简述全内反射荧光显微术原理与应用
全内反射荧光显微镜概述
3. 物镜型光学成像系统中物镜
由于细胞的典型折射率为1.33~1.38，因此要实现全内 反射，在物镜型全内反射荧光成像系统中物镜的数值 孔径（NA）必须大于1.38。 当物镜数值孔径为1.4时，只有很小的一部分数值孔径 范围（1.4-1.38=0.02）被利用，入射角可调节范围 （最大孔径角与全内反射角的差值）很小，光束校准 比较难，同时光束的强度也很难提高。若使用数值孔 径为1.65的物镜，则有一个大的多的孔径范围（1.651.38=0.27）可以被利用，则入射角可调节范围变大， 降低了操作难度。高数值孔径的物镜的使用是物镜型 全内反射荧光成像系统的关键。
全内反射
全内反射是一种普遍存在的光学现象。 考虑一束平面光波从折射率为n1的介质进入到折射 率为n2的介质中。入射光在表面上一部分发生反射， 另一部分则发生透射。入射角θ1和透射角θ2之间满 足关系式n1sinθ1=n2sinθ2 当n1大于n2时，全反射就可能发生:即所有的入射光 线全部反射出来,称为全内反射。
2.2 物镜型
而在物镜型成像系统中，显微镜的物镜既是发生全内反射的 光学器件，又是样品荧光信号的收集器。其优点是样品的大 小没有棱镜的限制，样品的放置非常方便，并且由于样品远 离物镜而可以与多种其他技术相结合，例如微操作，微分干 涉成像系统，光镊技术，扫描探针显微术等等，因而相对于 棱镜型展现出更加广阔的生物应用前景。
2.1棱镜型
棱镜型利用激光经过棱镜并产生全内反射，其隐失波照射已 被荧光标记的生物样品，其激发光从另一侧进入物镜并被 CCD相机捕捉。棱镜作为发生全内反射的光学器件。物镜只 是作为荧光信号收集器。在探测上，它也不容易受到入射光 的干扰。缺点是放置样品的空间位于棱镜和盖玻片之间，所 以样品大小和样品的放置受到限制。
全内反射成像的原理及应用
全内反射成像的原理及应用1. 引言全内反射成像是一种重要的光学现象，广泛应用于光学仪器、光纤通信、医学影像等领域。
本文将详细介绍全内反射成像的原理及其在不同领域中的应用。
2. 全内反射成像的原理全内反射是光从光密介质射向光疏介质的界面时，入射角大于临界角时发生的现象。
在这种情况下，光线将完全被反射回光密介质中，而不会透射到光疏介质中。
全内反射成像利用这一原理，在光密介质和光疏介质的交界面上形成虚拟的光学元件，通过控制入射角和光线传播路径，实现成像功能。
3. 全内反射成像的应用3.1 光学仪器中的应用全内反射成像在光学仪器中有着广泛的应用。
例如，在显微镜中，通过使用透明的物质作为载玻片和近场物体之间的介质，可以利用全内反射成像来观察样本的细微结构。
同样，在光学显微镜和投影仪中，也可以利用全内反射成像来改善成像的清晰度和分辨率。
3.2 光纤通信中的应用光纤通信是一种利用光信号进行高速数据传输的技术。
在光纤中，信号的传播主要依靠全内反射成像。
光纤的内部涂覆着高折射率的材料，从而让光信号在光纤中完全反射。
通过控制入射角和光纤的弯曲，可以实现信号的传输和调制。
光纤通信具有高带宽、低衰减等优点，已经成为现代通信领域的重要技术。
3.3 医学影像中的应用在医学影像学中，全内反射成像也起到了关键的作用。
例如，通过内窥镜和纤维光学技术，医生可以观察和诊断患者体内的病变。
内窥镜通过应用全内反射成像，将光线引导到需要观察的部位，通过适当的透镜和传感器，可以获取高清晰度的图像，为医生提供更准确的诊断依据。
4. 结论全内反射成像是一种重要的光学现象，广泛应用于光学仪器、光纤通信和医学影像等领域。
通过理解其基本原理，我们可以更好地利用全内反射成像技术，提高成像质量和传输效率。
未来随着科学技术的不断发展，全内反射成像在更多领域中的应用将会得到进一步的拓展和改进。
以上是对全内反射成像原理及应用的简要介绍，希望能为读者提供有关这一主题的基本知识和启发。
TIRF在生物学中的应用
1
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折射率取为 1.33(生物细胞的折射率范围是 1.33～1.38)，则玻璃/界面处的临界角为 61.74°。 即当光线从玻璃中射入溶液中时，入射角大于 61.74°时就会发生全反射。
隐失波 从几何光学的角度来看,当发生全反射时,光会在玻璃界面上完全反射而不进 入液体溶液中。实际上,由于波动效应,有一部分光的能量会穿过界面渗透到溶液中,平行于界 面传播。这部分光就是所谓的隐失波。隐失波是一种非均匀波，它沿着入射面上的介质边界 传播，在平行界面方向以平行波场方式传播而在垂直界面方向则是呈指数衰减。透射强度和 浸透深度公式如公式（3）所示。由公式知，对于可见光波长而言，浸透深度为～100nm。
20 世纪30 年代电子显微镜的发展导致了细胞研究的革命,使得生物学家得以从亚显微 水平上认识细胞世界。进入80 年代,非光学类扫描探针显微术特别是原子力显微镜的出现更 是将成像的分辨率推进到纳米的精度。与此同时,新一代光学显微技术也应运而生，它们以 其高的空间分辨率和时间分辨率、无损伤、以及对单分子活体探测的可行性,再次成为生物 学家、物理学家和成像学家们研究的热点。目前国际上公认的最有前途的单分子光学成像技 术有全场相衬显微术、共焦荧光显微术,近场光学扫描显微术和全内反射荧光显微术[1]。这 些技术在分子生物学、分子化学、激光医学及纳米材料等领域受到广泛关注,并产生了深远 的影响。
全内反射荧光显微镜 - 北京大学单分子与纳米生物学实验室
当一束平面光波从折射率为n1的介质进入到折射率为n2的介质中
消逝波----全内反射荧光镜的关键所在
消逝波 消逝场(evanescent field)
荧光消逝波 θ2=90° θc=sin-1(n2/n1)
全内反射的仪器组成
全内反射荧光显微成像系统
棱镜型
物镜型
成像系统的消逝场 是通过入射光经棱 镜发生全反射产生 的
基本概念
Title 全内反射荧光显微术：
Title 数值孔径：
全内反射荧光显微术：
全内反射荧光显微术是利用全内反射产 生的消逝波来照射样品，从而致使在样 品表面数百纳米级厚度的光学薄层内的 荧光团受到激发，使单分子成像。
数值孔径：
数值孔径又叫做镜口率，简写为N.A。它是 由物体与物镜间媒质的折射率n与物镜孔径 角的一半（a\2）的正弦值的乘积，其大小 由下式决定：N.A=n×sin a/2
全内反射荧光技术发展历程
1965年
Hirsch field 完成了第一个 全内反射荧光 实验
1995年
Yanagida小 组用TIRFM技 术首次在液体 溶液中得到了 荧光标记的单 个蛋白质分子 的成像.
1996年
Moerner小 组又用这项技 术实现了限制 在丙烯酰胺胶 体的纳米孔中 的单分子的三 维成像。
层析深度分别为～ 500nm～800nm , 而全内反 射显微术典型的垂直照明深度<100nm。这么 薄的光学层析层切片意味着信噪比 比共焦系统 好得多, 细胞的光损伤和光漂白也很小。
全内反射荧光显微镜优点：
1：信噪比高 2：分辨率高 3：对生物样本损伤小
与共焦技术相比, 单光子或双光子的共焦系统层 析深度分别为～ 500nm～800nm , 而全内反射显 微术典型的垂直照明深度<100nm。这么薄的光 学层析层切片意味着信噪比 比共焦系统好得多, 细胞的光损伤和光漂白也很小。
全内反射荧光显微术名词解释
全内反射荧光显微术名词解释全内反射荧光显微术，听起来就像是从科幻电影里蹦出来的名词，是吧？其实它可是一种非常酷炫的显微镜技术，能让我们看到那些微小得像针尖一样的细胞和分子。
想象一下，把光线像小箭一样射向样品，当光线以一定的角度入射，嘿，光线就不再穿透，而是在界面上反射回来，这就是全内反射的魔法！这时候，样品里的荧光分子会被激发，发出闪闪的光芒，简直就像夜空中的繁星，令人心醉。
用这个技术，科学家们可以观察生物样品，像细胞膜、蛋白质等。
大家知道细胞是生命的基本单位，对吧？而这些微小的结构可不是轻易就能看清的，普通显微镜就像是用放大镜看远处的星星，模糊得很。
全内反射荧光显微术却像是把宇航员送到了太空，直接给你展示了细胞内部的每一个角落，真是让人眼前一亮。
这项技术的魅力在于，能在活细胞中进行观察。
别小看这一点，很多传统的显微镜技术可得把细胞弄得死去活来才能看清。
可是全内反射荧光显微术却让我们能够在“现场”观察，活生生的细胞在做什么，简直就像在看一场精彩的真人秀！你可以看到细胞的动态变化、分裂过程，甚至是它们如何和周围的环境互动，这些都是生命中最微妙的瞬间。
说到荧光，这里有个小秘密。
荧光分子就像是小小的发光棒，只有当它们被特定波长的光激发时，才会闪耀出美丽的光芒。
像小孩子玩耍一样，开心得不得了。
这种现象让我们能够区分不同的细胞，甚至标记特定的蛋白质，形成色彩斑斓的图像。
这些图像比任何油画都要生动，简直就是生命的艺术品。
想想看，科学家们在显微镜下能看到的那些细胞，像极了微缩版的城市，热闹非凡。
全内反射荧光显微术也让我们在医学研究中大放异彩。
比如在癌症研究中，科学家们通过观察癌细胞的特征，发现它们是如何突破正常细胞的防线，蔓延到其他地方的。
这种技术帮助我们了解疾病的根本，寻找更有效的治疗方案。
感觉像是在揭开一个个神秘的面纱，让我们看清楚那些潜藏在暗处的真相。
操作全内反射荧光显微术可不是随便拍拍的事。
它需要一套精密的设备和技术，像调整光路、选择激发波长，这些都得小心翼翼。
荧光显微镜的原理和使用方法
• 2.1 荧光显微镜旳基本装置及其光路
•
荧光显微镜因制造厂家、型号旳不同，构造
各异，但主要构件，基本相同。
• 2.1.1光源:采用高压汞灯。汞灯能以最小旳表面 发出最大数量旳紫外光和蓝光，且光亮度大，光
度稳定。汞灯旳构件，中间为一球形石英玻璃管， 有两个钨电极，内充汞滴和少许氩氖混合气体。 汞灯装在牢固旳灯室中，有调中、聚焦和集光装 置。使用中禁止频繁启闭，点亮后欲暂停使用时，
不可切断电源，可用光阀阻断光路。当汞灯熄灭 后，不能立即点亮，经5～10min，汞灯冷却后再 通电点亮。
•
HBO200Ｗ汞灯旳发射光谱为200～600nm，
• 视场光阑旳调整使用：视场光阑位于孔径光阑 之后，亦由外露手杆操纵。视场光阑用于限定样 品表面旳照明区域，其开度一般应与孔径光阑旳 开孔相当。
• 辅助激发滤色镜滑动阀旳使用:滑动阀位于镜臂 专用槽中，可拉出或推入。有三个挡位供不同使 用。全拉出位：供常规使用；中间位：用于Ｂ激 发法，辅助滤色镜进入光路；全推入位：用作光 阀，阻断全光线．
• 某些物质经波长较短旳光线照射后，分子被激活， 吸收能量后呈激发态。其能量部分转化为热量或 用于光化学反应外，相当一部分则以波长较长旳 光能形式辐射出来，这种波长长于激发光旳可见 光称作荧光。生物体内有些物质受激发光照射后 可直接发出旳荧光，称为自发荧光（如叶绿体中 旳叶绿素分子受激发所发出旳火红色旳荧光）； 本身不发荧光，在吸收荧光染料之后所发出旳荧 光称为次生荧光。常用旳荧光染料涉及丫啶橙、 荧光素、罗丹明、GFP、PI、PE、DAPI等。
荧光显微法
荧光显微法
荧光显微法是一种新型生物光学显微技术。
荧光物质当被短光波的紫外线放射时,则发出可见光线。
荧光显微术即应用这一原理。
荧光显微镜以紫外光线为光源,观察的标本多用荧光色素染色,由于紫外线的照射,激发标本内的荧光物质,而呈现荧光映像。
全内反射荧光显微技术是当今世界上最具前途的新型生物光学显微技术之一,可以用来实现对单个荧光分子的直接探测。
它利用全内反射产生的隐失波照明样品,使照明区域限定在样品表面的一薄层范围内,因此具有其它光学成像技术无法比拟的高的信噪比和对比度。
近年来,已被生物物理学家们广泛应用于单分子的荧光成像中。
全内反射荧光显微镜90613113
TIRFM的发展历程
❖ 上世纪80年代初，Axelrod和Daniel等生物 物理学家对TRIFM技术及基本原理进行描述， 他们利用TIRFM对荧光脂质标记的人类皮肤 成纤维细胞的细胞-基膜连接进行了研究，另 外几乎是在同一时间，科学家也通过TIRFM 和FRAP(荧光漂白恢复技术)的结合使用对生 物分子表面的动力学进行了研究。
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TIRFM的发展历程
❖ 上世纪90年代初，随着新型物镜透镜、聚光 镜和超灵敏探测器的出现，使TRIFM技术得 到充分发展。
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TIRFM的发展历程
❖ 1995年，Yanagida等人第一次用TIRFM技术， 将单位时间（秒）单位区域（以一个衍射极 限面积为单位，微米级别）内的背景信号降 低到3个光子，在液体溶液中得到了荧光标记 的单个肌动球蛋白质分子的成像，并且探测 到了单个ATP酶的翻转反应。从此TIRFM开 始广泛应用于单分子的成像研究。
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传统光学显微镜在生物样本显微方面 的缺点
❖ 信噪比不高，分辨率不高，同时光学显微镜 有空间分辨极限，约为250 nm。从生物学应 用的角度，传统的光学显微镜显然无法满足 更高的空间分辨率要求，并且研究过程中需 要破碎细胞或对细胞造成损伤，无法做到在 活细胞生理条件下实时地对细胞内蛋白质-蛋 白质间相互作用进行动态研究。
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TIRFM的发展历程
❖ 21世纪以来，全内反射荧光法的方法多种多 样，包括时间分辨全内反射荧光、多重内反 射荧光和全内反射荧光相关光谱等方法。它 研究的内容也很广泛，包括观察表面分子或 近表面分子的取向、旋转和荧光寿命，肌球 蛋白酶活性测量，单个蛋白分子对之间的荧 光共振能量转移，基因芯片荧光检测等等。
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物镜型TIRFM系统
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简述全内反射荧光显微术原理与应用柳正(10589537)北京大学医学部基础医学院生物物理系【摘要】全内反射荧光显微术(Total internal reflection fluorescence microscopy TIRFM)是利用全内反射产生的消逝波激发样品,从而使样品表面数百纳米厚的薄层内的荧光团受到激发,荧光成像的信噪比大大提高。
可以看到样品表面，单分子的活动情况。
近年来，全内反射荧光显微术被生物物理学家们广泛应用于单分子的荧光成像中。
文章综述全内反射荧光显微技术的基本知识，介绍几个运用全内反射荧光显微镜技术研究生物单分子的实例。
【关键词】:全内反射荧光显微镜消逝波单分子蛋白相互作用构像变化1引言从单分子水平上对生物分子行为（包括构象变化、相互识别、等）的实时﹑动态检测以及在此基础上的操纵等，研究者籍此可以深入理解生物活动的机制与产生生物分子效应过程。
生物单分子成像技术在生物系统研究中已经广泛使用。
随着生物单分子研究深入，越来越要求发展超高分辨率的成像与高信噪比成像技术。
近些年来，发展前景被看好的单分子光学成像技术有全场相衬显微术、共焦荧光显微术，近场光学扫描显微术和全内反射荧光显微术[1]。
这些技术在分子生物学、分子化学及纳米材料等领域受到广泛关注。
其中，全内反射荧光显微术是利用全内反射产生的消逝波来照射样品，从而致使在样品表面数百纳米级厚度的光学薄层内的荧光团受到激发，使单分子成像。
全内反射荧光显微术发展历程，Hirsch field于1965年完成了第一个全内反射荧光实验,这是首次尝试用全内反射荧光法测液体中的单个分子的荧光。
将全反射理论与生物细胞的荧光成像技术相结合是一种全新的突破。
虽然它的具体应用还不到10年的时间,但是它在单分子探测中已显示出强大的生命力.1995年,Yanagida小组用TIRFM技术首次在液体溶液中得到了荧光标记的单个蛋白质分子的成像.1996年,Moerner小组又用这项技术实现了限制在丙烯酰胺胶体的纳米孔中的单分子的三维成像。
至今该项技术已经应用到许多单分子的研究中，如肌球蛋白酶活性测量[2]，肌收缩力的产生，荧光标记驱动蛋白动态研究[3]。
另外蛋白的构像的动态变化[4][5]，人工膜中膜蛋白的研究等[6][7]。
2. 全内反射的基本原理全内反射是一种普遍存在的光学现象。
一束平面光波从折射率为n1的介质进入到折射率为n2的介质中。
入射光在界面上一部分发生反射，另一部分则发生透射见图1。
入射角i和透射角r之间满足关系式n1sini=n2sinr (1)图1图2若n1大于n2，例如折射率为n1的是玻璃，折射率为n2的是液体溶液。
当入射角增大，增大到临界角θc时，这时的透射角为90°，当入射角大于或者等于临界角时，光不再透射进溶液，而是发生全反射，如图2所示。
由Snell定律可知θ2=90° θc=sin-1(n2/n1) (2)由上式可知，当n1大于n2时，全反射就可能发生。
如果玻璃的折射率取为1.52，溶液的折射率取为1.33(生物细胞的折射率范围是1.33～1.38)，则玻璃/界面处的临界角为61.74°。
从几何光学的角度来看，当光发生全反射时，光会在玻璃界面上完全反射而不进入液体溶液中。
实际上，由于波动效应，有一部分光的能量会穿过界面渗透到溶液中，是一种非均匀波，它沿着入射面上的介质边界传播，而振幅随离界面的距离ｚ作指数衰减。
可以看出，透射电磁场的振幅随进入样品的深度ｚ减小得非常快，这种电磁场只存在于界面附近一薄层内，因此，我们称此非均匀场为消逝场(evanescent field)。
其在第二介质中的有效进入深度约为一个波长[8]。
消逝波激发在一个波长范围之内的荧光分子发出荧光消逝波。
消逝波是一种非均匀波，它沿着入射面上的介质边界传播，在平行界面方向以平行波场方式传播而在垂直界面方向则是呈指数衰减。
透射强度和浸透深度公式如公式（3）所示。
由公式知，对于可见光波长而言，浸透深度为～100nm。
(3)3. 全内反射的仪器组成[9]到目前，研究者已经发展了多种全内反射荧光显微成像系统。
其中最为普遍的两种类型是棱镜型图3所示和物镜型图4所示。
棱镜型成像系统的消逝失场是通过入射光经棱镜发生全反射产生的，而物镜型的是通过入射光经物镜本身全反射产生。
消逝波激发生物样品的荧光分子，荧光分子所发射的荧光经过物镜成像到照相机或CCD上实现对生物样品的记录。
图3棱镜型全内反射荧光显微镜示意图图4 物镜型全内反射荧光显微镜示意图两种形式的显微镜各有优缺点，对于棱镜型而言，实现起来相对简单，同时它的缺点也很明显：由于要达到较高的光学分辨率，要求接收荧光的物镜工作距离较短，这样留给生物样品和物镜之间的空间较小，所以在此仪器上安装一些诸如原子力显微镜、近场光学显微镜等其他探测仪器非常困难。
物镜式显微镜的物镜既作为收集样品荧光信号的接受器，同时又作为发生全反射的光学器件。
如图4所示，激光聚焦到物镜后焦面并经过物镜边缘入射，物镜出射光为平行光并斜入射至盖玻片上，调节激光入射位置和角度，即可达到全内反射要求，从而实现消逝波照明。
消逝激发的荧光仍旧经过物镜接收，通过双色镜滤掉除荧光以外的其它波长的光，成像在物镜后方的照相机或CCD上，实现对生物样品的荧光记录。
由于样品上方空间完全空出，并且所接受的荧光没有被样品干扰，所以目前大多数生物学家采用物镜式全内反射荧光显微镜[10]4在生物研究中的应用细胞内的很多至关重要的生命活动过程如信号转导，蛋白质转运，病原体侵入均与细胞表面有关，如果我们可以直接对这些细胞表面的过程进行观测，而不受到来自细胞内深层区域信号的干扰，这对细胞生物学研究来说，将是具有重大意义的突破。
全内反射荧光显微术正是凭借其独特的优势,它的荧光激发深度只在～200ｎｍ的薄层范围内,从而成为研究细胞表面科学如生物化学动力学、单分子动力学的最有前途的光学成像技术[11]。
4.1蛋白分子相互作用通过荧光标记的分子共同定位运用全内反射荧光显微镜对分子间相互作用可以直接观察，荧光共聚焦能量转移也能够检测到。
伴侣蛋白利用ATP的水解释放的能量协助蛋白质分子的折叠。
分子伴侣蛋白GroEL和伴侣辅助分子(co-chaperon)GroES或者其底物乳球蛋白的相互作用已经在单分子水平进行了很好的研究。
分别用不同的荧光标记GroEL与相关蛋白，然后观察它们的协同定位。
单分子观察发现通过GroEL协助蛋白折叠动态过程[12]。
单配对荧光共聚焦也可以用在单分子水平生物大分子相互作用的成像。
只有在供体和受体的荧光团非常接近时候，(距离小于10nm)荧光共振才能够发生。
Ishii 等人于1999年测定了用蓝环素3，蓝环素5标记的a原肌球蛋白亚基的连接的荧光共振能量转移。
当肌球蛋白亚基形成同型二聚体的时候，它们之间的距离非常的近，非常适宜荧光共振与转移[13]。
在核酶分子构像变化观察中，也运用到这种方法[14]。
4.2生物大分子动态构像变化观察单个的生物大分子的荧光分子特征和动态构像变化要运用到棱镜型的全内反射荧光显微术。
如用环境敏感荧光基团标记的肌球蛋白，然后用分光镜检测。
肌球蛋白分子上荧光基团发出的荧光光谱随着时间的起伏现象，说明了自发的肌球蛋白单分子构像改变。
Suzuki 等于2002年，运用棱镜型全内反射荧光显微术发现另外一种肌球蛋白构型。
他们在荧光光学系统中设计了一种特殊的楔形棱镜，从而可以在成像相机设备上获得单个荧光分子光谱像[15]。
4.3离子通道研究离子通道通过负责神经，肌肉兴奋性细胞的质膜调节离子电流和电化学势。
单分子水平通道电流记录可以通过使用膜片钳方法来检测各种通道的电特性。
虽然现在离子通道的状态变化与其功能的关系还有待研究，但是Ide和其同事发展了一种同时可以测电流和荧光信号的实验系统。
荧光标记的离子通道蛋白包埋到平面脂双层中，然后用物镜型全内反射荧光显微镜观察。
利用全内反射荧光显微镜结合后来发展的荧光共振能量转移或者双视角的光镜可以看到离子通道与其配基或者调节子之间的相互作用，同时可以在体内跟踪构像变化与离子电流[16]。
全内反射荧光显微术作为细胞表面单分子成像的一种新兴的技术，研究者在已经的基础上做出了一些改进，一是与其它显微成像技术如荧光相关光谱技术(FCS),荧光寿命成像技术(FLIM)以及原子力显微术(AFM)相结合;另一方面是发展双色和多色TIRFM，采用多种染色来观察活体细胞[17]。
另外还有一些的数学方法如统计分析加入到这个对单分子的记录中来。
随着仪器设备的改进，与样品制备的技术的提高，全内反射显微镜发挥它的用处将越来越大。
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