细胞信号转导研究方法
细胞信号转导途径的研究方法及应用
细胞信号转导途径的研究方法及应用细胞信号转导途径是细胞内外信息传递的重要机制，涉及多种生物学过程，如细胞生长、分化、凋亡等。
了解这些途径的研究方法对于理解疾病发生机制、药物研发以及治疗方案的设计至关重要。
本文将介绍几种常用的细胞信号转导途径研究方法及其在科学研究和临床应用中的意义。
1. 细胞系与培养细胞系的选择对于研究特定信号转导途径至关重要。
常用的细胞系包括HEK293、HeLa、HepG2等。
通过培养这些细胞系，可以在受控条件下进行实验，如检测信号分子的表达、鉴定信号通路的激活状态等。
2. 免疫沉淀（Immunoprecipitation）免疫沉淀是一种常用的蛋白质相互作用研究方法，也可用于分析信号转导途径中的蛋白复合物。
通过特定抗体识别目标蛋白，将其与抗体结合，再利用蛋白A/G琼脂糖或其他载体沉淀出蛋白复合物，最后通过免疫印迹等技术分析蛋白的相互作用及其在信号传递中的作用。
3. 免疫印迹（Western Blot）免疫印迹是检测蛋白质表达水平和翻译后修饰的常用方法之一。
在研究信号转导途径中，可以通过免疫印迹技术检测特定蛋白的表达及其磷酸化、乙酰化等修饰状态，从而了解信号通路的活性。
4. 实时定量PCR（Real-time Quantitative PCR）实时定量PCR可用于检测信号转导途径中相关基因的表达水平变化。
通过合适的引物设计和荧光探针，可以准确快速地测定目标基因的相对表达量，从而揭示信号通路在转录水平的调控机制。
5. 分子克隆与表达分子克隆技术可用于构建信号转导途径中关键基因的重组表达载体。
通过在适当的细胞系中表达这些基因，可以研究其在信号传递过程中的功能及相互作用。
6. 生化分析技术包括质谱分析、核磁共振等生化分析技术在细胞信号转导途径研究中也有重要应用。
这些技术可以用于鉴定信号分子的后转录后修饰、亚细胞定位以及与其他生物分子的相互作用等。
细胞信号转导途径的研究方法在科学研究和临床应用中发挥着重要作用。
细胞凋亡的信号转导通路及其研究方法
细胞凋亡的信号转导通路及其研究方法细胞凋亡是一种生理现象，是细胞主动死亡的过程。
在细胞凋亡过程中，细胞释放信号分子，引起周围细胞的反应，从而有效地控制组织的生长和维护生态平衡。
细胞凋亡的信号转导通路是一组复杂而精细的分子机制，是细胞凋亡过程中信息传递的重要途径。
一、细胞凋亡的信号转导通路细胞凋亡的信号转导通路中包含了多个关键分子，包括凋亡调节因子、受体和信号传导因子等。
在细胞凋亡的过程中，这些分子起着不可或缺的作用。
以下是细胞凋亡的信号转导通路的具体过程：1. 受体识别：细胞死亡受体（Fas或TNF受体）与配体结合；2. 信号传导：受体结合后，活化蛋白激酶（caspases、RIP、TRAF等）被激活，从而启动下一步的信号传导过程；3. 凋亡激活：活化的蛋白激酶会进一步启动一系列反应，从而促进凋亡过程的启动；4. 细胞死亡：凋亡过程完成后，细胞内外的形态和功能都发生变化，最终导致细胞死亡。
细胞凋亡的信号转导通路是由多个分子组成的，这些分子之间相互影响，形成一个高度复杂的网络系统。
这种网络系统是可以调控的，当组织需要实现细胞凋亡时，可以通过适当地操控这些分子来启动细胞凋亡过程。
二、研究细胞凋亡的方法现代科学技术为研究细胞凋亡提供了许多有力的工具，从生物学、化学、物理学到数学等领域都涉及了相关的研究。
下面简要介绍几种研究细胞凋亡的方法：1. 细胞培养：细胞培养是最基本的研究细胞凋亡的方法。
通过对细胞的培养，可以模拟出不同状态下细胞的生长和死亡等现象，从而研究细胞凋亡的机制。
利用细胞培养可以对不同细胞类型进行研究，加入不同因子观察细胞的反应。
2. 神经元培养：研究神经元凋亡是通过细胞培养的方式进行。
通过培养神经元，可以研究不同因素在神经元凋亡过程中的作用。
3. 细胞膜激活：利用高通量的细胞膜检测技术和抗体识别技术，可以研究细胞膜的作用机制以及调控细胞凋亡的信号传导通路的作用。
4. 细胞基因组分析：利用DNA芯片技术可以了解细胞凋亡基因的状态，快速检测不同细胞中的基因表达差异，以了解不同基因表达与细胞凋亡过程之间的关系。
信号转导研究方法
信号转导研究方法信号转导是现代生物学中的一个重要研究领域。
通过研究细胞内外分子信号的传递和转导机制，可以深入了解生命现象的本质和生物体的生理状况。
以下将介绍一些常用的信号转导研究方法。
1.免疫共沉淀法免疫共沉淀法主要用于研究蛋白质相互作用和信号转导的分子机制。
实验步骤如下：首先，使用抗体对感兴趣的蛋白质进行免疫化学标记；接着，将其与待研究的混合物进行混合；最后，利用抗体对混合物进行沉淀，将与待研究蛋白质相互作用的蛋白质随着待研究蛋白质一起沉淀下来。
免疫共沉淀法可以识别相互作用的蛋白质并进一步分析它们在信号转导过程中的作用。
但是，该方法存在一些限制，例如需要有足够的特异性和灵敏性以准确识别蛋白质相互作用，而且分析结果的可重复性和可靠性也需要经过严格的验证。
2. Western blottingWestern blotting可以检测蛋白质的表达量和蛋白质的修饰状态等信息，通常用于分析信号转导过程中的途径和机制。
实验步骤如下:首先，通过细胞裂解和离心等步骤获得蛋白质样本；接着，将样本进行SDS-PAGE凝胶电泳分离；最后，通过蛋白质转印到膜上、膜上鉴定和蛋白质定量等步骤，获得感兴趣的蛋白质信息。
Western blotting具有高度的特异性和灵敏性，并且可以在不同的样本之间进行比较和分析。
然而，该方法需要以通量为基础进行分析，且对蛋白质中性化处理的要求比较严格。
3. Immunofluorescence staining免疫荧光染色是用来研究细胞内分子位置和蛋白质相互作用等的有效方法。
实验步骤如下：首先，将荧光标记的抗体与待研究的蛋白质特异性结合；接着，将样本加入到载玻片中并进行固定和渗透化处理；最后，加入荧光染料，进行显微镜观察。
免疫荧光染色技术可以研究蛋白质的亚细胞定位及蛋白质分布情况，促进对信号转导生物学过程的了解。
然而，该方法仅对荧光信号相互作用的精确控制有高要求，并且在荧光信号转移方面也存在诸多困难。
细胞信号转导的基本原理和研究方法
细胞信号转导的基本原理和研究方法细胞信号转导是指细胞内外环境信息传递的一系列过程。
这个过程涉及到大量的分子，包括受体、信号转导分子和下游效应分子。
这些分子在细胞内外形成复杂的交互作用网络，控制着各种细胞过程的发生和细胞命运的决定。
细胞信号转导是现代细胞生物学和生物医学研究的核心之一，对于解决疾病治疗和药物创新具有重要意义。
细胞信号转导的基本原理细胞信号转导是一个复杂的信息传递过程，它通常可以分为三个阶段：受体激活、信号转导和效应反应。
受体是探测细胞外部环境信号的蛋白质分子，通常是细胞膜上的跨膜受体或细胞质内的受体蛋白。
当受体与其配体结合时，会通过构象的改变、酶活性的激活或其他方式引起信号转导分子的激活。
信号转导分子是细胞内部传递信号的分子，它们通常是磷酸化酶、酰化酶、蛋白激酶或磷脂酶等蛋白质酶。
当信号转导分子被激活后，它们会进一步传递信号，并引起下游效应分子的激活。
下游效应分子可以是酶、转录因子、离子通道或运输载体等。
它们通过改变细胞内环境，控制着细胞的代谢、增殖、分化和死亡等生理状态。
细胞信号转导的研究方法细胞信号转导的研究方法多种多样，这些方法可以帮助研究者深入了解信号转导分子和效应分子在细胞内的功能和作用机制。
1. 细胞培养技术。
细胞培养技术是细胞信号转导研究的基础，通过培养细胞可以研究不同信号通路的激活和下游效应分子的功能。
目前，很多细胞系已经被开发出来，包括肝细胞、肺细胞、肾细胞等，为研究者提供了很好的研究材料。
2. 分子生物学技术。
分子生物学技术是研究细胞信号转导的重要手段，包括基因克隆、PCR、分子杂交、蛋白质表达等。
这些技术可以帮助研究者克隆和表达信号转导分子和效应分子，并进一步了解它们的功能和作用机制。
3. 免疫学技术。
免疫学技术可以用于检测和定量信号转导分子和效应分子在细胞中的表达和激活。
流式细胞术、成像技术、免疫印迹等技术可以用于研究信号转导通路的激活和效应分子的表达水平。
细胞信号转导通路的研究方法
细胞信号转导通路的研究方法细胞信号转导通路是一种重要的细胞信号传递方式，它通过化学分子、蛋白质交互作用等机制，将外界的信号传递到细胞内部，影响细胞的功能和生理过程。
细胞信号转导通路的研究对于了解细胞行为和生理机制具有重要意义。
本文将从实验方法的角度，介绍几种常用的细胞信号转导通路研究方法。
1. 蛋白质互作筛选技术细胞信号转导通路的核心是蛋白质之间的相互作用。
因此，一种常用的方法是通过筛选不同方式的蛋白质相互作用来鉴定信号通路中的关键蛋白。
蛋白质互作筛选技术主要分为两种：一种是基于酵母双杂交技术(Y2H)，另一种是基于荧光共振能量转移(FRET)技术。
Y2H技术通过将目标蛋白作为转录激活子和Gal4 DNA结合结构域的两部分，分别融合到质粒上，再分别转染到酵母体内，通过筛选表现为酵母生长能力和抗药性的融合蛋白来鉴定目标蛋白与其它蛋白质之间的相互作用。
FRET技术则是通过在不同染色体位置上植入接受荧光信号的荧光染料，并利用蛋白质间的相互作用来促进或抑制荧光共振转移，进而评估蛋白间互作的程度。
2. 免疫共沉淀技术免疫共沉淀技术(immunoprecipitation, IP)是利用特异性抗体将目标蛋白从混合物中沉淀下来，然后利用Western blot等技术鉴定目标蛋白及其相互作用伴侣。
通常，这种技术用于筛选蛋白相互作用蛋白质复合物。
IP技术的原理是通过将抗体固定于亲和树脂或凝胶上，混合特定样品后，离心使混合物中手磁珠/凝胶上沉淀出特定的蛋白质。
这样就能得到该蛋白质与其它可能与其相互作用的蛋白质组成的复合物，以便于对蛋白质间的相互作用和信号通路的调控机制进行深入研究。
3. 蛋白质微阵列技术蛋白质微阵列技术(protein microarray)是一种基于生物芯片技术的高通量蛋白质相互作用分析方法。
通过在微阵列上构建不同表达型的蛋白质，采用荧光标记法或抗体测定法，来鉴定不同蛋白质之间的相互作用。
蛋白质微阵列技术是细胞信号转导通路研究的新方法，它可以同时检测数千种蛋白相互作用，极大地提高研究的效率。
信号转导研究方法
信号转导研究方法
信号转导是指细胞内外信号的传递和调控过程。
研究信号转导的方法主要包括以下几种：
1. 蛋白质相互作用研究：通过蛋白质结构的研究，通过蛋白质相互作用研究信号转导网络中的蛋白质相互作用，例如酵母双杂交、免疫沉淀、共沉淀和质谱分析等。
2. 细胞信号转导通路研究：利用细胞生物学和生物化学技术，研究信号转导通路中关键信号分子的表达和功能。
例如，通过荧光探针标记、基因敲除和过表达技术来研究信号转导效应。
3. 基因组学研究：通过高通量技术如基因芯片和测序技术，研究信号转导网络中的基因表达谱的变化，以及不同信号转导通路的相互关系。
4. 分子荧光成像：利用分子荧光探针和显微镜技术，观察信号转导过程中的信号传递、蛋白质定位和蛋白质与其他生物分子的相互作用。
5. 生物信息学分析：通过综合分析多个信号转导通路的基因表达谱、蛋白质相互作用网络等数据，揭示信号转导通路的结构和功能。
综合运用以上多种方法，可以从不同层次和角度全面研究信号转导，揭示信号转
导通路的调控机制和生理功能。
细胞信号转导的研究方法和最新进展
细胞信号转导的研究方法和最新进展细胞信号转导是生物学中非常重要的领域，它涉及到细胞内的复杂网络和相互作用，以及如何通过这些网络和作用来调节生物体内的各种生理和病理过程。
最新的研究表明，利用先进的技术手段来研究细胞信号转导的过程和机制已经成为生命科学中的重要研究方向。
下面将从技术手段和研究进展两方面着手，对细胞信号转导的研究进行探讨。
一、技术手段的进步生物学的发展离不开科技的支持，特别是在分子水平和细胞水平的研究上，需要有更加灵敏、快捷、可靠的技术手段来帮助科学家发掘事物的本质。
以下是一些最新的研究方法：1. 基因编辑技术基因编辑技术如CRISPR-Cas9已经广泛应用于多个领域中，包括细胞信号转导研究。
它能够在特定的位点上进行DNA切割、DNA修复以及DNA序列替换等操作，可对多个基因进行同步编辑，从而方便地遗传地进行研究。
2. 光控制技术光控制技术是一种新兴的技术手段，它能够利用光线来快速、可逆地调控蛋白质的结构或活性。
例如，光受体蛋白如LOV蛋白、PIF蛋白可以通过光刺激来控制其与其它蛋白质的相互作用，从而影响信号转导过程。
3. 转录组分析转录组分析通过高通量测序技术，可以同时测量数千个转录本的表达散度，从而揭示细胞内基因表达水平的变化。
它有助于发现细胞信号转导过程中的新基因、基因功能以及表达的动态调节等特征。
4. 蛋白互作网络分析随着高通量的蛋白质质谱技术的发展，蛋白互作网络分析成为了细胞信号转导研究的重要手段之一。
通过构建并分析细胞内蛋白质之间的相互作用网络，来揭示蛋白质相互作用的模式、蛋白质相互作用网络的动态调节以及参与细胞信号转导过程的新蛋白质等信息。
二、细胞信号转导的最新进展细胞信号转导涉及到很多重要的病理生理过程，如心血管疾病、代谢性疾病、肿瘤等。
最新的研究发现，细胞信号转导通过多种机制影响细胞的生物学功能。
1. 胞外调节蛋白的酪氨酸磷酸化胞外调节蛋白（ERK）是信号转导中的关键分子，其酪氨酸磷酸化模式被认为是细胞生长和增殖的重要因素。
细胞信号转导通路和机制的研究方法和技术
细胞信号转导通路和机制的研究方法和技术细胞是生命的基本单位，其内部功能的调控和维持需要通过信号传递机制来实现。
细胞在接收模拟物或其他细胞的信号时，需要进行一系列的分子变化，最终转换为细胞内部的生物学响应。
这个过程称为细胞信号转导（cellular signal transduction），它对细胞发育、分化、增殖和凋亡等生物学过程中的正常和异常调控至关重要。
细胞信号转导通路和机制的研究是分子生物学领域中最为活跃和前沿的研究方向之一。
为了深入探究细胞信号转导的机制和分子调控，科学家们开发了多种技术和方法，从基础研究到临床研究都有应用。
本文将介绍一些主要的研究方法和技术。
1. 免疫共沉淀（immunoprecipitation）免疫共沉淀是一种常用的方法，它可以帮助研究者鉴定蛋白质相互作用。
该方法利用特异性抗体与目标蛋白进行结合，并以此来鉴定该蛋白质的复合物中的其他蛋白质成分。
例如，在研究一种新型受体的内部信号传递机制时，可以利用该技术来鉴定其结合的激酶或适配蛋白，以此来推断其信号传递通路。
2. 蛋白质组学（proteomics）蛋白质组学是一种对细胞、组织和生物体中的蛋白质进行全面识别、分析和比较的技术。
蛋白质组学技术包括二维凝胶电泳、液质联用、质构分析等，可以鉴定大量蛋白质的确定结构、性质和功能。
这种技术为研究细胞信号转导提供了更为详细和深入的了解，尤其是对于发掘新的信号转导通路或潜在靶点具有重要意义。
3. RNA干扰（RNA interference）RNA干扰是一种利用特异性双链RNA分子来靶向破坏目标基因或RNA序列的技术。
这种方法可以在细胞内直接干扰信号传递通路中的基因表达，以此达到探究信号转导通路的目的。
该技术不仅可以鉴定新的基因、分析基因功能，还可以加深对复杂信号通路机制的了解。
4. 功能性基因组学（functional genomics）功能性基因组学是一门生物学的交叉学科，它通过大规模的发掘和分析基因（基因组）信息，以研究基因在生命活动中的作用和作用机制。
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析；
❖ cAMP ELISA测定方法，测定简便、敏感性 高（特异受体） 。
❖cAMP信号系统常用药理学试剂
❖ cAMP类似物：竞争性结合PKA调节亚基上的cAMP结合位 点，PKA的竞争拮抗剂，PDE不能水解，Rp-cAMP、SpCAMP
❖ 与PKA的底物结合位点竞争的抑制剂：结合C亚基的ATP结 合位点，抑制专一性低，异喹啉衍生物H89、KT5720
❖ 荧光测定仪器
荧光分光光度计：少用 流式细胞仪： 激光扫描共聚焦显微镜术（LSCM） 数字共聚焦显微镜
❖ Fluo 3若以游离配体形式存在时几乎是非荧光性的，但是当 它与钙离子Ca2+结合后荧光会增加60至80倍，最大激发波 长为506nm，最大发射波长为526 nm。是目前最常用的一 种钙离子荧光探针。
❖ 上样量：目标蛋白量不应太低 ❖ 膜的选择：蛋白质的分子量（孔径） ❖ 封闭液：20%BSA→10%脱脂奶粉→10%马血清 ❖ 抗体：内参 ❖ 检测系统：辣根过氧化物酶-ECL ❖ 结果分析：背景过高：洗膜不充分、抗体浓度过高、封闭不充分；条
带过浅：抗体浓度不够、效价降低、曝光过短、蛋白含量低 ❖ Stripping buffer漂洗，去除一结合的一抗和二抗，多次使用
❖ 冻溶： -20或-80→4（一天） →室温 均匀摇晃，勿产生气泡，减少沉淀
❖ 组织提取物的制备：提取可溶蛋白（尽可能选 择含目标蛋白高的组织）
❖ 步骤及注意事项：
❖ 1、切成小块，放入预冷匀浆器，加入预冷缓冲液（2倍体积） ❖ 2、匀浆1-3min，若较长时间，则间隔1min ❖ 3、匀浆方法选择：有的组织在匀浆前先冷冻后有利于破碎；
常用：溶菌酶、β-1,3葡聚糖酶、蛋白酶等； 缺点：价格高，通用性差
❖ 化学渗透法：化学药品改变细胞壁或膜的通透性 有机溶剂（苯、甲苯）、表面活性剂（SDS、 TritonX-100）、金属螯合剂（EDTA产物 ❖ 其他：反复冻融法、渗透压法、干燥法
❖ 亲和标记法分离表面受体
❖ 亲和标记（affinity labeling）是常用的分离细胞表面受体 的方法
❖ 原理： 将细胞与超量标记的激素（配体）混合，以饱和所 有特异受体的激素结合位点。洗去多余的激素，然后加入能 够与受体和配体结合的共价交联剂将激素与受体进行共价交 联。
❖亲和标记胰岛素受体
❖ 大多数交联剂含有两个可与蛋白质中自由氨基相互作用的基 团， 当表面受体与配体结合后，配体和受体上各自的自由 氨基的距离靠近到足以被小分子的交联剂结合时，受体和配 体就会被交联在一起。
❖ 与交联剂共价结合的配体和受体能够耐受去垢剂和变性剂的 处理。
❖ 因而可用去垢剂和变性剂溶解细胞质膜，分离膜蛋白通过电 泳进行分析。
蛋白质表达水平和细胞内定位研究
❖ 信号蛋白分子表达水平及分子量检测 western blot analysis
❖ 信号蛋白分子在细胞内定位研究 immunohistochemistry/immunnocytochemistry Immunofluorescence（IF） Green fluorescent protein（GFP ，live cells）
激酶活性的测定
❖ 常见激酶活性的测定有PTK、PKC及PI-3K等。均有商品化的试 剂盒。
❖ 检测原理：根据激酶可以催化特定底物发生磷酸化，外源加入 32γ-ATP，通过分离反应产物后测定放射活性，从标准曲线推算 出样品酶的活性。
❖ PKC从胞质向胞膜的转位是PKC活化的一个重要指标，因而分 离胞质和胞膜中的PKC并分别测定其活性，计算胞膜上PKC活 性占总PKC活性的比例，从而判定PKC的活化程度。
❖ Fluo 3-AM是Fluo 3的一种乙酰甲酯衍生物，通过培养，能 够轻易进入细胞中。 Fluo 3-AM进入细胞后可以被细胞内的 酯酶剪切形成Fluo 3，从而被滞留在细胞内。
❖ 激光共聚焦荧光显微镜具有氩激光器，所以Fluo 3可被广泛 使用于这种显微镜上。这种荧光信号发出来的长波也便于减 小对样品细胞的光损伤。
❖ 钙调素的定量测定
酶法：根据CaM依赖的酶（PDE、NAD激酶、 Ca-ATP酶等）激活的程度，使用广泛 免疫学法：RIA和ELISA（抗体，特异性强、测 定CaM的总量，非活性）
磷酸化的信号转导分子
❖ 酪氨酸磷酸化、苏氨酸残基磷酸化及丝氨酸残 基磷酸化
❖ 蛋白鉴定通常是首先分离粗提蛋白，采用针对 含这些氨基酸残基磷酸化蛋白的单克隆抗体进 行免疫沉淀,SDS-PAGE电泳，然而采用 Western blotting鉴定其分子量，进一步利用分 子生物学技术克隆信号蛋白，搞清其基因结构 和氨基酸序列。
信号转导的研究方法
受体
❖ 突变株的筛选（遗传学方法） 受体提纯（亲和层析） 标记配体法检测受体：
❖ 受体与配体相互作用研究方法 ：
（1）饱和实验，用于测定放射性配体对受体的亲和 力（K）以及结合位点的密度（Bmax）；
（2）抑制实验，用于测定未标记的竞争配体与受体 的亲和力（Ki）；
（3）动力学实验，用于测定放射性配体与受体的结 合速率常数（K+1）和解离速率常数（k-1）。
❖ IP3的测定
❖ 采用3H-TdR标记的肌醇标记靶细胞后，用不同的刺激剂 刺激细胞，分离磷脂酰肌醇混合物，通过阴离子交换层 析柱分离洗脱，收集IP3洗脱峰后进行液闪测定。
❖ D-myo-IP3［3H］分析系统直接测定粗提物中的IP3含量， 此方法简易、敏感（Amersham公司）。
钙信号
❖ 细胞内游离钙离子测定方法 ❖ 方法选择：
1、使用Ca2+特异性指示剂时，指示剂与Ca2+专一结合性强、亲 和力高，可以测定低浓度Ca2+ ；
2、尽可能获得Ca2+浓度绝对值； 3、测定Ca2+水平的变化比细胞内Ca信号引起的相关生理反应要
快； 4、指示剂与Ca2+结合不损害细胞内正常生理生化过程； 5、容易进入细胞并在胞质内扩散； 6、有可能显示胞内Ca2+分布。
❖ 饱和实验
常用于确定受体密度（受体的数目）在实验干预（如药物治疗）时的变 化。保持受体数不变而改变放射配体浓度可得到饱和曲线。从该实验中 可估计受体最大结合量（Bmax）和受体对放射性配体的解离常数 （Ka）。 ❖ 饱和实验的结果以结合配体数（与受体结合的放射性配体的浓度）为y 轴，游离配体数（未与受体结合的放射性配体的浓度）为x轴作图。当 放射性配体浓度增大时结合配体数逐渐增加，当达到某一点以后，再增 多放射性配体量也不引起结合配体数的显著增加。 ❖ 饱和曲线的最高趋近点所对应的y值，亦可代表所研究组织中的受体密 度。Kd为占据受体50％结合位点时的配体浓度。
❖ ［ Ca2+ ］i的测定 ❖ 细胞内Ca2+的测定方法有原子吸收光谱法、离
子微电极测定法、放射示踪法及标记示踪法等。
荧光法
❖ 水母发光蛋白法 ❖ 钙离子荧光探针法（目前常用），标记靶细胞
钙离子荧光探针 常用的 有Fluo-3 AM 、quin-2/Am、Fura2/Am及Indo-1等。
❖ 荧光探针的装载方法： 显微注射：水母发光蛋白和Dextran偶联的探针 酸化导入法：离子型探针（有些细胞无法导入） 常温孵育法：AM酯化的探针（在动物细胞应用广泛） 低温导入法：植物细胞，低温抑制细胞壁的酯酶
人工匀浆 ❖ 4、缓冲液的选择：使用中性PH、离子强度适当 ❖ 5、抑制蛋白酶的加入：根据蛋白质的可能降解情况加入（酶
抑制剂价格昂贵） ❖ 6、低温高速或超速离心 ❖ 7、超声的方法
细胞破碎与分离
❖ 破碎方法： 机械法： 非机械法：溶胞作用：酶溶法、化学法、物理法 ❖ 酶溶法：用生物酶将细胞壁和细胞膜消化溶解
❖ 同位素示踪：通过标记32P ❖ 磷脂分子的定性和定量：色谱、质谱的应用
脂组学
❖ DAG的测定 提取含DAG的样品，用DAG激酶催化底物DAG，使
之发生磷酸化，外源加入32γ-ATP，最后将反应产物进 行分离后测定放射性含量，根据标准品计算出样品中 DAG的含量（Amersham公司生产的DAG分析系统）。
western blot
❖ SDS-PAGE→转膜（PVDF or NC） →封闭 →一抗→洗涤→标记二抗→洗涤→显色或化 学发光显影
❖ SDS-PAGE作用：确定蛋白质纯度、确定蛋
白质亚单位的分子量 ❖ 考染：检测含0.1ug蛋白质条带
银染：灵敏度高100倍
❖ 印迹膜上蛋白质染色：聚偏氟乙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙 膜
环核苷酸信使系统
❖ cAMP/cGMP定性及定量测定 3H/125I标记cAMP/CGMP竞争结合分析系统 酶联免疫方法（ELISA) 色谱分离-质谱测定 细胞内实时测定：荧光共振能量转移（FRET）及生物分子 荧光互补（BIFC）
❖ cAMP［3H］分析系统，优点是放射性半衰
期长，可用于大量样品的分析；
免疫学法
❖ 蛋白质印迹：抗体（如抗p-Thr）、样品匀浆液加 入蛋白酶抑制剂、蛋白磷酸酶抑制剂或蛋白激酶抑 制剂；目标蛋白印迹发生移位
❖ 免疫组织化学：磷酸化蛋白在亚细胞定位和动态变 化
❖ 流式细胞术：荧光抗体
❖ 磷酸化蛋白组学
高分辨率质谱 磷酸酶抑制剂使用：钒酸钠（酪氨酸磷酸酶）、冈田 酸（丝/苏氨酸磷酸酶）、氟化钠、焦磷酸钠、甘油 磷酸钠（广谱、非特异磷酸酶）
❖ 生化实验检测
GTP结合实验：用GTP类似物[ γ-32P]GTP，检测G蛋白的存在，几种G蛋白的
特异性？
免疫印迹实验：抗体 GTPase活性实验：不同反应底物：同位素标记法（[γ-32P]GTP）；级联反
应荧光法（NADH，GTPase、丙酮酸激酶和LDH）
❖ 分子遗传学手段
借助G蛋白突变株（功能缺失突变株、显性负突变株、功能 获得突变株）