浅谈食品中多酚氧化酶与酶促褐变的控制

浅谈食品中多酚氧化酶与酶促褐变的控制

摘要：多酚氧化酶（Polyphenol Oxidase, PPO）是一类广泛分布于植物体中，由核基因编码，能与铜相结合的一种金属蛋白酶。植物多酚氧化酶是许多果蔬等农产品酶促褐变的主要原因，对农产品食品品质有重要影响。本文概述了多酚氧化酶的分布、分子结构及活性诱导特点，PPO与酶促褐变的关系及对食品的影响，介绍了食品工业生产中酶促褐变的抑制方法，并展望了今后PPO及酶促褐变的研究方向，以对食品中PPO及在酶促褐变中的应用作浅析。

关键词：食品；多酚氧化酶；酶促褐变；控制

1 前言

多酚氧化酶(Polyphenol Oxidase, PPO) 是植物体内普遍存在的一类铜结合酶。它早在1895 年就被发现，直至1937 年才被分离得到。随着研究的深入，将其分为单酚单氧化酶（酪氨酸酶(tyrosinase) ,EC. 1. 14. 18. 1）、双酚氧化酶（儿茶酚氧化酶(catechol oxidase) , EC. 1. 10. 3. 2）、漆酶（laccase , EC. 1.10. 3. 1）[1,2]。现在所说的多酚氧化酶一般是指儿茶酚氧化酶和漆酶的统称。

食品在贮藏加工过程中，经常会发生褐变现象，其中以酶引起的褐变作用非常迅速，酶促褐变需要和氧接触，由酶催化，故称之为酶促褐变。这是由于水果、蔬菜等新鲜植物食物在采摘后，组织中仍在进行活跃的代谢活动。在正常情况下，完整的果蔬组织中氧化还原反应是偶联进行的，但当发生机械性的损伤（如削皮、切开、压伤、虫咬、磨浆等）及处于异常的环境条件下（如受冻、受热）时，便会影响氧化还原作用的平衡，发生氧化产物的积累，造成变色。

大多数情况下，酶促褐变是一种不希望出现于食物中的变化，如香蕉、苹果、梨、马铃薯等园艺产品均很容易在削皮切开后褐变，不仅有损于感观，且影响产品的运销，还可使产品的营养价值降低。另一方面，适当的褐变又是形成如茶叶、可可豆、某些干果等食品良好风味与色泽所不可缺少的。而PPO属于酚酶，能催化酚类物质形成醌及其聚合物，被认为是酶促褐变的主要原因。故对食品中PPO 进行相关研究，寻找能抑制或控制食品酶促褐变的方法，在食品工业中有着重要的意义。

2 PPO概述

2.1 分布

PPO 广泛存在于植物体的各种器官或组织中。研究表明，有活性的PPO定位于正常细胞的质体中。叶绿体的PPO存在于类囊体上，其它类型质体的PPO存在于各种囊泡上[3]。同一植株内，不同成熟度、不同部位的PPO酶活性也有差异，一般幼嫩部分含量较多, 成熟部分含量较少[4]。姜红波等[5]对茶树菇不同部位的粗酶液活性测定表明，菌柄下酶活性最小；菌盖与菌褶处酶活性较大。此外，PPO 相当稳定，甚至在土壤中已腐烂的植物残渣上都可检测到PPO的活性。

2.2 分子结构

PPO 通常先以无活性的前体形式存在。前体一般由N-端导肽、中间高度保守的Cu结合区和C-端疏水区3部分组成。PPO的Cu结合区是该酶的主要功能区，其他部分则对酶的构象、高级结构的形成和维持起作用。

N-端导肽是叶绿体蛋白的典型特征，它能指导PPO蛋白质前体进入类囊体膜，保守性很低。中间高度保守的Cu结合区富含His残基，每个Cu与3个His 残基以配位键相连，形成了有特定三维结构的活性部位[6]。而PPO的C-端是疏水性的。有文献报道葡萄浆果PPO前体加工过程中常切掉一个16.2 kD无活性的C-端[7]。2.3 活性的诱导

通常PPO是以非活性的前体态存在于类囊体中，而它的酚底物在液泡中，这种空间隔离只有被打破引起亚细胞区域化改变时，PPO才表现出酶活性。许多生物、非生物因素都可诱导PPO 活性，例如：机械损伤、细菌真菌感染、信号分子（如系统素、茉莉酸甲酯、水杨酸、乙烯、cAM P）处理等。

3 PPO与酶促褐变

3.1 酶促褐变机理

酶促褐变是酚酶催化酚类物质形成醌及其聚合物的反应过程。植物组织在含有酚类物质，在完整的细胞中作为呼吸传递物质，在酚-醌之间保持着动态平衡，当细胞组织破坏以后，氧就大量侵入，造成醌的形成和其还原反应之间的不平衡，于是发生了醌的积累，醌再进一步氧化聚合，就形成了褐色色素，称为黑色素或类黑精。

PPO能催化单元酚和二元酚等多元酚到联苯酚的羟基化，以及羟基酚到醌的

脱氢反应。醌在植物体内自身聚合，或与细胞内的蛋白质反应,产生黑色或褐色的沉积物,被认为是植物体酶促褐变的主要原因[8]。

3.2 酶促褐变对食品影响

3.2.1 抵抗病原菌

对植物而言，PPO在抵抗微生物和病毒性侵染方面发挥着作用。植物对病原菌的防御系统大致可分为三道防线。第一道防线是一些结构上的因素如细胞壁等；第二道防线是感染或受伤位点被局部激活来阻止病原菌的扩散。一旦病原菌攻破这两道防线，宿主感染位点及其周围的细胞局部死亡（过敏反应），使病原菌被限制在原侵染部位不能扩散。过敏反应通常伴随着系统获得性抗性（免疫性）的增加；免疫性就是植物防御的最后一道防线。免疫性是通过诱导一些防御相关蛋白的形成或活性增加来获得的，PPO 就是其中很重要的一种。即PPO在经历次级聚合反应中形成的醌产生黑色的不溶性聚合物,这些聚合物充满了植物组织，起着阻止感染蔓延的屏障作用，从而保证果蔬等农产品食品的固有品质。

3.2.2 良好感官品质的形成

PPO 对食品和饮料生产也会产生重大影响，它不仅影响食品和饮料的色泽,也影响其品质，特别是在制作绿茶、红茶、烤烟和水果类饮料的过程中更为突出[9,10] 。

茶叶中所有化学成分中，儿茶素与多酚氧化酶尤为重要，除绿茶、黄茶外，各种茶叶的加工都是基于儿茶素在多酚氧化酶催化下的氧化作用，即所谓的“发酵”过程。据文献，PPO引起的一系列次生反应是乌龙茶制造过程中特有的化学变化，是乌龙茶加工中重要的氧化还原酶类，PPO活性通过影响做青方法从而对成茶的滋味和香气形成起着重要作用[11]。在啤酒生产过程中，由于多酚物质会影响啤酒的外观稳定性中的非生物稳定性和风味稳定性，故PPO与啤酒风味陈化也紧密相关[12]。

3.2.3 不良感官品质的形成

多酚氧化酶是引起果蔬酶促褐变的主要酶类，PPO催化果蔬原料中的内源性多酚物质氧化生成黑色素，严重影响制品的营养，风味及外观品质。

如苹果由于富含酚类物质而VC 含量相对较低，所以在有高活力的多酚氧化酶（PPO）的催化作用下，苹果制品在加工中很易发生酶促褐变。在混浊苹果汁

的制备过程中，有70%以上的褐变发生在破碎过程中[13]。酶促褐变降低了苹果的营养价值，改变了其风味[14]。

4 食品生产中酶促褐变的抑制

PPO对于果蔬保鲜和采后加工具有重要意义，为避免褐变造成的食品品质下降，加工过程中PPO酶的钝化处理一直是研究的热点由于PPO抑制在防止水果和蔬菜褐变方面的重要作用，抑制PPO的活性或消除酶促反应的发生条件能较好地保持鲜果的色泽、风味及营养。酶促褐变的发生需要三个条件：底物（多酚类物质）、氧介质、PPO[15]。实际操作中从食品中除去PPO的底物（多酚类物质）不仅困难，而且不现实。因此比较有效的是抑制PPO活性，其次是防止与氧接触。

4.1 温度调控

瞬时高温可使包括PPO在内的酶钝化，热处理是生产中常用钝酶方法之一，通常以PPO作为热烫指示剂，常以蒸汽或热水为湿媒介，通过热烫或漂烫工艺用于压榨果汁的预处理[16]，提高产品中功能成分含量，改善速冻食品的感官品质和风味，不过在工业中漂烫的最佳终点判断至关重要。不同的果蔬品种，具体处理参数不同，适度的处理时间内亦可提高出汁率，时间过长则会导致营养成分流失[17]。

此外，冰温保藏也可以抑制PPO 酶活，减少总酚含量的下降趋势，对果蔬的保鲜有着明显的作用。冰温保藏，是将食品贮藏在0℃以下至各自的冻结点的范围内的保鲜方式，继冷藏和气调之后，成为第三代保鲜技术。冰温贮藏作为一种新型的物理保鲜方法，研究表明[18]其对莲藕保质期比冷藏要长，并且冰温贮藏后的果实以低温冷链方式出库后其PPO在货架期内始终处于较低水平[19]，对于延长鲜食果蔬的货架寿命收效显著。

4.2 酸度调控

大多PPO最适pH值在6.0—7.4范围，在pH值降至4.0以下，PPO几乎完全失去活性。因此利用调酸降低pH值的方法抑制果蔬褐变，是果蔬加工中常用的方法。可采用加入适量的pH调节剂如柠檬酸、苹果酸、醋酸等降低pH值，抑制褐变发生率，多为两种或两种以上复合使用，且符合食用级标准。有报道称抗坏血酸、柠檬酸、柠檬汁和橘子汁对皇家嘎拉苹果PPO有很好的抑制作用，达极显著水平[20]。尤其是柠檬汁和橘子汁在嘎拉苹果加工中的应用是天然的、安全无害，为

利用酸度来调控天然果蔬制品的PPO活性以抑制酶促褐变提供了一定参考依据。

柠檬酸是使用最广泛的的食用酸，对酚酶有降低pH值和螯合酚酶的Cu辅基的作用，但作为褐变抑制剂来说，单独使用柠檬酸的效果不大，通常需要与抗坏血酸或亚硫酸联用。苹果酸是苹果汁中主要有机酸，在苹果汁中对酚酶的抑制作用要比柠檬酸强得多。乔勇进等[21]研究表明pH对贮藏梨汁褐变影响较大，随着pH降低，梨汁褐变度越大。

抗坏血酸是比柠檬酸和苹果酸更加有效的酚酶抑制剂，即使浓度极大也无异味，对金属无腐蚀作用，且作为一种维生素，其营养价值也是尽人皆知的。Vc 不仅可降低环境pH值，它与异Vc钠既能抑制PPO本身的催化作用，同时又能还PPO形成的产物醌为酚，并且还能消耗反应体系中的氧。在实际生产中较为理想的抑制剂是Vc，这是由于Vc 是水果中的成分，安全性高，因此在工业生产中可以广泛地应用。

4.3 二氧化硫及亚硫酸盐

二氧化硫及亚硫酸盐对果蔬的酶促褐变的抑制效果很好，而且持续时间长。它们既可以直接作用于酶本身，降低对单酚和二酚类的催化反应活性，又可与反应中生成的醌类物质结合形成无色物质。同时，亚硫酸还有漂白和抑制微生物生长的作用[22]。虽然二氧化硫和亚硫酸盐对果蔬中的褐变有高效的抑制作用，但是亚硫酸盐用于食品中会对人的健康产生影响，已经被限制使用，所以人们都致力于研究亚硫酸盐的替代品。

4.4 L-半胱氨酸

L-半胱氨酸（L-Cys）是一种强效抑制剂，其抑制褐变的机制归纳起来为：一是醌类物质能与半胱氨酸形成无色的复合物，阻止了醌类物质聚合而不能形成的色素物质；二是半胱氨酸可通过与PPO活性位点的铜离子不可逆结合而抑制酶活性，或者替代PPO活性位点的组氨酸残基；三是半胱氨酸并非阻止PPO氧化酚类，而是阻止酚类的聚合[23]。但是L-Cys会产生令人不愉快的气味，破坏产品风味，所以近年来致力于研究L-Cys与其他抑制剂联合使用的效果。周向军等人[24]以邻苯二酚为底物,在413nm处测定黑美人马铃薯多酚氧化酶(PPO)的活性，发现L-Cys对PPO酶促褐变的抑制作用强于抗坏血酸。

4.5 曲酸

曲酸及其衍生物对酪氨酸酶（或称多酚氧化酶PPO）有强烈抑制作用，20μg/mL浓度的曲酸就可抑制不同来源的酪氨酸酶的70%~80%的活力。另外曲酸具有抗氧化性，它的酚羟基可以被还原；它还可与Fe、Cu、Mn等金属离子发生螯合反应。刘波[25]发现曲酸在苹果汁褐变中的抑制率可以达到70%~80%。

4.6 4-乙基间苯二酚（4-HR）

4-己基间苯二酚（4-HR）是一种新型抗氧化剂，是酪氨酸酶的有效抑制剂，其化学稳定性相当好，安全性高，对酚酶抑制力强，已被推荐用于防治果蔬产品的酶促褐变，具有良好的应用前景。谢绍萍等报道，当4-HR添加量≥0.1%时，对香蕉浆液的护色有较好的效果[26]。4-己基间苯二酚也被证实能够有效地抑制蘑菇、鲜切梨、马铃薯的酶促褐变。

5 展望

目前对影响酶促褐变的各因素对褐变抑制效果的研究相对较多，褐变机理也比较复杂，目前尚未完全弄清。关键问题集中在对PPO及其底物的研究以及农作物采后贮藏环境对酶促褐变的影响。酶促褐变与果实衰老有密切关系，而PPO 合成基因的表达可能与衰老有关。随着生物技术的发展，对PPO 的深入研究有

望从分子水平上搞清酶促褐变的机理，为控制酶促褐变提供新方法。如选育出PPO酶活性相对较低的品种、改变控制PPO的基因而改变PPO的活性等都将是酶促褐变抑的方向之一.。此外，对褐变抑制剂等因素对果蔬等天热或加工食品的味、质地、组织、异味等感官指标影响的研究也将会越来越多。

参考文献

[1] 贺立红, 宾金华. 高等植物中的多酚氧化酶[J]. 植物生理学通讯, 2001, 37(4): 340-345

[2] 许传俊, 李玲. 植物多酚氧化酶研究进展[J]. 生命科学研究, 2002, 6(1): 45–55

[3] 谢春艳, 宾金华, 陈兆平. 多酚氧化酶及其生理功能[J]. 生物学通报,1999, 34(6): 11-13

[4] 王曼玲, 胡中立, 周明全, 等. 植物多酚氧化酶的研究进展[J]. 植物学通报, 2005, 22(2):

215-222

[5] 姜洪波, 童金华, 林启训, 等. 茶树菇多酚氧化酶动力学特性研究[J]. 保鲜与加工, 2006,

6(5): 23-24

[6] Shi C, Dai Y, Xu X. The purification of polyphenol oxidase from tobacco[J]. Protein

Expression and Purification, 2002, 24: 51-552

[7] Robinson SP, Dry IB. Broad bean polyphenol oxidase a 60 kiloalton protein susceptible to

proteolytic cleavage[J]. Plant Physiology, 1992, 99: 317-323

[8] Peter W T, Ian B D. Polyphenol oxidase in potato[J]. Plant Physiol, 1995 (109): 525-531

[9] 戴亚, 施春华, 唐宏, 等. 烟草多酚氧化酶分离提纯及性质研究[J]. 中国烟草学报, 2001,

7(4): 7-12

[10] 黄建韶, 张洪, 田红现. 苹果中多酚氧化酶的性质[J]. 食品与机械, 2001, 83: 21-22

[11] 黄皓, 毛志方, 涂云飞, 等. 做青过程中重要品质关联酶活性变化研究[J]. 茶叶, 2007,

33(4): 207-210

[12] 胡彦营. 啤酒中的酚类物质及其与啤酒质量的关系[J]. 济宁师范专科学校学报. 2006,

27(6): 17-25

[13] 赵光远, 王璋, 许时婴. 混浊苹果汁加工过程中的酶促褐变及其防止的研究[J]. 食品工

业科技, 2003, (10): 57-61

[14] 赵光远, 张陪旗. 混浊苹果汁生产中的酶促褐变及其防止研究进展[J]. 食品科学. 2006,

27(11): 602-605

[15] 杨光宇, 牟德华. 果蔬汁多酚氧化酶酶促褐变机理及其控制研究进展[J]. 饮料工业,

2009, 12(8): 4-5

[16] 黄俊丽, 张慜. 高温蒸汽瞬时漂烫对黑牛肝菌酶活和品质影响的研究[J]. 食品与生物技

术学报, 2010, 29(5): 653-658

[17] 田金辉, 许时婴, 王璋. 热烫处理对黑莓果汁营养成分和多酚氧化酶活力的影响[J]. 食

品与发酵工业, 2006, 32(4): 134-137

[18] 黄利刚, 李慧娜, 张亮, 等. 冰温贮藏对莲藕品质的影响[J]. 华中农业大学学报, 2008,

27(2): 317-320

[19] 梁庆沙, 冷平, 贺岩龙, 等. 冰温贮藏后“大久保”桃不同出库方式对果实细胞壁组分

及相关酶活性的影响[J]. 中国农业大学学报, 2010, 15(1): 14-18

[20] 王琼波, 陈琦, 冯金丹. 嘎拉苹果多酚氧化酶性质及其抑制方法研究[J]，河南农业科

学, 2011, 40(6): 118-121

[21] 乔勇进, 徐芹, 方强, 等. 温度、pH值对梨汁非酶褐变影响的研究[J]. 上海农业学报,

2008, 24(3): 6-9

[22] 郝慧英, 赵光螯, 徐岩, 等. 苹果中多酚氧化酶的性质[J]. 无锡轻工大学学报, 2003,

22(1): 7-11

[23] NEGISHI O, OZAWZ T. Inhibition of enzymatic browning and protection of sulfhydrl

enzymes by thiol compounds[J]. Phytochemistry, 2000(54): 481-487

[24] 周向军, 高义霞, 袁毅君, 等. “黑美人”马铃薯多酚氧化酶的特性研究, 食品工业科技,

2011, 32(01): 115-117

[25] 刘波. 曲酸对苹果汁酶促褐变抑制作用的研究[J]. 四川食品与发酵, 2007(5): 39-41

[26] 谢绍萍, 欧阳学智. 香蕉加工过程酶促褐变控制的研究[J]. 电子科技大学学报, 2003,

32(3): 641-644