提取微生物油脂的方法与流程
压榨法取油(油脂制取技术课件)
理论总压缩比指在充满系数为1，榨料没有随轴旋 转及回料的情况下，第一节榨螺和最后一节榨螺 的体积输送能力之比值。
实际压缩比是指进入榨油机的熟坯体积与由榨机 排出的物料体积之比值。实际压缩比曲线是指在 对应于每一节榨螺的空余体积中的榨料实际压缩 值变化曲线。
在诸多的榨料结构性质中，榨料的机械性质特别是 可塑性对压榨取油效果的影响最大。
榨料在含油、含壳及其他条件大致相同的情况下， 其可塑性主要受水分、温度以及蛋白质变性的影响。 水分
水分↑→塑性↑（塑性过好→“挤出”现象） 水分↓→塑性↓（塑性过差→不利于出油） “临界水分” →较狭窄的“最优水分范围” 一般来说，随着榨料水分含量的增加，其可塑性也逐 渐增加。当水分达到某一点时，压榨出油情况最佳， 这时的水分含量称之为“最优水分”或临界水分。对 于某一种榨料，在一定条件下，都有一个较狭窄的最 优水分范围。 最优水分范围同时与其他因素，首先是温度、蛋白质 变性程度密切相关。
（2）理论压缩比与实际压缩比的关系
实际上，所有的螺旋榨油机，其ε值都远大于εn值，一般ε/ εn=1.5-4.5，甚至更高（7.5）。
榨料实际压缩过程
① 榨料实际压缩状态
温度 温度↑→塑性↑（温度太高→产生焦化） 温度↓→塑性↓（饼块松散不易成型） 榨料温度不仅影响其可塑性和出油效果，还影响油和饼的质量。因此，
温度也存在最优范围。 蛋白质变性程度
蛋白质变性程度↑→“挤出”压力↑ 蛋白质变性程度↓→饼中残油↑ 压榨时由于温度和压力的联合作用，会使蛋白质继续变性，如压榨前蛋 白质变性程度约为74.4-77.03%，经过压榨可达到91.75-93%。总之， 蛋白质变性程度适当才能保证好的压榨取油效果。
3-微生物检测一般流程
微 生 物 检 验 一 般 程 序 图
报告
一、检验前准备
Preparation for Microorganism Examination
1. 准备好所需的各种仪器
2. 准备好所需的各种玻璃器皿
3. 准备好所需的各种试剂、药品、培养基
4. 无菌室灭菌
5. 检验人员的工作衣、帽、鞋、口罩等灭菌后备用
抽样次数：
3 样品的种类
Sample Type 样品可分为大样、中样和小样。 大样：一整批样品 中样：从样品各部分取得的混合样 小样（检样）:分析用的样品。 抽样量：指从全批产品（或全过程） 的单位包装。 抽取
检验量：是指检验用量，是抽样量各包装的 混合样品的一部分。 检验量与抽样量是两种不同的范畴的量，抽样 量大于检验量。
A 固体样品
机械分散法（适用于固体及油性样品）
电动匀质法 研磨法 整粒振荡法
B
冷冻样品
0-4℃ 18h;45 ℃ 15min
C 粉状或颗粒状
搅匀后称取，制成1：10稀释液
（3）油脂性样品
乳化法适用于油脂性样品，在供 试品中加入适量的乳化剂及稀释剂， 在保温情况下混匀（机械分散法）， 使之成为均匀分散的乳浊液。
产品受外来微生物的污染，污染可有可无， 1 微生物限度检验的特殊性 可多可少；种类多样。依条件而定，非产
Particularity of the Microbial Limit Testing 品本身所固有。因此微生物限度检验对象 是不确定的。污染是意外事件。污染批号 （ 1）微生物限度检验对象的特性 中的不合格品是一个随机变量。 一个批号内的产品有的被污染，有的不被 污染，分布不均匀；在被污染的部分中有 的数量极多，有的较少，种类复杂或单一。 不确定性 这种不均匀性源于污染源的复杂性。 以活的微生物作为检验对象也是其独特 特性，不同菌种的生长率和死亡率不尽 分布的不均匀性 相同，检测结果只代表取样时的状态。
餐厨废弃油脂处理流程
餐厨废弃油脂处理流程餐饮业是一个生成大量餐厨废弃油脂的行业。
废弃油脂的排放和贮存不当，会对环境造成很大的影响。
因此，餐饮企业应该采取有效的措施处理废弃油脂。
下面是餐厨废弃油脂处理的流程。
第一步是收集废弃油脂。
餐饮企业应该安装专门的储存设备，如集油缸，用于储存废弃油脂。
当油脂储存设备装满时，应该及时清理。
第二步是将收集到的废弃油脂转运。
转运是处理废弃油脂的关键步骤，因为废弃油脂容易变质和污染。
餐饮企业应该选择正规的废弃油脂处理公司进行转运，确保处理过程符合国家和地方的法规和标准。
第三步是处理废弃油脂。
处理的方法有很多种，包括生物处理、化学处理和物理处理等。
其中，最常见的处理方式是生物处理。
生物处理是利用微生物分解废弃油脂，将其转化为有用的另一种物质。
这种方式不仅有效，而且安全，对环境的影响非常小。
第四步是回收处理后的油脂。
经过处理的油脂可以用于制造生物柴油、肥料和化妆品等产品。
这样不仅可以减少资源浪费，还可以为企业带来更多的经济收益。
在实施餐厨废弃油脂处理流程时，餐饮企业需要注意以下事项：1. 应该选择正规的废弃油脂处理公司，确保处理过程符合相关法规和标准，避免造成环境污染。
2. 废弃油脂的收集、转运和处理要符合国家和地方的法规和标准。
3. 废弃油脂处理的质量和效果要符合企业的要求，同时也要达到环保要求。
4. 废弃油脂处理后的产品，包括生物柴油、肥料和化妆品等，应该符合相关标准和质量要求。
总之，餐厨废弃油脂处理是一项非常重要的任务。
餐饮企业应该重视废弃油脂的处理工作，采取有效的措施，提高废弃油脂的利用率和环保意识。
只有这样，才能使餐饮业在发展和环保之间取得平衡。
裂殖壶菌油脂提取方法的研究
第30卷第6期温州大学学报·自 然 科 学 版2009年12月V ol 30, No 6 Journal of Wenzhou University · Natural Sciences Dec, 2009 裂殖壶菌油脂提取方法的研究马建设1，韩方方1，叶海仁2，周茂洪2，黄可新1，赵肖为2,†(1．温州医学院药学院；2．温州大学生命与环境科学学院，浙江温州 325035)摘要：比较了有机溶剂提取法、酸热法和超声波提取法对于裂殖壶菌油脂的提取能力．酸热法和超声波提取法的提取得率高于有机溶剂提取法．当氯仿和甲醇以1∶1的体积比混合时，油脂提取得率最高．当氯仿和甲醇以2∶1的体积比混合时，提取所得油脂中的DHA含量最高．但总提取得率还是以氯仿和甲醇的体积混合比为1∶1时为最佳．关键词：裂殖壶菌；油脂；酸热法；有机溶剂提取法；超声波提取法中图分类号：TS224 文献标志码：A 文章编号：1674-3563(2009)06-0021-04DOI：10.3875/j.issn.1674-3563.2009.06.004 本文的PDF文件可以从获得裂殖壶菌（Schizochytrium）正在成为工业化生产DHA（二十二碳六烯酸，Docosahexaenoic Acid）或者富含DHA的油脂的重要菌种[1]．国内外已有许多关于提取微生物油脂的研究报道，李植峰等人[2]比较了索氏法、超临界CO2萃取法、酸热法和有机溶剂法从雅致枝霉（Thamnidium elegans）、拉曼被孢霉（Mortierella ramanninace）、少根根霉（Rhizopus arrhizus）和畸雌腐霉（Pythium irregulare）等微生物中提取油脂的效果，认为酸热法快速、简便、有效，但对二十碳以上的长链脂肪酸的提取能力有待进一步考察．本文研究从裂殖壶菌提取油脂（特别是二十碳以上的长链脂肪酸）的方法．1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌体菌体由裂殖壶菌（Schizochytrium）WZU4771[3]经发酵、冷冻干燥而得．1.1.2 试剂DHA甲酯、花生酸甲酯和花生酸购自美国SIGMA公司；正己烷、甲醇、氯仿和三氟化硼-乙醚等试剂均为市售国产分析纯．1.2 油脂提取方法1.2.1 有机溶剂提取法[4]称取一定量的菌体至圆底烧瓶中，加入一定比例的氯仿-甲醇混合溶剂，65℃水浴回流2 h，收稿日期：2009-05-20基金项目：浙江省科技计划项目(2007C22G2250004)作者简介：马建设(1982- )，男，河南武陟人，硕士研究生，研究方向：生物化工．† 通讯作者，sherwood@wzu. 温州大学学报·自然科学版(2009)第30卷第6期 22过滤，残渣再用一半体积的氯仿-甲醇混合溶剂回流1 h，过滤，合并滤液，挥发除去溶剂，50℃真空干燥至恒重，称量．1.2.2 酸热法[2]称取一定量的菌体，按每克6 mL的比例加入4 mol·L-1盐酸，振荡混匀，室温放置30 min后，沸水浴煮3 min，–20℃速冷后加入2倍体积的氯仿-甲醇混合溶剂，充分振荡后，5 000 r·min-1离心5 min，取氯仿层，加等体积的0.1%氯化钠溶液，混匀，5 000 r·min-1离心5 min，取氯仿层移至干燥的试管中，挥发除去氯仿，得到油脂，然后50℃真空干燥至恒重，称量．1.2.3 超声波提取法[5]称取一定量的菌体至离心管中，加入一定比例的氯仿-甲醇混合溶剂，超声粉碎15 min，加入一定比例的蒸馏水，涡旋混匀后离心（5 000 r·min-1离心5 min），取氯仿层，加等体积的0.1%氯化钠溶液，混匀，5 000 r·min-1离心5 min，取氯仿层至干燥的试管中，挥发除去氯仿即得油脂，50℃真空干燥至恒重，称量．1.3 油脂中DHA含量的测定[6]适量油脂按一定比例加入KOH-甲醇溶液（0.5 mol·L-1），65℃水浴加热，待油脂溶解后，加入一定量内标物花生酸与三氟化硼-乙醚，继续加热反应．冷却至室温，加入1 mL正庚烷，混匀，再滴入适量的饱和氯化钠溶液，混匀，静置分层后取上层，用无水硫酸钠脱水，再进行气相色谱测定．色谱条件：岛津GC-14B型气相色谱仪，色谱柱：AT. ov-1701（30 m ×250 μm ×0.33 μm，兰州中科凯迪化工新技术有限公司）．采用程序升温，初始温度180℃，保持2 min，然后按5℃·min-1升到240℃，保持16 min；进样口温度250℃；FID检测器，检测器温度260℃．2 结果与讨论2.1 3种方法对裂殖壶菌油脂的提取得率由表1可知，有机溶剂提取法的提取得率比酸热法和超声波提取法的低得多，而酸热法和超声波提取法的提取得率接近．裂殖壶菌在胞内积累油脂，在细胞壁完整的情况下，有机溶剂无法很好地提取油脂．单纯依靠有机溶剂不能很好地破坏细胞壁，而酸热法所使用的盐酸以及超声波粉碎能够充分地破坏细胞壁，从而提高提取得率．2.2 氯仿与甲醇的混合比例对提取得率的影响无论是超声波提取法还是酸热法，均采用氯仿和甲醇的混合物作为溶剂来提取裂殖壶菌细胞中的油脂，氯仿与甲醇的混合比例对提取得率的影响见表2．由表2可知，在相同的混合比例下，2种方法的提取得率相近．氯仿和甲醇的混合比例为1∶1时，提取得率最高．表1 不同方法的提取得率Table 1 Extraction Efficiency of Different Methods提取方法提取得率 / %酸热法 72.58±2.07 有机溶剂提取法 46.59±0.84超声波提取法 72.90±4.61表2 氯仿和甲醇的混合比例对提取得率的影响Table 2 Effect of Mixing Ratio of Chloroform andMethanol on Extraction Efficiency提取得率 / %氯仿∶甲醇(v / v) 超声波提取法酸热法1∶2 68.01 ± 2.68 68.97 ± 3.111∶1 72.90 ± 4.61 72.58 ± 2.072∶1 68.68 ± 1.28 67.26 ± 1.26马建设等：裂殖壶菌油脂提取方法的研究232.3 氯仿与甲醇的混合比例对提取所得油脂中DHA 含量的影响由表3可知，无论是酸热法还是超声波提取法，采用相同比例的氯仿-甲醇混合溶剂，提取得到的油脂中的DHA 甲酯含量基本相同．但随着氯仿比例的增加，DHA 含量增加．这可能是由于DHA 的碳链较长、极性较小，随着氯仿比例增加混合溶剂的极性变小，更易于萃取出DHA ．但是如果仅用氯仿来萃取油脂，油脂得率只有34.74%，溶剂极性过小反而不利于油脂的提取，这可能和甘油中脂肪酸的种类有关．尽管当氯仿和甲醇的混合比例为2∶1时，提取得到的油脂中DHA 含量最高，但是，此比例的混合溶剂的油脂得率不高，总提取效率还是以氯仿和甲醇的混合比例为1∶1时为最佳． 2.4 裂殖壶菌油脂的气相色谱图图1为采用酸热法从裂殖壶菌中提取得到的油脂的气相色谱图．裂殖壶菌油脂的组成比较简单，不含EPA （二十碳五烯酸，Eicosapentaenoic Acid ）．一般来说，鱼油中EPA 含量比DHA 的高，但是EPA 可能引起出血，所以在婴儿食品中不得添加[1]．由于EPA 和DHA 的结构非常相近，所以很难分离，或者分离的成本非常昂贵．本文提取得到的油脂不含EPA ，这种油脂特别适用于婴儿食品．3 结 论有机溶剂提取法操作简便，但费时，提取效率亦较低；超声波提取法的提取效率比较高，但是其需要有专门的设备．因此，从样品处理能力、设备要求、提取得率及油脂中DHA 含量等方面综合考虑，从裂殖壶菌中提取油脂以酸热法最为适宜，该法能够很好地提取长链脂肪酸．表3 氯仿与甲醇的混合比例对提取所得油脂中DHA 含量的影响Table 3 Effect of Mixing Ratio of Chloroform and Methanolon DHA Content in the Extracted Lipids DHA 含量 / %氯仿∶甲醇 (v / v) 超声波提取法 酸热法 1∶2 12.34 ± 0.70 12.33 ± 0.97 1∶1 13.71 ± 0.49 13.52 ± 1.70 2∶114.53 ± 0.2913.95 ± 0.52ARA: 花生酸(内标), DPA: 二十二碳五烯酸, DHA: 二十二碳六烯酸图1 酸热法提取的裂殖壶菌油脂的气相色谱图Fig 1 Gas Chromatograph of the Lipids Extracted from Schizochytrium by Acid-heating Extraction24温州大学学报·自然科学版(2009)第30卷第6期 参考文献[1] Ward O P, Singh A. Omega-3/6 fatty acids: Alternative sources of production [J]. Proc Biochem, 2005, 40: 3627-3652.[2] 李植峰, 张玲, 沈晓京, 等. 四种真菌油脂提取方法的比较研究[J]. 微生物学通报, 2001, 28(6): 72-75.[3] 周茂洪, 周林, 赵肖为, 等. 1株裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)的分离鉴定[J]. 微生物学通报, 2006, 33(4): 48-51.[4] Bowles R D, Hunt A E, Bremer G B, et al. Long-chain n-3 polyunsaturated fatty acid production by members ofthemarine protistan group the thraustochytrids: screening of isolates and optimization of docosahexaenoic acid production [J]. J Biotechnol, 1999, 70: 193-202.[5] 郑捷, 胡爱军. 超声对提取海藻二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸的影响[J]. 声学技术, 2007, 26(1): 75-79.[6] Zhou L, Lu Y H, Zhou M H, et al. Enhanced Production of Docosahexaenoic Acid Using Schizochytrium sp. byOptimization of Medium Components [J]. J Chem Eng Jpn, 2007, 40: 1093-1100.Study on Methods of Lipid Extraction from SchizochytriumMA Jianshe1, HAN Fangfang1, YE Hairen2, ZHOU Maohong2,HUANG Kexin1, ZHAO Xiaowei2(1. Pharmacy School, Wenzhou Medical College; 2. College of Life and Environmental Sciences,Wenzhou University, Wenzhou, China 325035)Abstract: Comparative studies among 3 different methods of lipid extraction from Schizochytrium (acid- heating, organic solvent and ultrasonic extraction) were carried out to evaluate their lipid extraction efficiency.The efficiency of acid-heating extraction or ultrasonic extraction was higher than that of the organic solvent extraction. The lipid extraction efficiency was highest when chloroform and methanol were mixed at the ratioof 1:1 (v/v). The content of DHA in the extracted lipids was highest when chloroform and methanol were mixed at the ratio of 2:1 (v/v). According to the experiments, the optimum lipids extraction efficiency can beachieved when chloroform and methanol are mixed at the ratio of 1:1 (v/v).Key words:Schizochytrium; Lipid; Acid-heating Extraction; Organic Solvent Extraction; Ultrasonic Extraction(编辑：王一芳)。
超临界CO2萃取微生物油脂中ARA工艺条件的优化
花 生 四烯 酸 （ ｒｃｉｏ ｉ ａｉ， Ｒ Ａ ａｈｄ ｎｃ ｃ Ａ Ａ或 Ａ 是 ５ ｄ Ａ） ，
８ １ ， 二十碳四烯酸 ， ，１１ ４一 是人体前列腺素合成的重
要前 体 物 质 ， 有 益 智健 脑 ， 高视 敏 度 ， 化 胆 固 具 提 酯
醇， 抑制血小板凝集， 降低血液黏度 ， 调节血脂 和血 糖， 保护皮肤 ， 抗炎症等功能 ， 已经在保健食 品、 化妆
简单 ； 无毒无害 ， 无环境污染 问题 ， 因而使得这一技 术在石 油 、 医药 、 品 、 食 化工等 领域有 着广 泛 的应 用前
景 。利用 超临界 Ｃ ：Ｓ Ｃ ：萃取装 置提取 深黄被 Ｏ （Ｃ Ｏ ） 孢霉 Ｙ Ｚ一１４发 酵液 中的 Ａ Ａ并 用气 相色谱 分 析其 ２ Ｒ 纯度 ， Ａ Ａ的研 究开发提供试验科 学依据 。 为 Ｒ
行浓 缩 ， 效 的 降 低 了 Ａ Ａ 被 氧 化 的机 率， 有 Ｒ 将 １ ０ 发酵 液真空 浓缩 到 ２０ｍ 。 ０ｍＬ ０ ０ Ｌ
１２２ 萃取参 数 的选 择 ．． 等量 浓缩 后 的 发 酵 液 ， 别 采 取 不 同 的萃 取 压 分
力、 萃取温度和萃取时间进行 Ｓ Ｃ ： Ｃ Ｏ 单因素试验 ， 以 确定最佳萃取压力 、 萃取温度和萃取时间。
的方法 对发 酵 液 进 行 浓 缩 ， 即可 以减 少 微 生 物 油脂
低温度下提取 ， 能稳定地处理对温度敏感 的物质； 产 品不 含残 留溶剂 ； 通过 调 节 温度 和 压力 ， 剂 的溶 解 溶
度可 得到改变 ， 可选 择 性 地分 离 非挥 发 物 ； 剂 回收 溶
与空气 的接触 又可 以保 证 在较 低 的温 度 下对 样 品进
品、 医药等领 域得 到广泛 应用 。 由于 Ａ Ａ具有 广泛 的生物 活 性 ， 应 用前 景 十 Ｒ 其
微生物油脂进展
霉 菌 能生 产 一些 特别 的油 脂 ，如 富 含棕 榈 酸 、油 酸及
亚油 酸 的油 脂及 类 可可 脂 等 。 １ ２ 提 化 合 物 、 氢 化合 物 和 普通 的油 脂 为 碳 、 源 ， 碳 氮 辅 以无 机 盐 生产 油 脂 和 另 一 些有 商业 价 值 的脂 质 。 微 生 物 油脂 的研 究 和开 发 ， 仅 丰 富 了传 统 的油脂 工 业 不 技术 ， 而且 是 工 业 化 生产 油 脂 的一 个重 要 途 径 。尤 其 在 目前 人 口增 长 使 得 油 脂 需 求 量 与 自然 资 源 严 重 短
种 ， 培 养 油脂 含 量 达 ３ 经 ０％ ， 其 中 ９ 且 ５％ 的甘 三酯
具 有 Ｐ３ ． ７ ６％ 、 ４ ３％ 、 ７ ５％ 的脂肪 酸 组 成 ； Ｓ１ ． ０ ３．
另外 ， 微生物生产油脂受 培养基 Ｃ Ｎ比、 Ｈ值 、 ／ ｐ 温度 、 培养 时 间 、 氧气 供 给 量 、 子 数 量 、 机 盐 和微 孢 无 量元素等多种因素影响［３１而且生产油脂 的菌种有 ２ ，， ，４ 限， 只有那些干基菌体含油量高 ， 且油脂转化率也较
２０ ０ ２年第 ２ 期 ６月 出版 薛照辉 等： 微生 物油脂 进展
般 为 １％ ， 别 菌 种 可达 ２ ５ 个 ０％ ～２ ５％ 。因此 ， 般 的 一 微 生 物油 脂 经 济价 值 还 很难 与 植 物 相抗 衡 。 过 随 着 不 各 项 技术 的发 展 ， 在 的 问题将 逐 步 得 以解决 。 存
（） ４ 能连续大规模生产 ， 降低成本 ；５ 利用细胞融合 、 （） 细胞 诱 变等 手 段 ， 使 微 生 物 生产 出 比动 、植 物油 脂 可
更 符合 人 体需 要 的 高 营 养 油 脂 或 某 些 特 定 脂 肪 酸 组
微生物鉴定中常用方法及详细步骤
微生物鉴定中常用方法及详细步骤1. 有些细菌具有合成淀粉酶的能力，可以分泌胞外淀粉酶。
淀粉酶可以使淀粉水解为麦芽糖和葡萄糖，淀粉水解后遇碘不再变蓝色。
2. 细菌产生的脂肪酶能分解培养基中的脂肪生成甘油及脂肪酸。
脂肪酸可以使培养基pH下降，可通过在油脂培养基中加入中性红做指示剂进行测试。
中性红指示范围为pH6.8（红）——8.0（黄）。
当细菌分解脂肪产生脂肪酸时，则菌落周围培养基中出现红色斑点。
3. 某些细菌分泌蛋白酶分解明胶，产生小分子物质。
如果细菌具有分解明胶的能力，则培养基可由原来固体状态变成液体状态。
4. 牛乳中主要含有乳糖、酪蛋白等成分。
细菌对牛乳的利用主要是指对乳糖及酪蛋白的分解和利用。
牛乳中常加入石蕊作为酸碱指示剂和氧化还原指示剂。
石蕊中性时呈淡紫色，酸性时呈红色，碱性时呈蓝色，还原时则部分或全部脱色。
细菌对牛乳的利用可分三种情况：（1）酸凝固作用：细菌发酵乳糖后，产生许多酸，使石蕊牛乳变红，当酸度很高时，可使牛乳凝固，此称为酸凝固。
（2）凝乳酶凝固作用：某些细菌能分泌凝乳酶，使牛乳中的酪蛋白凝固，这种凝固在中性环境中发生。
通常这种细菌还具有水解蛋白质的能力，因而产生氨等碱性物质，使石蕊变蓝。
（3）胨化作用：酪蛋白被水解，使牛乳变成清亮透明的液体。
胨化作用可以在酸性条件下或碱性条件下进行，一般石蕊色素被还原褪色。
具体步骤一、淀粉水解试验1. 准备淀粉培养基平板：将熔化后冷却至50℃左右的淀粉培养基倒入无菌平皿中，待凝固后制成平板。
2. 接种：用记号笔在平板底部划成两部分，在每部分分别写上菌名，用接种环取少量的待测菌，点接在培养基表面的相对应部分的中心，其中一个菌种应是枯草杆菌做对照菌3. 培养：将接种后的平皿置于28℃恒温箱培养24h。
4. 检测：取出平板，打开平皿盖，滴加少量的碘液于平板上，轻轻旋转，使碘液均匀铺满整个平板。
菌落周围如出现无色透明圈，则说明淀粉已经被水解，表示该细菌具有分解淀粉的能力。
微生物催化制备功能性油脂——共轭亚油酸的研究
菌 种 在 ＭＲ Ｓ液 体培 养 基 中经 两 次 活 化 ，按 １ （／ ％ ｖｖ ） 接 入 ５ ０ Ｓ肉汤 液 体 培 养 基 ，培 养 基 中加 入 ００ ％ ０ ｍＬＭＲ ． ６ 的Ｌ Ａ，诱 导 亚 油 酸 异 构 酶 的产 生 ，３ ℃培养 ２ 振 荡 ７ ４ｈ（ １０次／ ｉ） ２ ｍ ｎ 。培 养 结 束 后 离 心 （ ００ ０ ｇ １ ｉ ，４ ） １ ０ ｘ ， ５ｍ ｎ ℃ 收集 细胞 ，收集 的菌体 细胞 用生 理盐 水洗 涤两 遍 ，作 为制
Ｃ Ａ的制 备 方法 主要有 碱 法异 构化 和微 生物 催 化 法 。 Ｌ 碱 法异构 化可 实 现大 量生 产 ，是 目前 采用 较多 的方 法 ，但
产 物组 成复 杂 ，不利 于产 品的 开发应 用 。生物 转化法 反 应
色 谱及 分 析 条 件 ：熔 融 石英 毛细 管 柱 Ｃ Ｓｌ８（０ ｘ Ｐｉ ８ ５ｒ ｅ ０２ ｍｍｘ ．１ ．２ ０２ ｍ，Ｄｉｍａ公司产 品） ｘ ｋ ，固定柱 温 ２ ０ ０ ％，进 样 温度 ２ ０ ５ ℃，检 测器 温度 ２ ０ ，柱前 压 力 ４ ｋ ａ ５％ ０ Ｐ ，柱流 速
【 关键词 】亚油酸 ；共轭亚油酸；植物乳杆茵 ；休止细胞
中 图分类 号 ：＂ ２ ． １ ５１ － ２
文献 标识 码 ：Ａ
文章编 号 ：１ ０ — ８ ７ （０ ６ ４ ０ ４ — ３ ０ ９ １ ０ ２ ０ ）０ — ｏ ８ ０
近 年来 ，新 型功 能性 油脂—— 共 轭亚 油酸 的 多种 独特
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提取微生物油脂的方法与流程本发明涉及一种提取微生物油脂的方法，尤其是一种不使用溶剂从微生物中提取含有多不饱和脂肪酸油脂的方法。
背景技术：多不饱和脂肪酸是指含有两个或两个以上双键且碳链长度为18~22个碳原子的直链脂肪酸，主要包括亚油酸、γ-亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸等。
多不饱和脂肪酸作为婴幼儿发育必需营养素，在其生长过程中发挥着重要作用，典型代表分别是花生四烯酸和二十二碳六烯酸。
在婴幼儿时期花生四烯酸属于必需脂肪酸，花生四烯酸的缺乏对于人体组织器官的发育，尤其是大脑和神经系统发育可能产生严重不良影响。
二十二碳六烯酸俗称脑黄金，是神经系统细胞生长及维持的一种主要成分，是大脑和视网膜的重要构成成分，在人体大脑皮层中含量高达20%，在视网膜中所占比例最大，约占50%，因此对婴幼儿智力和视力发育至关重要。
由于婴幼儿体内花生四烯酸和二十二碳六烯酸的合成效率很低，其合成量不足以满足身体发育的需求，所以必须从食物中额外补充。
通过发酵富集富含多不饱和脂肪酸油脂的微生物是目前多不饱和脂肪酸油脂的主流生产方法。
传统的微生物多不饱和脂肪酸油脂的提取方式是将微生物菌种通过发酵得到大量微生物，然后进行预处理破壁，再通过有机溶剂提取、脱溶，得到富含多不饱和脂肪酸的微生物毛油。
该提取方式需要使用大量溶剂，如己烷、丁烷等，容易造成环境污染，且溶剂回收会增加生产成本，并存在安全隐患。
无溶剂提取工艺是一种高效、经济、无污染的提取方式，它利用油脂与水分子在高温下的极性差异，通过高速离心等方法将水相和油相分离得到油脂。
与传统脱胶工艺相比，无溶剂提取工艺具有能耗低、污染小等优点，近些年逐渐受到油脂生产企业的重视。
专利CN101463371A公开了一种无溶剂提取方法，包括以下步骤：在培养基中培养所述微生物，处理来自所述培养基的微生物细胞并没有干燥细胞已释放胞内脂质，将包含已释放胞内脂质的配方及进行重力分离以形成含脂质的轻相和重相，使所述轻相与重相分离，处理轻相以破坏在改脂质和水间形成的乳化液，回收粗脂质，用于破坏乳状液的处理优选乙醇、丙酮或它们的混合物。
但是，此发明所公开的无溶剂提取工艺，仍然需要使用少量的非极性溶剂，依然会对环境造成危害和污染。
另一方面，重力离心设备如倾笔式离心机等，在分离重相和轻相的时候会大量放热，分离过程的反应温度也较高，容易造成油脂中多不饱和脂肪酸的氧化，进而影响油脂品质。
技术实现要素：本发明的目的是提供一种不使用溶剂就能获得高质量油脂的提取微生物油脂的方法。
为实现上述目的，本发明提供一种提取微生物油脂的方法，包括如下步骤：（1）获得发酵后制得的富含多不饱和脂肪酸油脂的微生物发酵液；（2）裂解前述微生物发酵液，得到细胞裂解混合物；（3）使用膜过滤设备从细胞裂解混合物中分离出含有水分的乳化油脂；（4）使用非溶剂类破乳剂破坏油脂与水之间的乳化液，进而获得微生物油脂。
本发明提取微生物油脂的方法具有如下有益效果：提取过程中不使用溶剂，避免了使用溶剂及溶剂回收带来的环境污染，并且降低了生产成本；进一步的，溶剂会将培养基中的磷脂等胶质带入油脂中，不使用溶剂减少了油脂中的胶质，提升了油脂的品质，降低了油脂精炼过程中的炼耗。
另一方面，采用膜过滤分离油脂，避免油脂在高温下的氧化，也提升了油脂的品质。
进一步的，使用非溶剂类破乳剂，在破乳过程中避免了溶剂及溶剂回收带来的环境污染。
进一步的，上述方案的步骤（1）中，所述产油微生物包括酵母、裂殖壶菌、、双鞭甲藻、微球藻、破囊壶菌或高山被孢霉，显示了本发明技术方案的应用范围比较广泛。
进一步的，上述方案的步骤（2）中，裂解微生物发酵液所采用的方式包括机械剪切、化学破壁、酶解破壁中的一种或多种的组合。
进一步的，上述方案的步骤（2）中，酶解破壁时，脂肪酶与发酵液的质量比小于0.1%，优选的是在0.05%至0.10%之间。
进一步的，上述方案的步骤（3）中，使用的膜过滤设备包括微孔过滤、超滤、反渗透中的一种或多种的组合。
进一步的，上述方案的步骤（4）中，使用的非溶剂类破乳剂包括氯化钠、柠檬酸中的一种或其组合。
进一步的，上述方案的步骤（4）中，非溶剂类破乳剂占乳油重量的3.0%-5.0%。
具体实施方式下面结合具体实例，对本发明作进一步的详细说明。
实施例1以双鞭甲藻作为发酵菌种，依次按下列步骤操作：(1)发酵获得富含二十二碳六烯酸的微生物发酵液；(2)将上述发酵液经离心机处理后，得到固形物含量为22%浓缩发酵液；(3)取1000g该浓缩发酵液投入到3L的玻璃反应瓶中，调节pH值至11.5，加入0.5g碱性蛋白酶，控温40℃，酶解5h，得到细胞裂解后的混合物；(4)将上述细胞裂解后的混合物加入膜过滤设备，循环过滤，分离出含有水分的乳化油脂；(5)向含有水分的乳化油脂中加入3.0%乳油重量的氯化钠，搅拌混匀后沉降，取上清液得到128.6g富含二十二碳六烯酸的微生物油脂，检测后，二十二碳六烯酸含量达到40.4%。
实施例2以微球藻作为发酵菌种，依次按下列步骤操作：(1)发酵获得富含二十碳五烯酸的微生物发酵液；(2)取35kg该发酵液投入到70L的玻璃反应釜中，调节pH值至10.8，加入21g碱性蛋白酶、控温40℃，胶体磨循环剪切反应3h，得到细胞裂解后的混合物。
(3)将上述细胞裂解后的混合物加入膜过滤设备，循环过滤，分离出含有水分的乳化油脂；(4)向含有水分的乳化油脂中加入5.0%乳油重量的柠檬酸，搅拌混匀后沉降，取上清液得到1788g富含二十碳五烯酸的微生物油脂，检测后，二十碳五烯酸含量达到42.6%。
实施例3以酵母作为发酵菌种，依次按下列步骤操作：(1)发酵获得富含亚麻酸的微生物发酵液；(2)将上述发酵液经离心后，得到固形物含量为24.7%浓缩发酵液；(3)取150kg该浓缩发酵液投入到300L反应釜中，控温45℃搅拌、胶体磨剪切8h，得到细胞裂解后的混合物。
(4)将上述细胞裂解后的混合物加入膜过滤设备，循环过滤，分离出含有水分的乳化油脂(5)向含有水分的乳化油脂中加入4.5%乳油重量的氯化钠，搅拌混匀后沉降，取上清液得到7736g富含亚麻酸的微生物油脂，检测后，亚麻酸含量达到76.2%。
实施例4以金黄色破囊壶菌为发酵菌种，依次按下列步骤操作：(1)发酵获得富含二十二碳六烯酸的微生物发酵液；(2)取250kg该发酵液投入到500L的反应釜中，调节pH值至11.1，加入250g碱性蛋白酶，控温45℃，搅拌反应5h，得到细胞裂解后的混合物。
(3)将上述细胞裂解后的混合物加入膜过滤设备，循环过滤，分离出含有水分的乳化油脂；(4)向含有水分的乳化油脂中加入3.5%乳油重量的柠檬酸，搅拌混匀后沉降，得到11398g富含二十二碳六烯酸的微生物油脂，检测后，二十二碳六烯酸含量44.1%。
实施例5以裂殖壶菌为发酵菌种，依次按下列步骤操作：（1）发酵获得富含二十二碳六烯酸和二十二碳五烯酸的微生物发酵液;（2）将上述发酵液经离心处理后，得到固形物含量为20.9%浓缩发酵液；（3）取20000kg该浓缩发酵液投入到50000L反应釜中，加600kg 氢氧化钠溶液（浓度30%）调节浓缩发酵液的pH值至12.0，控温80℃，搅拌反应9h，得到细胞裂解后的混合物。
（4）将上述细胞裂解后的混合物加入膜过滤设备，循环过滤，分离出含有水分的乳化油脂；（5）向含有水分的乳化油脂中加入5.0%乳油重量的柠檬酸，搅拌混匀后沉降，取上清液得到2000kg富含二十二碳六烯酸和二十二碳五烯酸的微生物油脂，检测后，二十二碳六烯酸含量43.5%，二十二碳五烯酸含量19.5%。
实施例6以高山被孢霉为发酵菌种，依次按下列步骤操作：（1）发酵获得富含二十碳四烯酸的微生物发酵液;（2）将上述发酵液经离心处理后，得到固形物含量为25.3%浓缩发酵液；（3）取15000kg该浓缩发酵液投入到50000L 反应釜中，调节pH值至10.3，加入7.5kg碱性蛋白酶，控温45℃，辅以剪切搅拌反应3h，得到细胞裂解后的混合物。
（4）将上述细胞裂解后的混合物加入膜过滤设备，循环过滤，分离出含有水分的乳化油脂；（5）向含有水分的乳化油脂中加入3.0%乳油重量的氯化钠，搅拌混匀后沉降，取上清液得到1236kg富含二十碳四烯酸的微生物油脂，检测后，二十碳四烯酸含量49.3%。
实施例7以三孢布拉霉为发酵菌种，依次按下列步骤操作：（1）发酵获得含有β-胡萝卜素的微生物发酵液;（2）取5000kg该发酵液投入到50000L反应釜中，剪切搅拌反应6h，得到细胞裂解后的混合物。
（3）将上述细胞裂解后的混合物加入膜过滤设备，循环过滤，分离出含有水分的β-胡萝卜素乳化油脂；（4）向含有水分的乳化油脂中加入5.0%乳油重量的柠檬酸，搅拌混匀后沉降，取上清液得到930kg富含β-胡萝卜素的微生物油脂，检测后，β-胡萝卜素含量为2.5%。
以上实施例中，使用的膜过滤设备是利用具有选择透过能力的薄膜做分离介质，膜壁密布微孔，细胞裂解液在一定压力下通过膜的一侧，其中的油脂和部分水分透过膜壁成为透过液，而较大分子如细胞碎片则被膜截留，从而达到分离油脂的目的。
过滤过程为动态循环过程，大分子被膜壁阻隔，随循环流出膜组件，膜组件不易被堵塞，可连续长期使用。
过滤过程可在常温、低压下运行，相态无变化，能耗低于离心分离。
膜过滤方式包括微孔过滤、超滤、反渗透等方式中的一种或几种的组合。
以上实施例中，膜过滤设备均能有效工作，但是，针对油脂种类和菌体形态的不同，单一的膜过滤方式往往效能太低，实际生产过程中，将微孔过滤、超滤、反渗透等方式进行相互搭配组合，则生产效率能有明显提升。
以上实施例中，使用酶解破壁时，加酶量越高，酶解破壁时间越短，但成本也越高。
发明人多次试验后发现，碱性蛋白酶与发酵液的质量比小于0.1%的条件下，特别是在0.05%至0.10%之间时，并辅以剪切破壁，能同时兼顾生产效率和生产成本。
另一方面，单独采用剪切破壁，不添加蛋白酶水解，也能使细胞裂解，但此时生产的效率为受到较大影响。
进一步的，单独使用氢氧化钠溶液破壁也能使细胞裂解，但耗时更长。
进一步的，在使用氢氧化钠溶液进行破壁的实施例中，氢氧化钠溶液可以替换为氢氧化钾溶液、稀盐酸溶液、磷酸溶液等进行化学手段的破壁处理。
以上实施例中，氯化钠和柠檬酸作为非溶剂类破乳剂，添加量在乳油重量的3.0%-5.0%之间为宜，继续添加沉降效果提升不明显，且会增加对罐体设备的腐蚀。
本发明涉及一种提取微生物油脂的方法，尤其是一种不使用溶剂从微生物中提取含有多不饱和脂肪酸油脂的方法。
背景技术：多不饱和脂肪酸是指含有两个或两个以上双键且碳链长度为18~22个碳原子的直链脂肪酸，主要包括亚油酸、γ-亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸等。