结核感染T细胞斑点试验
结核感染T细胞斑点试验在疑似结核患者诊断中的应用
结核感染T细胞斑点试验在疑似结核患者诊断中的应用目的：比较结核感染T细胞斑点试验（T-SPOT. TB）和结核抗体试验（TB-Ab）在疑似结核患者诊断中的敏感性和特异性，探讨两者在结核感染中的诊断价值。
方法：对疑似结核的74例患者进行前瞻性研究，分别采用T-SPOT. TB和TB-Ab 试验，比较二者对结核诊断的敏感性、特异性、阳性预测值（PPV）、阴性预测值（NPV）、阳性似然比（LR+）和阴性似然比（LR-）。
结果：74例疑似结核患者确诊结核52例。
T-SPOT. TB试验在敏感性、特异性、PPV、NPV等方面显著优于TB-Ab（P＜0.05）；T-SPOT. TB的LR+值明显高于TB-Ab，LR-值明显低于TB-Ab。
结论：T-SPOT. TB试验是诊断结核的快速敏感方法，显著优于结核抗体试验（TB-Ab），更适于作为结核筛检试验，在结核疾病诊断中有着重要价值。
标签：结核；结核感染T细胞斑点试验；结核抗体试验结核病的快速诊断是结核病防控工作中的一个难题，我国近年来结合感染率有上升趋势，结核抗体试验（TB-Ab）对于活动性结核的诊断价值低。
结核感染T细胞斑点试验（T-SPOT. TB）即γ干扰素释放试验是一种结核诊断的新方法，这种试验采用酶联免疫斑点方法定量检测外周血单核细胞在结核菌特异性抗原刺激下释放γ干扰素的水平，用于诊断潜伏性结核分枝杆菌感染以及结核病。
本研究采用T-SPOT. TB和TB-Ab两种检测方法在疑似结核病人中进行对比研究，探讨二者在结核诊断中的敏感性和特异性。
1 资料与方法1.1 一般资料：2011年8月至2014年8月在我科住院疑似或待排结核患者74例，在其他详细检查基础上同时行T-SPOT. TB检测和TB-Ab检测。
1.2 方法：⑴T-SPOT. TB试验：根据T-SPOT. TB试剂盒（上海复兴医药股份有限公司）的说明书进行以下步骤：分离外周血单核细胞，与结核特异性抗原相对分子质量为6000的早期分泌抗原靶和相对分子质量为10000的培养滤液蛋白在抗γ-干扰素抗体预包被的板中共同孵育，37℃放置16-20小时。
结核感染T细胞斑点试验在结核病临床诊断中的应用
４７２７(
２０２０)
０６－００７１－０５
０．
１３７６４/
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２０２０．
０６．
０１６
DOI:１
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通信作者:黄鹏,副教授,
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７２
南昌大学学报(医学版)２０２０ 年 １２ 月,第 ６０ 卷第 ６ 期
都有一定的局限性.近年新发展的 TＧSPOT．
TB 具
有灵敏度高、特异 度 高、结 果 快 速 等 优 点,已 广 泛 地
应用 于 临 床 结 核 病 的 诊 断
性抗原刺激分泌 IFNＧγ 的 T 淋 巴 细 胞 数 量 [１３]. 目
前IGRA 的检 测 在 临 床 实 验 室 中 使 用 最 广 泛 的 检
测方法是 TＧSPOT．
TB.
TＧSPOT．
TB 检 测 的 基 本 原 理 是 采 用 ELI
骨科结核感染T细胞斑点检测(SPOT)课件
根据感染部位，骨科结核感染可 分为脊柱结核、关节结核和骨结 核等。
临床表现与诊断
临床表现
早期症状可能不明显，随着病情发展 可能出现疼痛、肿胀、活动受限等症 状。
诊断
结合临床表现、影像学检查和实验室 检查进行诊断，其中T细胞斑点检测（ SPOT）是一种常用的实验室检查方法。
骨科结核感染的流行病学
采用其他检测方法进行确认。
05 SPOT检测的案例分享
案例一
患者情况
一位中年男性，因髋关节疼痛就诊，疑似髋 关节结核感染。
诊断结果
结合患者临床表现和SPOT检测结果，最终 诊断为髋关节结核感染。
SPOT检测
对患者进行T细胞斑点试验（SPOT），检测 结果显示阳性，提示存在结核感染。
治疗方案
患者接受抗结核药物治疗，并进行髋关节手 术治疗，术后恢复良好。
案例二
患者情况
一位青年女性，已确诊为脊柱结核感 染。
02
SPOT检测
对患者进行T细胞斑点试验（SPOT）， 检测结果显示阳性，提示结核感染活 动期。
01
治疗方案
继续抗结核药物治疗，并定期进行复 查。
05
03
病情变化
经过一段时间的抗结核药物治疗后， 患者病情得到控制，再次进行SPOT检 测。
04
检测结果
结合其他技术
扩大应用范围
探索将SPOT检测与其他诊断技术相结合， 提高诊断的全面性和准确性。
研究SPOT检测在骨科其他疾病诊断中的应 用价值，拓展其应用领域。
感谢您的观看
THANKS
监测疗效
治疗后，SPOT检测可以监测治疗效 果，评估病情恢复情况。
预测复发
通过长期监测SPOT检测结果，可以 预测结核感染的复发风险。
结核感染T细胞斑点试验在肺结核中的诊断价值
结核感染T细胞斑点试验在肺结核中的诊断价值抗结核治疗的基本原则是早期、联合、适量、规律、全程，如何早期诊断结核病是结核病防控工作中的一个难题，我国结核感染率和卡介苗接种率均高，结核菌素试验对于活动性结核的诊断价值低，同时不能排除非结核分枝杆菌感染。
近年来，有一种用于诊断结核分枝杆菌感染的新方法，即结核感染T细胞斑点试验，用于诊断潜伏性结核分枝杆菌感染及结核病。
本研究采用结核感染T细胞斑点试验和结核菌素试验两种检测方法在疑似肺结核病人中进行对比研究，探讨两者在结核诊断中的敏感性。
现将结果报告如下。
1.资料与方法1.1一般资料：选择2014年9月-2016年12月在我科住院胸片或者胸部CT疑似肺结核的患者53例，其中男45例，女8例，年龄19-86〔平均（46.94±18.77）〕岁，在其他详细检查基础上，同时作结核感染T细胞斑点试验、结核菌素试验、结核抗体、痰找抗酸杆菌检测，根据临床表现、影像学检查、病原学检查、组织病理学以及抗结核试验治疗追踪随访。
最后确诊14例，排除肺结核4例，临床诊断35例。
临床诊断+确诊肺结核患者共49例，其中男42例，女7例，年龄19-86〔平均（46.53±18.46）〕岁。
1.2方法：结核感染T细胞斑点试验检测方法根据试剂盒说明书步骤进行操作。
首先抽取所有患者外周静脉血液5ml，分离出外周血单个核细胞（PBMC）。
在已包被抗IFN-γ抗体微量板的4个孔中，分别加入不同的阳性对照物：植物血凝素，阴性对照细胞营养液，A 抗原早期分泌性靶抗原6（ESAT-6）以及B抗原滤液培养蛋白10（CRP-10）.然后依次向每孔加入2ⅹ105浓度PBMC，放置在37.0℃条件下CO2培养箱内孵育处理20小时。
PBS溶液洗脱处理后再加入碱性磷酸酶标记的抗γ干扰素抗体，在室温条件下孵育处理2小时，PBS 溶液洗脱处理后显色，采用PBS溶液终止反应。
最后仔细计数斑点数。
结果判断：空白对照孔斑点数为0-5个时且（抗原A或抗原B孔的斑点数）-（空白对照孔斑点数）≥6，判断为阳性；空白对照孔斑点数为6-10个时且（抗原A或抗原B孔的斑点数）≥2ⅹ（空白对照孔斑点数），判断为阳性；上述标准不符合且阳性质控对照孔正常时检测结果为“无反应性”。
T-SPOT介绍
Meier et al EJCMID 2005 24;529-536
95.9% (70/73)
国外文献汇总——灵敏度
国外文献汇总——特异性
实验效果图
阴性结果
阳性结果
空白对照 抗原A ESAT-6 抗原B CFP10 阳性对照 （PHA）
报告单
根据抗原A或/和抗原B孔的反应判断结果: 检测结果为“有反应性”，参照以下标准： 空白对照孔斑点数为0-5个时且（抗原A或抗原B孔的斑点数）-（空白对照孔斑点数）≥6 空白对照孔斑点数大于6个时且（抗原A或抗原B孔的斑点数）≥2×（空白对照孔斑点数） 如果上述标准不符合且阳性质控对照孔正常时检测结果为“无反应性”
84.2% (32/38)
Bosshard et al. Respir Med. 2009; 103(1):30-4.
98.4% (62/63)
Higuchi Med Microbiol Immunol. 2009; 198(1):33-7
95.9% (47/49)
Kim et al. Am J Med 2009 ;122(2):189-95
小结
活动性结核病与潜伏性结核感染的区别 LTBI危险因素 结核中有20%左右的肺外结核，诊断困难 传统结核诊断方法不能满足临床需要
内容
结核病基础概念 T-SPOT.TB 产品知识 T-SPOT.TB 临床应用 病例分享
T-SPOT®.TB原理
T-SPOT®.TB原理：结核感染者体内存在特异的效应T淋巴细胞，效应T淋巴细胞再次受到结核抗原（ESAT-6，CFP 10）刺激时会分泌多种细胞因子（ IFN-γ ）。因此，检测效应T淋巴细胞可用于结核病或结核潜伏感染者的诊断 列入美国、英国等欧美20多个国家结核诊疗指南 美国CDC推荐：BCG接种人群结核感染检测首选 国内风湿科/消化科指南
结核感染T细胞斑点试验
结核感染T细胞斑点试验
第9页
谢谢
结核感染T细胞斑点试验
第10页
▪ 萨斯分枝杆菌( My cobacter ium kans asii ) 、海
分枝杆菌(My cobacter ium mar inum ) 、斯氏分枝
杆菌( My cobacter ium sz ul gai ) 等少数分枝杆
菌中也存在完整RD1区，编码ESAT 6 和CFP 10,
可造成检测结果成假阳性。
白。在卡介苗菌株和大部分环境中分枝杆菌基因中则缺
乏次序列。
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第4页
T-SPOT-TB—示意
阴性对照
阳性对照
A试验组
B试验组
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第5页
T-SPOT-TB—解释
▪ 非黄金标准
▪ 定性检测而不是定量检测
▪ 敏感性95.3%-98.8%
▪ 特异性94.1%-100%
T-SPOT-TB—几个概念
▪ ELISPOT（enzyme-linked immunospot assay,）是一个新
型免疫酶技术，它是从单细胞水平检测分泌抗体细胞或
分泌细胞因子细胞。（简单说：能够数出分泌特异因子
细胞个数）
▪ ESAT-6和CFP-10蛋白：存在结核分枝杆菌及少数致病非
结核分枝杆菌中名为“RD1”基因序列，编码产生两种蛋
2.效应T细胞随结核杆菌去除而消失，其阴性及阳性
结果可作为评定治疗效果伎俩之一 。
结核感染T细胞斑点试验
第8页
T-SPOT-TB—应用
▪ 在潜伏性结核杆菌感染者筛选中
1.敏感性优于结核菌素试验，且不受卡介苗接种影响。
2.较少受到其它分支杆菌感染影响。
结核感染T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)在HIV合并肺结核人群中的诊断性能研究
根 据 临 床 表 现 （发 热 、咳 嗽 、胸 痛 、呼 吸 困 难 等 ）、 影 像 学 表 现 ( 斑 片 、结 节 、纵 隔 淋 巴 结 肿 大 等 ）以及病 原 学 检 测 结 果 ，病 原 学 检 测 方 法 包 括 痰 涂 片 、痰培 养 、分 子 生 物 学 检 测 ，其中 任意 一项结果阳性定义为
2. 2 T-SPOT.T B 与分子生物学检测结果比较分析 进 行 分 子 生 物 学 检 测 的 样 本 包 含 4 2 例 Gene-
Xpert检 测 样 本 以 及 5 6 例 L A M P 检 测 样 本 ，共计 98 例 .其 按 照 临 床 诊 断 结 果 分 为 肺 结 核 组 44 例.肺 部 其 它 疾 病 组 5 4 例 ，将 其 与 T-SPOT. T B 的结果进 行 比 较 显 示 ：T-SPOT. T B 检 测 的 敏 感 性 77. 2 7 % ( 3 4 / 4 4 ) 高 于 分 子 生 物 学 检 测 敏 感 性 47. 7 3 % ( 2 1 /
195例 确 诊 或 临 床 诊 断 为 H IV 阳性合并肺结 核 的 患 者 中 ，T -S PO T .T B 检 测 阳 性 1 4 3 例 ，敏感性 为 73. 3 3 % ; 3 1 7 例 H I V 阳 性 肺 部 其 它 疾 病 患 者 中 ， T -SPOT.T B 检 测 阴 性 2 7 5 例 ，特 异 性 为 86. 7 5 % 。 见 表 1。
表 1 H I V 合 并 结 核 病 患 者 T-SPOT. T B 检测结果
结核感染T细胞检测(T-SPOT.TB)简介与临床应用
结核菌的特性和临床检测的现状 又是如何？
1、结核病疫情严重
全球 • 20亿人口感染结核 • 现有活动性结核病患者2000万 • 新增活动性结核病人约900万/年 • 每年200-300万患者死亡
我国
结核病高负担国家之一，患者人数仅次于印 度，居全球第二位
• 约5.5亿人口感染过结核菌 • 现有活动性肺结核患者450万 • 新发患者145万/年 • 死亡人数13万/年
- 胸部的 X-光或 CT 扫 描显示异常
- 肺外结核难以诊断 (特别是儿童)
活动性结核
• 新发TB病例来自潜伏性结核感 染人群
• 潜伏性结核感染（latent TB Infection, LTBI）人群数量巨 大——“定时炸弹”
全面性
目前检测方法是否满足临床需求？
• 细菌学 • 免疫学
灵敏度 性能不稳定
结核感染T细胞检测（T-SPOT.TB）简介 与临床应用
什么是结核病
• 结核病是由结核杆菌感染引起的慢性传染 病。结核菌能侵入全身各个器官，但80% 发生在肺部，常称肺结核。
• 结核病又称为“痨病”和“白色瘟疫”， 是一种古老的传染病。
• 人与人之间呼吸道传播是本病传染的主要 方式。传染源是接触排菌的肺结核患者， 而肺外结核病则不具有传染性。
暴露程度不足，结核杆菌被机体免疫力清除
- 没有症状,结核杆菌仍旧 存在而不能被侦测
- X-光/ CT 扫描显示正常
- 没有抗体应答
- 诊断困难
- 传统的结核感染检测只有 TST（PPD）
机体被感染
受机体免疫力抑制 没有临床症状
终身处于感染状态
潜伏感染
5%
5%
再次激活
有临床症状 具有传染性
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阴性结果
空白对照
抗原A ESAT-6
抗原B CFP10
阳性对照 （PHA）
阳性结果
一个斑点=一个结核效应淋巴细胞
二 、Pa结rt 12核现 中T-感有 国SP检 结染O测 核T原T手 病理细段 疫不 情胞能 现斑满 状足点临试床需验求优 点
1、T-SPOT的高特异性
结核特异性抗原（ESAT-6、CFP-10）
涂片 镜检
• 耗时长4-8周 • 检出低50% • 肺外结核难 • 易受环境污染
细菌培养
接触史 临床症状 病原/病理
结核 诊断
X射线
抗体检测
• 特异性差 • 误诊肺炎、肺癌 • 肺外结核难
• 假阳/假阴性高； • 不能区分既往感染
和发病病人 • 卡介苗影响 • 2011WHO建议禁用
分子诊断
• 操作复杂技术要求高 • 肺外结核难取样 • 易受外源性DNA污染
一 、Pa现rt 1有现 中检有 国检 结测测 核手手 病段 疫段不 情不能 现满 状能足满临床足需临求 床 需 求
假阴性
免疫力低下或HIV人群，新生儿、老弱人群、药物影响
假阳性
BCG接种人群，其他环境分支杆菌感染，交叉污染
难诊断
肺外结核感染、儿童结核感染、潜伏性结核感染等
医疗事故
无法排筛结核感染，造成生物制剂或移植手术治疗后病患免疫 力下降，引起结核，形成医疗事故
步骤3
结核特异抗原（ESAT-6/CFP 10）刺激结核特异的效 应T淋巴细胞使其分泌γ-干扰素，孵育。
步骤4
效应T淋巴细胞分泌的γ-干扰素与膜板预包 被的抗γ-干扰素抗体结合并固定在细胞周围
洗板，加入酶标二抗，孵育1h
洗板，加入显色液，观察结果
1个斑点=1个效应T细胞
二 、Pa结rt 12核现 中T-感有 国SP检 结染O测 核T原T手 病理细段 疫不 情胞能 现斑满 状足点临试床需验求效 果 图
有临床症状 具有传染性
- 结核杆菌可以通过涂片、培养 检测出
- 胸部的 X-光或 CT 扫描显示 异常
- 肺外结核难以诊断 (特别是儿童)
活动性结核
一 、Pa结rt 1核中病国结常核规病疫检情测现状技 术
• 卡介苗交叉反应 • 不能区分NTM • 免疫力低下人群敏
感性差
结核菌素皮试
• 不能区分NTM • 检出率低20% • 肺外结核难
每年新发结核病患者比例
全世界约三分之一的人群感染结核分支杆菌，每年约有900万新发病例， 150万人死亡；在传染病死亡中占第
二位。
中国是结核病高发区，感染人数5.5亿；发病数居全球第二130万/年；死亡人数25万/年仅次于艾滋病；耐药患
者10万/年
一 、Pa结rt 1核中病国结免核疫病疫方情式现状
二 、Pa结rt 12核现 中T-感有 国SP检 结染O测 核T原T手 病理细段 疫不 情胞能 现斑满 状足点临试床需验求步 骤
步骤1
步骤2
用BD CPT 管或Ficoll提取液收集外周血单个核细胞 并计数，加入至 4 个微孔（分别为阳性对照孔、A 孔： ESAT-6、B 孔：CFP-10 和阴性对照孔）
• r干扰素是结核分枝杆菌感染后机体免疫应答 中最重要的细胞因子
二 、Pa结rt 12核现 中T-感有 国SP检 结染O测 核T原T手 病理细段 疫不 情胞能 现斑满 状足点临试床需验求原 理
酶联免疫吸附试验（ELISA）
全血检测或结核感染T 细胞免疫检测
检测γ-干扰素水平
γ-干扰素释放试验分 析技术（IGRA）
结核感染T细胞斑点试验
目录
CONTENTS
1 结核病概况 2 结核感染T细胞斑点试验 3 T-SPOT 临床应用
PART ONE
结核病概况
一 、Pa结rt 1核中病国结流核行病疫病情学现状
中国 15%
India 30%
Other s 28%
结核病由结核分枝杆菌引起的慢性肉芽肿炎；以肺结核最常见，也可见于全身各器官。
酶联免疫斑点技术（ELISPOT）
细胞检测或结核感染T 细胞检测
检测能够释放γ-干扰素的效应T细胞数量
T-SPOT技术： 利用结核杆菌感染者外周血单个核细胞（PBMC）中存在T淋巴细胞，这些淋巴细胞在受到结核特异抗原刺激 后分泌r干扰素而设计的T淋巴细胞免疫斑点试验。 检测外周血中受结核特异抗原(ESAT-6，CFP -10)刺激释放r干扰素的T淋巴细胞，经酶联免疫显色后，通过 ELISPOT分析系统对斑点进行计数，1个斑点代表一个细胞，计算出抗原特异性细胞的频率。
➢ 来自结核分枝杆菌基因组RD1编码 ➢ 所有的卡介苗均缺失RD1 NTM干扰
（除堪萨斯分枝杆菌、海分枝杆菌、戈登分枝杆菌、苏氏分支杆菌）
特异性 美国FDA临床研究数据：特异性97.1%(297/306) 国内临床研究数据：特异性94.1%(478/508)
二 、Pa结rt 12核现 中T-感有 国SP检 结染O测 核T原T手 病理细段 疫不 情胞能 现斑满 状足点临试床需验求原 理 γ-干扰素释放试验分析技术（IGRA）
• 结核感染的免疫应答反应以细胞免疫为主， 结核感染后体内长期存在抗原特异性的记忆 性T细胞
• 当再次遇到结核特异性抗原（ESAT-6,CFP-10） 刺激时，能迅速活化增殖，释放r干扰素
接触活动性结核病患者
30%
- 没有症状,结核杆菌仍旧存在而不能被 侦测
- X-光/ CT 扫描显示正常 - 没有抗体应答 - 诊断困难 - 传统的结核感染检测只有 TST（PPD）
机体被感染
受机体免疫力抑制 没有临床症状
潜伏性结核
终身处于感染状态
70%
5% 5% 再次激活
暴露程度不足，结核杆菌被机体清除
无论活动性结核还是潜伏性结核均需要足够快速、灵敏、简便的检测方法
PART TWO 结核感染T细胞斑点试验
二 、Pa结rt 1核现 中感有 国检 结染测 核T手 病细段 疫不 情胞能 现斑满 状足点临试床需验求
结核感染T细胞斑点试验 T-SPOT ➢结核分枝杆菌感染的体外免疫诊断新方法 ➢具有极高的敏感性及特异性 ➢诊断迅速
二、结核感染T细胞斑点试验优点
2、T-SPOT的灵敏性
灵敏度： 美国FDA临床研究数据： 灵敏度95.6%(175/183) 国内临床研究数据： 灵敏度95.3%(624/655)
T-SPOT检测单个反应细胞