很多种可以降解多种化合物，如联苯（含取代基的）萘、芴（含取代基的）菲、芘（含氯的）联苯醚（含氯的）呋喃、咔唑、聚乙二醇、氯化酚和多种除草剂以及杀虫剂，在环境微生物学领域受到越来越多的关注。
1 鞘氨醇单胞菌生物降解的研究现状1.1 特殊的代谢机制鞘氨醇单胞菌属的不同种具有不同的代谢机制，因此可以降解多种有机化合物，证明该属细菌可以比其他细菌属的细菌更快更有效地适应新化合物污染的环境。
这种降解能力与通常的矿化降解机制不同。
对（含取代基的）萘或联苯降解途径的生理和酶学研究表明，鞘氨醇单胞菌与其他降解细菌并不存在显著性差异。
但是对于降解2，4-D或联苯的编码基因的研究表明，鞘氨醇单胞菌属细菌和其他变形菌门细菌只存在低水平的序列相似性。
这说明在降解机制的进化过程中，鞘氨醇单胞菌与其他变形菌门细菌之间出现差异。
鞘氨醇单胞菌与其他革兰氏阴性菌的主要区别是，通常可以在鞘氨醇单胞菌中发现不同寻常的降解基因的组成。
之前关于假单胞菌的研究表明，编码降解酶的基因一般位于相同的操纵子中，并且被协同调控，这种基因调控的经典例子是降解氯化邻苯二酚的TOL或NAH质粒编码的是间位裂解途径，而其他质粒编码的是改进的邻位裂解途径，或者是染色体编码的β-氧化己二酸途径。
cas9质粒基因编辑 降解
cas9质粒基因编辑降解CRISPR-Cas9基因编辑技术是一种快速、高效、准确地修改基因组的方法，被广泛应用于生物学研究、农业改良以及药物研发等领域。
本文将详细介绍Cas9质粒基因编辑技术的原理、步骤和应用，并重点讨论CRISPR-Cas9基因编辑降解的最新进展。
一、Cas9质粒基因编辑技术原理Cas9质粒基因编辑技术是基于CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）和Cas（CRISPR associated）蛋白的相互作用而发展起来的。
CRISPR序列是细菌和古菌中广泛存在的一类特殊DNA序列，由一段相对保守的重复序列和介于重复序列中间的间隔序列组成。
Cas蛋白则是与CRISPR序列相结合的一类蛋白质。
在Cas9质粒基因编辑技术中，首先需要设计合适的sgRNA（single-guide RNA）。
sgRNA由两个部分组成：第一个部分是20个碱基长的单链RNA，其中包含了与目标基因序列互补的序列；第二个部分是由CRISPR序列和常规RNA序列合成的双链RNA。
这两部分结合后形成一个复合体，与Cas9蛋白结合后，形成Cas9-sgRNA复合物。
二、Cas9质粒基因编辑技术步骤Cas9质粒基因编辑技术通常分为设计、合成和表达sgRNA，以及转染和筛选阳性细胞两个主要步骤。
1. 设计和合成sgRNA：根据目标基因序列的特点，设计合适的sgRNA序列。
一般来说，应选择与目标基因序列高度匹配的20个核苷酸序列来作为sgRNA的目标序列。
接下来，将设计好的sgRNA序列进行化学合成。
2. 表达sgRNA：将化学合成的sgRNA序列构建到适当的载体中，然后通过细菌转化和菌落PCR等方法获得高质量的sgRNA表达质粒。
3. 转染和筛选阳性细胞：将sgRNA质粒与Cas9蛋白一起转染到目标细胞中。
经过一段时间的培养后，利用目标基因序列的特点进行阳性细胞的筛选，最终得到目标基因的编辑细胞。
质粒的用途
质粒的用途介绍质粒是一种循环的双链DNA分子，广泛应用于基因工程和生物技术研究中。
质粒具有多种用途，包括基因克隆、基因表达、基因传递和基因编辑等。
本文将深入探讨质粒的用途及其在各个领域中的重要性。
基因克隆质粒在基因克隆中扮演着重要的角色。
通过质粒载体，可以将感兴趣的基因片段插入质粒中，并将其转化到宿主细胞中。
质粒中常用的基因克隆位点包括限制性内切酶切位点和多克隆位点。
限制性内切酶切位点使得我们能够选择性地切割质粒和待插入的基因片段，从而实现基因的定向插入。
多克隆位点则允许同时插入多个基因片段，方便进行多基因的克隆。
基因表达质粒也被广泛用于基因表达研究中。
通过将目标基因插入质粒的表达位点，可以使得该基因在宿主细胞中得到表达。
质粒中常用的表达位点包括启动子、转录终止子和选择性标记基因。
启动子是调控基因转录的序列，可以使得目标基因在特定条件下得到高水平的表达。
转录终止子则用于终止基因的转录过程。
选择性标记基因可以在宿主细胞中引入抗性，从而筛选出含有目标质粒的细胞。
基因传递质粒也被用于基因传递研究中。
通过将质粒转化到宿主细胞中，可以使得目标基因在细胞内得到传递。
质粒转化的方法包括热激转化、电转化和化学转化等。
热激转化利用高温或低温对细胞进行短暂处理，使得细胞壁变得渗透性增加，从而使得质粒能够进入细胞内。
电转化则通过电场作用使得质粒进入细胞。
化学转化则利用化学方法使得质粒与细胞发生相互作用，从而实现基因传递。
基因编辑质粒在基因编辑中也发挥着重要作用。
通过将基因编辑工具（如CRISPR-Cas9系统）与质粒结合，可以实现对基因组的精确编辑。
质粒中常用的基因编辑位点包括靶向序列和Cas9蛋白编码序列。
靶向序列是指用于指导Cas9蛋白与目标基因组特定区域结合的序列，从而实现基因组的剪切和修复。
Cas9蛋白编码序列则用于在宿主细胞中表达Cas9蛋白，使得基因编辑工具能够发挥作用。
应用领域质粒的应用不仅局限于基因工程领域，还涉及到许多其他领域。
基因工程中细菌内源质粒消除研究进展
1.物理学方法
1）特点：通过物理手段消除质粒是最简单的质粒消除方法。其优点是消 除实验简单，操作容易且不会对细菌自身的基因组造成影响，不存在突 变风险。 2）现在使用物理学手段消除质粒有以下几种： (1)高温 (2)电穿孔法：先用过夜的 E．coli 菌液制备电穿孔细胞，然后将细胞 在2.5 kV，25μ F 条件下电击，实验发现80%的菌株消除了内源质粒。电 穿孔方法消除质粒是因为细菌的细胞膜和细胞壁在高电压下被击穿，表 面形成很多孔洞，内源质粒从孔洞流出细胞，造成细菌质粒消除。 (3)原生质体形成与再生法：在金黄色酿脓葡萄球菌 ( Staphylococcus aureus) 中利用原生质体形成与再生的方法消除了内源质粒，且消除效 率达80%。原生质体形成与再生法消除原理为:在原生质体制备的过程中 细菌的细胞壁被去除，造成了质粒复制过程中分配机制的破坏，从而导 致质粒消除。
2.化学方法
（2）抗生素类 因为大多数质粒消除试剂都具有抗菌性质，因此抗生素对质粒消除 的作用亦被广泛研究。很多抗生素类药物都可用于质粒消除，如新生霉 素、曲伐沙星、利福平、丝裂霉素 C 等。其中新生霉素的运用最为广泛 ，消除效率为4.6%。它们作为DNA促旋酶抑制剂，能抑制促旋酶活性，使 得质粒复制中间体在细菌体内大量积累，造成质粒复制异常从而导致质 粒丢失。
四、应用实例（2）
鉴定根瘤菌质粒功能的方法主要是消除该质粒和 将其转移到其他菌株中去以考察其性状的改变。由于 大多数根瘤菌质粒十分稳定且难于消除,并且只有极 少数质粒具有自我转移功能,所以迄今有关根瘤菌非 共生质粒的功能所知甚少。已有的研究结果表明,根 瘤菌的某些非共生质粒与菌株的结瘤竞争能力、固氮 效率、胞外多糖产生以及对抗生素降解等有关。某些 根瘤菌的内源质粒,包括共生质粒和非共生质粒可以 在不同种属的根瘤菌之间、根瘤菌与土壤杆菌之间以 一定的频率进行自我转移或诱动转移与表达,一些研 究者已经观察到不同根瘤菌质粒之间的不亲和性现象 。根瘤菌与土壤杆菌质粒之间的不相容特性已被用来 消除土壤杆菌的某些用常规方法难已消除的内源质粒 。
2022年内蒙古科技大学生物技术专业《微生物学》期末试卷B(有答案)
2022年内蒙古科技大学生物技术专业《微生物学》期末试卷B(有答案）一、填空题1、细菌糖被的功能为：① ______、② ______、③ ______和④ ______ 等。
2、动物病毒基因组DNA转录产生的初始转录要经过包括______、______、______和______等修饰才能成熟为功能性mRNA。
3、1分子葡萄糖底物经EMP途径产生______分子丙酮酸，______分子NADH＋H＋和______分子ATP。
4、在液体培养基中，放线菌常以______的方式繁殖，工业上的______ 就是利用这一方式进行增殖的。
5、霉菌产有性孢子、结构复杂的子实体称为______，其外形有______、______和______三种。
6、微生物在现代生物分类系统中分别属于______界、______界、______界和______界。
7、物理灭菌因素的种类很多，例如______、______、______、______、______和______等。
8、磷的生物地球化学循环包括3种基本过程：______、______、______。
9、细菌的质粒种类很多，其中接合性质粒如______，抗药性质粒如______，产细菌素质粒如______，诱癌质粒如______，诱生不定根的质粒如______，执行固氮的质粒如______，降解性质粒如______等。
10、病毒可诱导动物细胞产生干扰素，而干扰素又可刺激细胞合成______，它被入侵病毒激活后，可降解病毒的______，从而阻止了病毒______的转译和阻止有感染力病毒的合成。
二、判断题11、苏云金芽孢杆菌的杀虫机制主要是靠其芽孢和伴胞晶体。
（）12、病毒、类病毒和朊病毒因其是活细胞内寄生物，不能在人工培养基上培养，故属于难养菌。
（）13、肽聚糖合成过程中的一个重要中间产物称作“Park”核苷酸，就是UDP-N-乙酰胞壁酸四肽。
（）14、整合在宿主基因组上的前噬菌体暂时没有侵染性。
现代微生物遗传学第三章质粒
• 一、质粒的发现
– F质粒(1946年)，第一个被发现的质粒
– 20世纪50-70年代：抗性质粒的大量研究，以及其他 质粒的发现
– 20世纪70年代后，质粒广泛应用于遗传工程和分子 生物学研究中。
• 二、质粒的命名原则
– 最初发现的质粒由研究者根据表型、大小等特征自行 命名。(F因子、R质粒、Col质粒等)
• pBR322质粒：pMB1的ori和rop（ROP蛋白对质粒的复
制负调控）区；pSC101的tetr；Tn3的ampr。属中等拷 贝质粒，10~30个/细胞 • pUC类：高拷贝质粒（100~300个/细胞），也是pMB1
的ori，但是没有rop。
• 质粒的寄主范围和质粒的拷贝数均决定
于质粒的ori区域。
• 四、质粒的分离、检测与纯化
– 质粒分离方法：碱变性法
• 菌体的培养和收集
• 溶菌
• 碱变性处理
• 离心分离
• 有时为了快速提取质粒DNA，可以在提取液碱变性 后，用pH4.8的醋酸钠高盐缓冲液调节pH到中性， 这时染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构， 而即使变性的质粒可以恢复到原来的构型，再通过 离心，这样可以缩短提取质粒的时间。
第一节 质粒的发现和命名
• 质粒： – 存在于细菌、真菌等微生物细胞中、独立于染色体 外、能进行自我复制的遗传因子。 – 对于宿主，一般是非必需的 – 通常是共价(covalent)、闭合(closed)、环状(circular) 双链DNA.(但也有例外：线状DNA，RNA)
• 附加体：整合在染色体上，或游离，并能携带宿主的 染色体基因。
• 二、质粒的复制
– 1.质粒复制的方式(P120)
• 质粒的复制起点称 为oriV,大肠杆菌为 oriC。
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J ou rna l of N anj ing A g ricu ltu ra l U n iversity一氯苯的微生物厌气降解及其降解性质粒的研究Ξ罗如新 沈 标 李顺鹏(南京农业大学微生物学系,南京210095)摘要 以一氯苯为唯一碳源,从某化工厂废水处理厂的活性污泥中分离得一株一氯苯降解菌,初步鉴定属于气单胞菌属(A ero m onas)。
用气相色谱法测得该菌在3周内的氯苯降解率为33%。
不同的质粒消除试验结果表明,该菌质粒很稳定。
已成功地将质粒转移到大肠杆菌(E.coli JF803)中。
该转化子能利用一氯苯为唯一碳源生长,且转化子中有与原菌株电泳迁移率相同的质粒。
因此,可以认为该质粒携带有降解一氯苯的基因。
关键词 一氯苯;生物降解;质粒中图分类号 X783ANAEROB I C B I OD EGRADAT I ON OF CHLOROBENZENE AND PREL I M INARYSTUDY ON THE D EGRADAT IVE PLAS M I D SL uo R ux in,Shen B iao and L i Shunp eng(D ep t of M icrob i o logy,N an jing A gric U n iv,N an jing210095)ABSTRACT A ch lo robenzene degradative strain w as iso lated from activated sludge by u sing ch lo robenzene as so le carbon sou rce.It w as p reli m inarily iden tified as an A ero m onas.T he degradati on rate of ch lo robenzene w as33%in3w eek s tested w ith gas ch rom atography.D ifferen t m ethods w ere u sed to cu re the p las m ids and it w as found that the p las m ids w ere very stab le.T he p las m id w as tran sferred to E.coli.T he tran sfo rm an t cou ld u se ch lo robenzene as so le carbon sou rce and p las m id w as detected w ith the sam e electropho retic tran s2 ference rate as the o riginal strain.T hu s,it can be confirm ed that th is p las m id po ssesses the necessary gene fo r ch lo robenzene degradati on.Key words ch lo robenzene;b i odegradati on;p las m id微生物对污染物质的代谢、转化及降解作用,是当今环境污染研究中最活跃的领域之一。
目前,研究工作已转入对微生物降解代谢途径、酶系的研究和遗传控制的探讨。
70年代,研究证实了降解某些烃的酶系基因在质粒上。
之后,通过导入质粒来构建具有特殊功能和高效降解能力的遗传工程菌,为降解菌的定向育种开辟了一条新的途径。
本项研究针对国内化工行业生产的一氯苯所带来的污染状况,探讨了厌氧条件下微生物对一氯苯的利用能力,并验证了降解质粒的存在,这将为一氯苯的微生物降解研究增添新的内容,并为构建高效工程菌株补充又一菌种来源。
Ξ江苏省科技计划项目(90013)收稿日期:199620322846南京农业大学学报20卷1 材料与方法111 样品来源活性污泥样品采自苏州化工厂废水处理厂。
112 一氯苯厌气降解菌的富集培养、分离和鉴定富集培养基成分:蛋白胨100g,K2H PO41.0g,葡萄糖1.0g,N aC l1.0g,加水至1L。
pH7.0～7.2。
无机盐培养基成分:N H4NO31.0g,(N H4)2SO40.5g,M gC l20.5g,KH2PO4 0.5g,K2H PO41.5g,N aC l0.5g,加水至1L。
pH7.0～7.2。
在厌氧条件下,150m l富集培养基中加活性污泥5m l进行富集培养(一氯苯50m g L)。
每隔一周将富集培养液转接一次(接种量为10%,新鲜培养液中一氯苯依次增加50m g L),转移5次后,一氯苯达到300m g L。
然后用无机盐培养基代替富集培养基驯化1周。
以含一氯苯300m g L的固体无机盐培养基进行滚管分离,约1周后出现菌落。
厌氧条件下将较大的菌落移入含300m g L一氯苯的液体无机盐培养基中,培养1周后,再滚管分离。
连续2次分离后,选择生长最快的菌落移入液体无机盐培养基中。
该菌株暂定名为L1。
按常规方法[1,2]对L1菌株进行鉴定。
113 一氯苯的含量测定用气相色谱法测定一氯苯含量。
气相色谱条件为:DC Q F21115%,2.1m,汽化室温度230℃,柱温190℃,N270m l m in。
在80m l瓶中装入50m l含300m g L一氯苯的无机盐培养基,厌氧培养。
每隔5d取样测定。
样品处理方法为:取样1m l,加1m l苯,充分振荡,静止2h 分层;取上层有机相,加少量无水硫酸钠,澄清后测定。
114 L1菌株的质粒检测按文献[3]的方法进行。
115 L1菌株的质粒消除试验LB培养基:胰蛋白胨10g,酵母抽提物5g,N aC l10g,加水至1L。
pH7.0～7.2。
挑L1菌株单菌落在3m l LB液体培养基中37℃静止过夜。
菌悬液用生理盐水稀释至10-5,各取015m l菌液分别转接至5m l含不同浓度消除剂的LB培养液中,37℃培养48h。
菌培养液经生理盐水适当稀释后涂布至LB平板上,生长过夜;用牙签分别挑取单菌落点种到LB培养基平板和含一氯苯300m g L的无机盐培养基平板上,培养3～4d,观察结果[4]。
在含一氯苯的无机盐培养基平板上不能生长的菌落初步确定为质粒消除的阴性突变子,可从对应的LB平板上挑取。
116 L1菌株质粒D NA转化按文献[3]的方法进行。
2 结果与讨论211 细菌的分离鉴定经鉴定,L1菌株为革兰氏阴性无芽孢杆菌,极生单鞭毛,兼性厌氧,接触酶、氧化酶阳性,硝酸盐还原试验阳性,葡萄糖发酵产酸、产气,肌醇发酵产酸、产气,不液化明胶,水解淀粉,不利用柠檬酸,最适温度30～37℃,最高温度44～45℃。
据此,初步将L1菌定为气单胞菌(A ero m onas sp )。
图1 一氯苯的降解曲线F ig .1 D egradati on of ch lo robenzene by L 1strain 212 L 1菌株在厌氧条件下对一氯苯的降解从图1可见,扣除对照后,在厌氧条件下L 1菌对一氯苯的降解率为33%(在18d 内)。
据报道[5],对于卤代化合物,如重氯化烃类,其厌氧脱氯速率随化合物的氯化程度减少而降低,而好氧脱氢速率随化合物的氯化程度减少而增加。
因此,一氯苯的微生物降解在好氧条件下应比厌氧条件下更易。
L 1菌株是一株兼性厌氧菌,好氧情况下对一氯苯的降解还有待进一步测定。
213 质粒检则和质粒消除少量提取质粒DNA ,经7g L 琼脂糖凝胶电图2 转化子质粒检测电泳图 F ig .2 P las m ids harbou red in E .coli JF 803tran sfo rm an ts A ,B ,C -tran sfo rm an t ,D ,E -L 1泳检测,L 1菌出现4条清晰的质粒带(图2)。
用含有1条质粒带的E .coli JF 803作质粒检测对照,可以确定L 1菌的4条带为分子量大小不同的质粒带。
质粒消除结果见表1。
从表1可以看出,用不同处理方法可得到许多氯苯利用阴性突变子。
把这些突变子转接至斜面,再次接种于以一氯苯为唯一碳源的平板上,又能生长。
经质粒检测并与原菌株相比较,无质粒消除。
质粒消除是一种极好的检测质粒特性的手段。
质粒可以自发消失,也可以用消除剂使质粒消除。
然而,许多质粒很难被消除,因此当某些特性不能消除时,并不意味着这是宿主的专性;质粒某一特性的丢失也不能被认为是质粒已被消除。
某些处理会导致选择性地产生质粒缺失衍生物[6],即某些碱基发生突变而失去对底物的利用能力。
在一定条件下,这种突变又可能会发生回复突变,使阴性突变子恢复对底物的利用能力。
214 质粒转化受体菌E .coli JF 803不含质粒,不能利用一氯苯。
转化平板37℃培养2～3d 后,挑取单菌落,转接斜面作质粒检测,电泳结果(图2)显示,转化子获得了L 1菌株中的一条质粒带。
转化子能在以一氯苯为唯一碳源的平板上生长,说明该质粒与氯苯利用有关,且能在大肠杆菌中表达。
对于该质粒的分子量、编码产物及转化子的稳定性和底物利用特性等尚有待更深入的研究。
562期 罗如新等:一氯苯的微生物厌气降解及其降解性质粒的研究表1 用不同方法处理L1获得的一氯苯利用阴性突变子Table1 M utan t not degrad i ng chlorobenzene obta i ned by d ifferen t m ethods处 理T reatm en t 吖啶橙 m g・L-1A cridine o range255075100SD S250m g・L-1丝裂霉素CM itom ycin C10m g・L-142℃72h100℃2m in复合处理1(1)Compo sitetreatm en t1复合处理2(2)Compo sitetreatm en t2突变子M u tan t0916-*******注:(1)复合处理1:10m g L丝裂霉素C处理48h,再经100℃处理90s。
Compo site treatm en t1:first10m g L m itom ycin C48h,then100℃90s.(2)复合处理2:吖啶橙50m g L处理48h,再经42℃处理48h,再用丝裂霉素C处理48h。
Compo site treatm en t2:first50m g L acridine o range48h,then42℃48h,finally5m g L m itom ycin C 48h.参 考 文 献1 中国科学院微生物研究所细菌分类组1一般细菌常用鉴定方法1北京:科学出版社,1978137～392 Buchanan R E,Gibbon s N E.Bergeys m anual of determ inative bateri o logy.8th editi on.U SA:T he W illiam s&W ilk in s Company.19863 Sanb rock J,F ristsch E F,M an iatis T.M o lecu lar clon ing.U SA:Co ld Sp ring H arber L abo rato ry P ress, 1982.247～2694 王春生,罗清修,简浩然,等1BHC降解性质粒的研究1环境科学学报,1984,(4):325～3325 L ak sh i m i Bhatnagar1用混合培养法去除危险性废物的毒性1胡荣笃译1国外厌氧消化,19921(1):1～22 6 Bennett P M,Grin sted J.M ethods is m icrob i o logy.V o l17.P las m id techno logy.U SA:A cadem ic P ress, 1984.33～123(责任编辑 是雅蓓) 66南京农业大学学报20卷。