荧光标记二抗的选择

来源: 生物耗材网发布日期: 2012-2-28

一般来讲，耦联到二抗上的探针主要有酶（辣根过氧化酶HRP和碱性磷酸酶AP或其衍生物APAAP，PAP），荧光基团（FITC, RRX, TR, PE, Rhodamine）和生物素。选用哪种探针的二抗主要取决于具体的实验。对于Western Blot和ELISA，最常用的二抗是酶标二抗；而细胞或组织标记实验（细胞免疫化学，组织免疫化学，流式细胞术）中通常使用荧光标记的二抗。如果想要更大程度的放大检测信号，可以使用Biotin/Avidin检测系统。其中荧光素是具有光致荧光特性的染料，荧光染料种类很多，目前常用于荧光标记二抗有以下几种：

【异硫氰酸荧光素-Fluorescein Isothiocyanate (FITC)荧光标记二抗】FITC 纯品为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水和酒精溶剂。FITC分子量为389.4，最大吸收光波长为490～495nm，最大发射光波长为520～530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。FITC在冷暗干燥处可保存多年，是目前应用最广泛的荧光素。由于FITC是小分子化合物，每一个抗体可标记几个FITC分子，IgM通常用小分子的荧光素标记，如FITC、Cy3/5、Texas Red等。FITC荧光二抗主要优点是人眼对黄绿色较为敏感，通常切片标本中的绿色荧光少于红色。然而FITC 的最大缺点是淬灭快，因此要和抗淬灭剂一起使用。

【四甲基异硫氰酸罗丹明-Tetramethyl Rhodamin Isothiocyanate(TRITC)，Rhodamine Red-X(RRX), Texas Red(TR)荧光标记二抗】

这些罗丹明的衍生物耦联基团具有不同的吸收波长(550, 570, 596nm)和最大发射波长（570, 590, 620nm）。尽管TRITC经常和FITC一起在双标记实验中使用，使用RRX和TR可以得到更好的颜色区分。在使用装有氪氩灯的激光共聚焦扫描显微镜作三标记的实验时，RRX尤其有用，可以和Cy2(或者FITC)和Cy5一起使用，因为RRX的发射波长在Cy2和Cy5中间，而且和这两者覆盖都很少。氪氩灯激发光为488nm，598nm和647nm，分别是Cy2(FITC), RRX和Cy5的理想激发波长。因为FITC和PE可以被氩灯的488nm波长激发, 在流式细胞仪中用FITC作双标，另一种用藻红蛋白（PE）耦联基团要比罗丹明好。TRITC 为罗丹明的衍生物，呈紫红色粉末，较稳定。最大吸收光波长为550nm，最大发射光波长为620nm，呈现橙红色荧光，与FITC的绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色。因其荧光淬灭慢，也可用于单独标记染色。

【菁类染料-Cyanine dyes(Cy2, Cy3, Cy5)】

Cy2 耦联基团激发波长为492nm，发光为波长510nm的绿色可见光。Cy2和

FITC使用相同的滤波片。由于Cy2比FITC在光下更稳定。要避免使用含有磷酸化的苯二胺的封片剂，因为这种抗淬灭剂和Cy2反应，在染色片储存后会导致荧光微弱和扩散。Cy3和Cy5比其他的荧光团探针要更亮，更稳定，背景更弱。Cy3耦联基团激发光的最大波长为550nm，最强发射光为570nm。因为激发光和发射光波长很接近TRITC, 在荧光显微镜中，可使用和TRITC一样的滤波片。Cy3在氩光灯（514nm或528nm）下可以被激发出50％的光强，在氦氖灯（543nm）或者汞灯（546nm）下则约75％。Cy3可以和荧光素一起作双标。Cy3还可以和Cy5一起在共聚焦显微镜实验中作多标记。Cy5耦联基团的激发波长最大650nm，发光波长最大670nm。在氪氩灯（647nm）下它们可被激发出98％的荧光，在氦氖灯下（633nm）为63％。Cy5可以和很多其他的荧光基团一起用在多标记的实验中。由于它的最大发射波长在670nm，Cy5很难用裸眼观察，而且不能用汞灯作理想的激发。通常观察Cy5时采用具有合适激发光和远红外检测器的共聚焦显微镜。在水相封片剂中应当加入抗淬灭剂。使用传统的表面荧光显微镜时，不推荐使用Cy5。

【藻红蛋白或藻胆色素蛋白-Phycoerythrin(PE)荧光标记二抗】

存在于被称为藻红的多聚微粒中，位于叶绿素的反应中心，在自然结构中，藻红蛋白吸收光能，吸收后转化成能量，供其发育生长。当藻红蛋白被分离和纯化后，其蛋白质变得具有很强的荧光，能吸收不同波长的光，发出亮红色的荧光，此时不再接受任何外来的光，也不能转移光能。藻红蛋白PE的吸收波长范围较广，最大的吸收波长为566nm，最大的发射波长为574nm。藻红蛋白作为荧光标记物具有以下优点：首先具有强的长波长激发和发射荧光，可避免来自其他生物材料荧光的干扰；并且具有极高的发射量子产率；另外PE具有非常高的水溶性而且与许多生物学或合成材料的多位点稳定交联。【Aminomethylcoumarin Acetate (AMCA)】

耦联的AMCA吸收光波长最大为350nm，发荧光则为450nm。对于荧光显微镜来说，AMCA可以用汞灯来激发，用紫外滤板来观察。由于AMCA的信号相对较弱，单标实验中不推荐使用AMCA。AMCA和荧光素的荧光波长只有很小的重叠范围，而和发出长波长荧光的荧光基团没有或者只有极少的重叠，因此它最常用于多标记实验中，比如免疫荧光显微镜和流式细胞仪。由于人眼不能很好的检测蓝色荧光，在多标记的实验中，AMCA耦联的二抗应当被用于检测大量的抗原。AMCA和荧光素一样很快淬灭，使用抗淬灭剂可以减轻。且由于肉眼不能很好的检测AMCA所激发的蓝色荧光，因而AMCA耦联的二抗更适用于检测大量存在的抗原。如果使用在流式细胞仪中，AMCA可以用汞灯或者水冷却的氩光灯激发，因为它们发出的光线是在光谱的紫外区。

注：由于观察荧光需要一定波长的激发光，必须根据实验室已有的仪器可发光的波段进行选择。另外，多标记中对探针色彩区分程度的要求。例如，若丹明红-X (RRX)和德克萨斯红(TR)荧光素的区别就比四甲基若丹明（TRITC）或者Cy3的区别明显。如果对灵敏度有更高的要求，则Cy3和Cy5就比其他的荧光团探针要亮。

常用抗体标记荧光染料的特性及其应用

常用抗体标记荧光染料的特性及其应用 1、FITC：激发波长488nm，最大发射波长525nm。 1）其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪； 2）在流式细胞仪的FL1通道检测； 3）可用于荧光显微镜技术 4）荧光强度易受PH值影响，PH值降低时其荧光强度减弱。 2、Alexa Fluor 488：激发波长488nm，最大发射波长519nm。 1）其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪； 2）在流式细胞仪的FL1通道检测； 3）具有超乎寻常的光稳定性，非常适用于荧光显微镜技术； 4）在较宽的PH值范围内保持稳定（PH4～10）。 3、Cy3：激发波长488nm，最大发射波长570nm。 1）其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪； 2）在流式细胞仪的FL2通道检测； 3）适用于荧光显微镜技术； 4）为小分子染料，非常适合需小分子染料的流式细胞术，荧光强度低于P E。 4、Cy5：激发波长633/635nm，最大发射波长670nm。 1）其标记的抗体适用于所有配备633nm氩离子激光器的流式细胞仪； 2）在流式细胞仪的FL4通道检测；

3）适用于荧光显微镜技术； 4）同样为小分子染料，非常适合需小分子染料的流式细胞术，荧光强度低于APC。 5）与单核和粒细胞非特异性结合多，易出现假阳性结果。 5、PE：激发波长488nm，最大发射波长575nm。 1）其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪； 2）在流式细胞仪的FL2通道检测； 3）其荧光泯灭性强，不适用于传统的荧光显微镜技术，但适用于激光共聚焦显微镜技术。 6、PE-TR：激发波长488nm，最大发射波长615nm。 1）在Beckman Coulter流式细胞仪的FL3通道检测； 2）可适用于小功率激光器的流式细胞仪，也可使用于大功率激光器的大流式细胞仪。 7、PE-Alexa Fluor 610：激发波长488nm，最大发射波长628nm。 1）在Beckman Coulter流式细胞仪的FL3通道检测； 2）荧光强度高； 3）可适用于小功率激光器的流式细胞仪，也可使用于大功率激光器的大流式细胞仪。 8、PE-Alexa Fluor 647：激发波长488nm，最大发射波长668nm。 1）在Beckman Coulter流式细胞仪的FL4通道检测，BD细胞仪FL3通道检测； 2）不易湮灭；

分子标记技术的种类

分子标记技术的种类-标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII

分子标记技术的种类根据不同的核心技术基础，DNA分子标记技术大致可分为三类: 第一类以Southern杂交为核心, 其代表性技术为RFLP；第二类以PCR技术为核心，如RAPD、SSR、AFLP、STS、SRAP、TRAP等；第三类以DNA序列(mRNA或单核苷酸多态性)为核心，其代表性技术为EST标记、SNP标记等。理想的分子标记应达到以下的要求：①具有高的多态性； ②共显性遗传；③能够明确辨别等位基因；④分布于整个基因组中；⑤选择中性(即无基因多效性)；⑥检测手段简单、快速； ⑦开发成本和使用成本尽量低廉；⑧在实验室内和实验室间重复性好。目前，没有任何一种分子标记均满足以上的要求，它们均具有各自的优点和不足。其特点比较见表一。 1限制性内切酶片段长度多态性标记（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）1974年，Grozdicker 等人鉴定温度敏感表型的腺病毒DNA突变体时，发现了经限制性内切酶酶解后得到的DNA片段产生了差异，由此首创了第一代DNA分子标记技术——限制性内切酶片段长度多态性标记(RFLP)。其原理是由于不同个体基因型中内切酶位点序列不同(可能由碱基插入、缺失、重组或突变等造成)，利用限制性内切酶酶解基因组DNA时，会产生长度不同的DNA酶切片段，通过凝胶电泳将 DNA片段按各自的长度分开，通过Southern印迹法，将这些大小不同的DNA片段转移到硝酸纤维膜或尼龙膜上，再用经同位素或地高辛标记的探针与膜上的酶切片段分子杂交，最后通过放射性自显影显示杂交带，即检出限制性片段长度多态性。进行 RFLP时，酶切要彻底，注意内切酶的选择，对于亲缘关系很近的物种，可增加内切酶的使用种类。目前RFLP的使用领域很广泛，其具有以下优点：①RFLP标记源于基因组DNA的自身变异，理论上可覆盖整个基因组，能提供丰富的遗传信息；②标记不受组织、环境和发育阶段的影响；③呈共显性，即杂交时等位DNA片段均呈现带，能区分纯合基因型和杂合基因型，F2表现出 1∶2∶1的孟德尔分离定律[3]，提供标记座位完全的遗传信息；④由于限制性内切酶的专一性使结果稳定可靠，重复性好。其缺点是：①操作繁琐，费时；②酶切后的DNA质量要求高；③使用放射性同位素进行分子杂交，有危险性等。 2随机扩增多态性DNA标记 (Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD) 20世纪80年代，基于PCR技术的第二代分子标记技术诞生并迅速发展起来。1990年，Williams 等发表了一种不需预先知道DNA序列信息的检测核苷酸序列多态性的方法，即随机扩增多态性DNA标记(RAPD)。其原理是以碱基顺序随机排列的寡核苷酸单链(8-10bp)为引物，以组织中分离出来的基因组DNA为模板进行扩增。随机引物在基因组DNA序列上有其特定结合位点，一旦基因组在这些区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变，就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化，从而导致扩增产物的数量和大小发生改变，表现出多态性。用琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物，溴化乙锭染色后可在紫外光下显现出基因组相应区域DNA的多态性。与RFLP相比，RAPD方便易行，DNA用量少，设备要求简单，不需DNA探针，设计引物也不需要预先进行序列分析，不依赖于种属特异性和基因组的结构；合成一套引物可以用于不同生物基因组分析，用一个引物就可扩增出许多片段，并且不需使用同位素，安全性好。但因为引物较短导致退火温度较低，易产生错配，故实验的稳定性和重复性差，且为显性标记，不能区分纯合子和杂合子。 RAPD 标记技术利用单引物扩增多个基因位点使其在一定程度上对反应条件敏感，这会限制其应用。将RAPD-PCR变成经典的PCR可克服此限制，即设计更长的引物。1993年，Paran提出的序列特征化扩增区域标记(Sequenced Characterized Amplified Region，SCAR)即为以经典PCR为基础的分子标记技术[1]。SCAR标记技术通过对产生的RAPD片段克隆和测序，设计一对互补于原

荧光素标记抗体方法

荧光素标记抗体技术 (一) 原理目前用于抗体标记的荧光素主要有异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocy nate,FITC)或罗达明(Lissamine rhodamine B200, RB200)。在硷性条件下FITC 的碳酰胺键可与抗体赖氨酸的ε氨基共价结合，标记后的抗体仍保持与相应抗原结合的能力。在荧光灯源紫外线或兰紫光激发下产生黄绿色荧光，通过在荧光显微镜下观察或流式细胞仪分析可对相应抗原进行定性、定位或定量的检测。 (二) 操作步骤将纯化的IgG抗体对PH9～9.5碳酸盐缓冲液透析过夜，透析后抗体液移入小烧杯中 ↓ 称取适量IFTC，加入二甲亚砜(DMSO)(FITC～1mg/1ml DMSO) 使终浓度为1mgFITC／1mlDMSO FITC／IgG比例:如IgG浓度为1mg／ml，FITC／IgG比例约为50μgFI TC／mgIgG；如IgG为5～10mg／ml，则比例为25μgFITC／ml IgG 在10ml小烧杯中先放入抗体 ↓ 按上述比例将FITC-DMSO溶液逐滴加入透析后的抗体溶液中 ↓ 将标记物用PBS加至2.5ml，磁力搅拌器室温下避光搅拌2h ↓ 用PD10柱(Sephadex G25柱)除去游离荧光素，先用25ml PBS淋洗G2 5柱 ↓

收集PBS洗脱第一个荧光素结合蛋白峰，测定F／P 比值。第二个荧光素峰为游离荧光素计算: 2.87×A495 F／P＝──────── A280-0.35×A495 合适的F／P值为2～4。 (三) 试剂器材 1. 纯化的多克隆抗体或单克隆抗体。 2. FITC(Fluorescein-5-Lsothiocyanalte)或其它荧光色素。 3. PBS、DMSO 4. PH9～9.5碳酸盐缓冲液: Na 2CO 3 4.3g，NaHCO 3 8.6g加蒸馏水至500ml。 5. PD10柱(Sephadex G25柱) 6.磁力搅拌器，紫外分光光度计等 (四) 注意事项 1. FITC保存于4℃暗处，使用前待试剂瓶升至室温时开盖称取，以避免潮解。 2. FITC-DMSO液要临用时配制。 3. 碳酸盐缓冲液要新鲜配制。如有侵权请联系告知删除，感谢你们的配合！

免疫标记技术讲解

课程名称：临床免疫学检验技术课题名称：免疫标记技术组员：朱恩鹏拉巴卓嘎张燕培汪婷婷

免疫标记技术免疫标记技术指用荧光素、放射性同位素、酶、铁蛋白、胶体金及化学（或生物）发光剂等作为追踪物，标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应。藉助于荧光显微镜、射线测量仪、酶标检测仪、和发光免疫测定仪等精密仪器，对实验结果直接镜检观察或进行自动化测定，可以在细胞、亚细胞、超微结构及分子水平上，对抗原抗体反应进行定性和定位研究；或应用各种液相和固相免疫分析方法，对体液中的半抗原、抗原或抗体进行定性和定量测定。因此，免疫标记技术在敏感性、特异性、精确性及应用范围等方面远远超过一般免疫血清学方法。近年来，随着分子生物学、细胞生物学、基础免疫学和免疫化学等学科的发展以及现代高新技术建立的仪器分析的应用，免疫标记技术也不断完善和更新。各种新技术和新方法不断涌现，至今已成为一类检测微量和超微量生物活性物质的免疫生物化学分析技术，在医学和其他生物学科的研究领域及临床检验中应用十分广泛。根据试验中所用标记物的种类和检测方法不同，免疫标记技术分为免疫荧光技术、放射免疫技术、免疫酶技术、免疫电镜技术、免疫胶体金技术和发光免疫测定等。第一节放射免疫技术放射免疫标记技术是将同位素分析的高灵敏度与抗原抗体反应的特异性相结合，以放射性同位素作为示踪物的标记免疫测定方法，由于此项技术具有灵敏度高（可检测出毫微克（ng）至微微克（pg），甚至毫微微克（fg）的超微量物质，特异性强（可分辨结构类似的抗原）、重复性强、样品及试剂用量少、测定方法易规范化和自动化等多个优点。因此，在医学及其他生物学科的研究领域和临床实验诊断中广泛应用于各种微量蛋白质、激素、小分子药物及肿瘤标志物等的分析与定量测定。（一）放射免疫测定（RIA）放射免疫测定（Radio immunoassay , RIA）是1959 年Yalow 和Berson 首先创建的经典放射免疫分析技术，用于血清中胰岛素含量的测定。30 多年来，由于此项技术灵敏、特异、并已制成多种标准试剂盒，使用方便，应用范围十分广泛。目前国外已成功地应用RIA检测的物质多达300余种，国内研究的被测物质也达百余种，试制的RIA试剂盒已有60余种，是测定各种微量物质不可缺少的手段。（二）免疫放射测定（IRMA）

荧光偏振常用荧光标记物

光波长范围宽，发射光波长范围窄，荧光衰变时间长，最适合用于分辨荧光免疫测定。藻红蛋白（P-phycoerythrin，PE） PE是在红藻中所发现的一种可进行光合作用的自然荧光色素，分子量为240kD 的蛋白，最大吸收峰为564 nm，当使用488 nm激光激发时其发射荧光峰值约为576 nm，对于单激光器的流式细胞仪来说，推荐使用585±21nm的带通滤光片，双激光器的流式细胞仪推荐使用575±13nm的带通滤光片。FL2探测器检测PE。多甲藻叶绿素蛋白（PerCP） PerCP是在甲藻和薄甲藻的光学合成器中发现的，是一种蛋白复合物，分子量约为35kD，最大激发波长的峰值在490nm附近，当被488nm氩离子激光激发后，发射光的峰值约为677nm。FL3探测器检测PerCP。碘化丙啶（ propidium iodide，PI）可选择性地嵌入核酸（DNA、RNA）的双螺旋碱基对中。在对DNA染色时，需用RNase对细胞进行处理，以排除RNA对DNA荧光定量精度的影响。在488nm波长激发下，PI的发射光谱为610-620nm。 FL2探测器检测PI。中间体异硫氰酸荧光素乙二胺（fluorescein t hiocarbamylethylenediamine，EDF）和异硫氰酸荧光素己二胺（fluoresceinthiocarbamyl hexylenediamine，HDF）合成：用甲醇配制1%的三乙胺溶液，分别将20mg（0.3 mmol）乙二胺和34.8 mg（0.3 mmol）己二胺溶于5 ml 甲醇三乙胺溶液中；再将11.7 mg（0.03mmol）FITC 溶于1 ml 甲醇三乙胺溶液中，逐滴加到乙二胺和己二胺溶液中，室温避光搅拌反应1 h，浓缩，硅胶柱层析（乙酸乙酯﹕甲醇＝3﹕1，v﹕v），得到粉末状的EDF 和HDF，电喷雾离子化质谱（ESI-MS）鉴定后，备用。羧基四甲基罗丹明（ＴＡＭＲＡ） 5-氨基荧光素（AF）近年来，菁染料逐渐受到人们的关注。目前研究比较活跃的标记菁染料主要有两大类，一类

分子标记技术综述

分子标记技术及其在植物药材亲缘关系鉴定中的应用分子标记技术分子标记（Molecular Markers）是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接反映[1]。与其他几种遗传标记——形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比，DNA分子标记具有极大的优越性：大多数分子标记为共显性，对隐性性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速[2]。技术种类及原理分子标记技术自诞生起已研究出数十种，尽管方法差异显著，但都具有一个共同点，即用到了分子杂交、聚合酶链式反应（PCR）、电泳等检测手段。应用较为广泛的技术有以下几种： 1.限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphisms，RFLP） RFLP是最早开发的分子标记技术，指基因型间限制性内切酶位点上的碱基插入、缺失、重排或突变引起的，是由Grodzicker等于1974年创立的以DNA-DNA杂交为基础的遗传标记。基本原理是利用特定的限制性内切酶识别并切割不同生物个体的基因组DNA，得到大小不等的DNA片段，所产生的DNA数目和各个片段的长度反映了DNA分子上不同酶切位点的分布情况[3]。通过凝胶电泳分析这些片段，就形成不同带，然后与克隆DNA探针进行Southern 杂交和放射显影，即获得反映个体特异性的RFLP图谱。它所代表的是基因组DNA在限制性内切酶消化后产生片段在长度上差异。由于不同个体的等位基因之间碱基的替换、重排、缺失等变化导致限制内切酶识别和酶切发生改变从而造成基因型间限制性片段长度的差异。 RFLP的等位基因其有共显性特点，可靠性高，不受环境、发育阶段或植物器官的影响。RFLP标记位点数量不受限制，通常可检测到的基因座位数为1—4个，标记结果稳定，重复性好。RFLP技术也存在一些缺陷，主要是克隆可表现基因组DNA多态性的探针较为困难；另外，RFLP分析工作量大，成本高，使用DNA量大，使用放射性同位素和核酸杂交技术，不易自动化，尽管结合PCR技术，RFLP仍在应用，但已不再是主流分子标记。 2.随机扩增多态性DNA（Random Amplification Polymorphism，RAPD） RAPD技术是1990年由William和Welsh等人利用PCR技术发展的检测DNA多态性的方法，其基本原理是利用随机引物（一般为8—10bp）通过PCR反应非定点扩增DNA片段，然后用凝胶电泳分析扩增产物DNA片段的多态性。扩增片段多态性便反映了基因组相应区域的DNA多态性。RAPD所使用的引物各不相同，但对任一特定引物，它在基因组DNA序列上有其特定的结合位点，一旦基因组在这些区域发生DNA片段插人、缺失或碱基突变，就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化，从而导致扩增产物数量和大小发生改变，表现出多态性[4]。就单一引物而言，其只能检测基因组特定区域DNA多态性，但利用一系列引物则可使检测区域扩大到整个基因组，因此，RAPD可用于对整个基因组DNA进行多态性检测，也可用于构建基因组指纹图谱。与RFLP技术相比，RAPD技术操作简便快速，省时省力，DNA用量少，同时无需设计特定的引物，扩增产物具有丰富的多态性。但RAPD也存在一些缺点：(1)RAPD标记是一个显

同位素示踪与荧光标记技术

同位素示踪与荧光标记技术 [热考解读] 1．同位素示踪法 (1)同位素示踪法：用示踪元素标记的化合物，可以根据这种化合物的放射性，对有关的一系列化学反应进行追踪。这种科学的研究方法叫做同位素示踪法，也叫同位素标记法。(2)应用：可用于研究细胞内的元素或化合物的来源、组成、分布和去向等，进而了解细胞的结构和功能、化学物质的变化、反应机理等。还可用于疾病的诊断和治疗，如碘的放射性同位素可以用来治疗甲状腺肿大。 (3)使用注意事项：一次只能使用一种同位素标记 2．荧光标记法荧光标记法(Fluorescent Labeling)是利用荧光蛋白或荧光蛋白基因作为标志物对研究对象进行标记的分析方法。 (1)常用的荧光蛋白为绿色和红色两种 ①绿色荧光蛋白(GFP)常用的是来源于发光水母的一种功能独特的蛋白质，分子量为27 kD，具有238个氨基酸，蓝光或近紫外光照射，发射绿色荧光。 ②红色荧光蛋白来源于珊瑚虫，是一种与绿色荧光蛋白同源的荧光蛋白，在紫外光的照射下可发射红色荧光，有着广泛的应用前景。 (2)人教版教材中用到荧光标记法的地方 ①《必修1》P66“细胞融合实验”：这一实验很有力地证明了细胞膜的结构特点是具有一定的流动性。 ②《必修2》P30“基因在染色体上的实验证据”：通过现代分子生物学技术，运用荧光标记的手段，可以很直观地观察到某一基因在染色体上的位置。 (3)荧光标记法特别是在免疫学研究中也有重要的作用，例如免疫荧光抗体标记法。将已知的抗体或抗原分子标记上荧光素，当与其相对应的抗原或抗体起反应时，在形成的复合物上就带有一定量的荧光素，在荧光显微镜下就可以看见发出荧光的抗原抗体结合部位，检测出抗原或抗体。 [命题设计] 1．(2018·山东青岛一模)同位素标记法常用于追踪物质运行和变化规律的研究，下列相关叙述不正确的是() A．给小鼠供应18O2，其呼出气体中可能含有C18O2 B．用含3H标记的尿嘧啶核糖核苷酸的营养液培养洋葱根尖，只能在分生区细胞中检测到放射性 C．用15N标记DNA分子，可用于研究DNA分子的半保留复制 D．用32P标记的噬菌体侵染大肠杆菌，保温、搅拌、离心后可检测到沉淀物中放射性很高

荧光标记技术在蛋白质定位及功能研究中的应用

荧光标记技术在蛋白质定位及功能研究中的应用 Feb 20, 2010No Comments 随着分子生物学、有机化学以及材料科学等学科的进展，最近我们又获得了好几种新型的荧光蛋白标签，这些标签可以用于细胞生物学成像研究。本文将对荧光标志物在蛋白质研究中的优势及劣势进行一番详细的介绍，文章中将重点介绍如何使用荧光标志物研究活体细胞（而不是固定细胞）中的靶蛋白。使用该方法可以对靶蛋白的表达情况、细胞中的定位情况、活性状态等指标进行研究，还将介绍将荧光显微镜与电子显微镜技术相结合的可行性问题。小分子荧光标志物染料、纳米晶体材料，即所谓的“量子点（quantum dots）”材料、自发荧光蛋白、小分子蛋白质标签等等这些材料都可以作为荧光标志物，而且将这几种材料“混合”起来是一种非常有前途的荧光标志物研究新思路。我们使用荧光技术来研究细胞生物学已经好多年了，而且在从微小的分子层面到完整的有机体层面等各个层面都可以使用荧光技术进行研究。最开始使用的方法是将小分子有机染料与各种抗体相连接，来研究各种目的蛋白。不过这种使用抗体的方法如果需要对细胞内的蛋白质进行研究时，还需要对细胞进行固定和透化操作。因此后来又发展出可以直接在活体细胞内标记某种细胞器、核酸分子或某些离子的荧光标志物。在最近这10年里，荧光蛋白的出现使得进行非侵入性的活体细胞成像成为了可能。使用这种荧光蛋白标志物，我们可以研究目的基因的表达情况，蛋白质运输情况以及各种细胞内动态的生物化学信号通路。使用经过遗传修饰的小分子有机荧光标志物构建的混合系统，我们还可以对蛋白质的寿命进行研究，如果再结合电镜技术和快速光淬灭技术（rapid photoinactivation）还可以对蛋白质的定位情况进行研究。与此同时，半导体纳米晶体材料技术也得到了高度的发展，现在，这种新型的材料在亮度和光稳定性方面都要比传统的荧光标志物好得多，只不过现在这种材料的靶向性还不是很好。本文中我们将对目前荧光标志物及其相关技术的发展进行介绍，同时还将介绍荧光标志物在蛋白质表达、蛋白质活性以及蛋白质功能研究工作中的作用进行介绍。 ?0?2 荧光标志物小分子有机染料小分子有机染料是指分子量小于1KD的小分子物质，这种小分子有机染料可以通过与生物大分子共价连接的方式对其进行标记，我们现在对这种染料的最佳检测波长范围、亮度，即吸光系数、光稳定性和自我淬灭特性都有了比较详尽的了解。利用荧光染料的分子策略包括扩展共轭双键、额外添加环状结构增强其刚性、用氟或磺酸盐这类吸电子性的或带电荷的物质进行修饰等。现在市面上已经有数百种这类荧光染料的商业化产品可供选择，而且还在不断增加之中。不过由于这类染料对蛋白质缺乏特异性，因此多与抗体联用（图1A~C）。?0?2 荧光蛋白第一批用于细胞生物学的荧光蛋白包括藻胆蛋白（phycobiliproteins）和从蓝藻

几种常见的抗体标记方法-酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记

几种常见的抗体标记方法-酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记抗体标记主要有酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记等，还有一些其他的标记方法例如金标记，本文主要讲述了这些抗体标记的基本原理、操作步骤。一、酶标记 1、辣根过氧化物酶(HRP)标记辣根过氧化物酶(HRP)标记单抗和多克隆抗体的常用方法是过碘酸钠法。其原理是HRP的糖基用过碘酸钠氧化成醛基，加入抗体IgG 后该醛基与IgG氨基结合，形成Schiff氏碱。为了防止HRP 中糖的醛基与其自身蛋白氨基发生偶合，在用过碘酸钠氧化前先用二硝基氟苯阻断氨基。氧化反应末了，用硼氢化钠稳定Schiff氏碱。这里介绍两种程序。程序一： (1)将5mg HRP溶于0.5ml 0.1mol/L NaHCO3溶液中;加0.5ml 10mmol/L NaIO4溶液，混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用2小时。 (2)加0.75ml 0.1mol/L Na2CO3混匀。 (3)加入0.75ml小鼠已处理的腹水，或纯化单抗等 (15mg/ml)，混匀。 (4)称取Sephadex

G25干粉0.3g，加入一支下口垫玻璃棉的5ml注射器外筒内;随后将上述交联物移入注射器外套;盖紧，室温作用(避光)3小时或4℃过夜。 (5)用少许PBS将交联物全部洗出，收集洗出液，加 1/20V体积新鲜配制的5mg/ml NaBH4溶液，混匀，室温作用30分钟;再加入3/20V NaBH4溶液，混匀，室温作用1小时(或4℃过夜)。 (6)将交联物过Sephadex g200或Sepharose 6B(2.6×50cm)层析纯化，分管收集第一峰。 (7)酶结合物质量鉴定：克分子比值测定酶量(mg/ml)=OD403×0.4 IgG量(mg/ml)=(OD280-OD403×0.3)×0.62 克分子比值(E/P)=酶量×4/IgG量，一般在1-2之间。酶结合率=酶量×体积/抗体，标记率一般为0.3-0.6，即1-2个HRP分子结合在一个抗体分子上，标记率可大于0.6，0.8，0.9;OD403/OD280等于0.4时，E/P约为1。标记率=OD403/OD280 酶活性和抗体活性的测定可应用ELISA法、免疫扩散、DAB-H2O2显色反应测定酶结合物的酶活性，抗体活性及效

分子标记技术

分子标记技术摘要：分子标记技术就是利用现代分子生物学基础分析DNA分子特性，并借助一些统计工具，将不同物种或同一物种的不同类群区分开来，或者将生物体的某些性状与DNA分子特性建立起来的关联关系，已广泛应用于植物遗传与育种研究的众多领域，包括遗传图谱的构建、遗传多样性分析、物种起源与进化、品种资源与纯度鉴定、分子辅助育种等多个方面，具有重大作用。关键词：分子标记技术原理RFLP RAPD SSR AFLP EST SNP TRAP 分子标记技术应用引言分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA 水平遗传多态性的直接的反映。与其他几种遗传标记——形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比，DNA分子标记具有的优越性有：大多数分子标记为共显性，对隐性的性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速。随着分子生物学技术的发展，DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。一．常用分子标记原理分子标记技术的种类根据不同的核心技术基础，DNA分子标记技术大致可分为三类: 第一类以Southern杂交为核心, 其代表性技术为RFLP；第二类以PCR 技术为核心，如RAPD、SSR、AFLP、STS、SRAP、TRAP等；第三类以DNA序列(mRNA 或单核苷酸多态性)为核心，其代表性技术为EST标记、SNP标记等。理想的分子标记应达到以下的要求：①具有高的多态性；②共显性遗传；③能够明确辨别等位基因；④分布于整个基因组中；⑤选择中性(即无基因多效性)；⑥检测手段简单、快速；⑦开发成本和使用成本尽量低廉；⑧在实验室内和实验室间重复性好。目前，没有任何一种分子标记均满足以上的要求，它们均具有各自的优点和不足。其特点比较见表一。 1．限制性内切酶片段长度多态性标记（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP） 1974年，Grozdicker 等人鉴定温度敏感表型的腺病毒DNA突变体时，发现了经限制性内切酶酶解后得到的DNA片段产生了差异，由此首创了第一代DNA 分子标记技术——限制性内切酶片段长度多态性标记(RFLP)。其原理是由于不同个体基因型中内切酶位点序列不同(可能由碱基插入、缺失、重组或突变等造成)，利用限制性内切酶酶解基因组DNA时，会产生长度不同的DNA酶切片段，通过凝

第八章荧光免疫技术

第八章荧光免疫技术 FluoreSCenCe ImmunoaSsay 第一部分目的要求和教学内容一、目的要求掌握：荧光免疫技术原理、类型及临床应用，常用的荧光物质；熟悉：荧光免疫技术的技术要点；了解：荧光标记物的制备与保存，镧系稀土元素标记物的制备，荧光免疫技术主要类型的技术要点。二、教学内容 1．荧光标记物的制备：荧光和荧光物质，荧光标记物的制备。 2．荧光免疫显微技术：基本原理，技术类型，技术要点，方法评价，临床应用。 3．荧光免疫测定技术：时间分辨荧光免疫测定(基本原理，技术类型，技术要点，方法评价和临床应用)；荧光偏振免疫测定(基本原理，技术类型，技术要点，方法评价和临床应用)。第二部分测试题一、选择题 (一)单项选择题(A型题) 1.如下有关荧光免疫技术正确的提法 A．直观性检测抗原和抗体 B．直观性检测抗原 C．直观性检测抗体 D．间接检测抗原或抗体 E．间接检测抗原和抗体 2．荧光素易受温度影响，操作时通常选择较佳的温度 A．10～15℃ B．15～20℃ C．20～25℃ D．25～30℃ E．30～35℃ 3．荧光抗体保存3～4年，应选择 A．小量分装、4℃ B．瓶分装、4℃ C．瓶分装、-10℃ D．瓶分装,-20℃ E．小量分装、-20℃ 4．下列组成荧光显微镜的结构中，与普通光学显微镜相同的是 A．光源 B．聚光器 C．目镜 D．物镜 E．滤光片

5．下列哪项方法不属于荧光免疫显微技术类型 A．直接法 B．夹心法 C．间接法 D．补体法 E．双标记法 6．荧光抗体染色标本的观察时间 A．当天 B.第二天 C．第三天 D．1周内 E．5天 7．荧光抗体闭接法应标记 A．抗原 B．抗体 C．补体 D．抗抗体 E．抗体及补体 8．荧光显微技术常用于检验血清中各种自身抗体和多种病原体抗体的方法是 A．直接法 B．间接法 C．双抗体夹心法 D．补体法 E．双标记法 9．荧光抗体间接法可检测 A．抗原 B．抗体 C.补体 D．蛋白质 E．抗原和抗体 lO．在荧光显微镜检查中直接影响检测结果的是 A．抗原荧光染色 B．抗体荧光染色 C．补体荧光染色 D．特异性荧光染色 E．非特异性荧光染色 11．主要用于测定各种激素、蛋白质、酶、药物及病毒抗原的技术 A．荧光偏振免疫测定 B．荧光免疫显微技术 C．时间分辨荧光免疫测定 D．底物标记荧光免疫测定 E．流式荧光免疫技术 12．临床药物浓度检测的首选方法

荧光材料基本知识

1.把各种能量转换为光能的过程主要有两种: 其一是热辐射，其二是发光。 2. 按照激发能的不同可以把发光分类为光致发光（紫外波段发光或真空紫外波段发光激发）、阴极射线发光（电子束流激发）、电离辐射发光（Ｘ射线、γ射线及高能离子激发）、电致发光（直流或交流电场激发）、化学发光（由化学反应能激发）、生物发光（由生物能激发）、摩擦发光（由机械应力激发）等。 3. 发光材料是由作为材料主体的化合物（基质）和选定掺入的少量以至微量的杂质离子（激活剂）所组成，有时还掺入另一种杂质离子作为敏化剂。 4. 荧光，又作“萤光”，是指一种光致发光的冷发光现象。当某种常温物质经某种波长的入射光（通常是紫外线或X射线）照射，吸收光能后进入激发态，并且立即退激发并发出比入射光的的波长长的出射光（通常波长在可见光波段）；而且一旦停止入射光，发光现象也随之立即消失。具有这种性质的出射光就被称之为荧光。在日常生活中，人们通常广义地把各种微弱的光亮都称为荧光，而不去仔细追究和区分其发光原理。 5. 荧光淬灭（fluorescence quenching）又称荧光熄灭或萃灭：是指导致特定物质的荧光强度和寿命减少的所有现象。 6.荧光熄灭剂:引起荧光熄灭的物质称为荧光熄灭剂。如，卤素离子、重金属离子、氧分子以及硝基化合物、重氮化合物、羧基和羰基化合物均为常见的荧光熄灭剂。

7.荧光淬灭的原因很多，机理也很复杂，主要包括：①因荧光物质的分子和熄灭剂分子碰撞而损失能量；②荧光物质的分子与熄灭剂分子作用生成了本身不发光的的配位化合物；③溶解氧的存在，使得荧光物质氧化，或是由于氧分子的顺磁性，促进了体系间跨越，使得激发单重态的荧光分子生在荧光物质分子与猝灭剂分子之间 8.静态猝灭：当基态荧光分子与猝灭剂之间通过弱的结合生成复合物，且该复合物使荧光猝灭的现象称为静态猝灭。动态猝灭：如果激发态荧光分子与猝灭剂碰撞使其荧光猝灭则称为动态猝灭。动态猝灭：温度增高，猝灭增强；静态猝灭：温度增高，猝灭降低。转变至三重态；④当荧光物质浓度过大时,会产生自淬灭现象。 9. 量子效率也称量子收率, 是指荧光物体分子发射的光量子数与吸收的光量子数之比。其大小是由分子结构决定的, 而与激发光源的能量无关。 10.拉曼散射光谱是指分子对入射光所产生使其频率发生较大改变的一种光散射现象。激光拉曼光谱主要的一些特点: (l)每种物质(分子)都有自己完全独立的特征谱线，因此每种物质的特征谱线可以表征这一物质。(2)拉曼谱线的线宽大多数较窄，并且往往都是成对出现的，也就是具有完全相同大小的正负频差。这两条谱线在短波一边的叫做反斯托克斯谱线，在长波一边的叫做斯托

分子标记技术的类型原理及应用

分子标记 1.分子标记技术及其定义 1974年,Grozdicker等人在鉴定温度敏感表型的腺病毒DNA突变体时, 利用限制性内切酶酶解后得到的DNA片段的差异, 首创了DNA分子标记。所谓分子标记是根据基因组DNA存在丰富的多态性而发展起来的可直接反映生物个体在DNA水平上的差异的一类新型的遗传标记,它是继形态学标记、细胞学标记、生化标记之后最为可靠的遗传标记技术。广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质分子。通常所说的分子标记是指以DNA多态性为基础的遗传标记。分子标记技术本质上都是以检测生物个体在基因或基因型上所产生的变异来反映基因组之间差异。 2.分子标记技术的类型分子标记从它诞生之日起, 就引起了生物科学家极大的兴趣,在经历了短短几十年的迅猛发展后, 分子标记技术日趋成熟, 现已出现的分子标记技术有几十种, 部分分子标记技术所属类型如下。 2.1 建立在Southern杂交基础上的分子标记技术 (1) RFLP ( Rest rict ion Fragment Length Polymorphism)限制性内切酶片段长度多态性标记； (2) CISH ( Chromosome In Situ Hybridization) 染色体原位杂交。 2.2 以重复序列为基础的分子标记技术 (1) ( Satellite DNA ) 卫星DNA； (2) ( Minisatellite DNA ) 小卫星DNA; (3) SSR( Simple Sequence Repeat ) 简单序列重复, 即微卫星DNA。 2.3 以PCR为基础的分子标记技术 (1) RAPD ( Randomly Amplif ied Polymorphic DNA ) 随机扩增多态性DNA； (2) AFLP( Amplif ied Fragment Length Polymorphism) 扩增片段长度多态性； (3) SSCP( Single Strand Conformation Polymorphism) 单链构象多态性； (4) cDNA-AFLP( cDNA- AmplifiedFragment Length Polymorphism) cDNA -扩增片段长度多态性； (5) TRAP( Target Region Amplified Polymorphism) 靶位区域扩增多态性； (6) SCAR ( Sequence Char acterized Amplified Region) 序列特征化扩增区域； (7) SRAP ( Sequencerelated Amplified Polymorphism) 相关序列扩增多态性。 2.4以mRNA为基础的分子标记技术

荧光素FITC标记抗体的方法

荧光素FITC标记抗体的方法当FITC在碱性溶液中与抗体蛋白反应时，主要是蛋白质上赖氨酸的r氨基与荧光素的硫碳胺键(thiocarbmide)结合，形成FITC-蛋白质结合物，即荧光抗体或荧光结合物。一个IgG分子中有86个赖氨酸残基，一般最多能结合15～20个，一个IgG分子可结合2～8个分子的FITC，其反应式如下 FITC-N=C=S + N-H2-蛋白质→ FITC-NS-C-N-H2-蛋白质常用Marsshall(1958)法标记荧光抗体，也可以根据条件采用Chadwick等标记法或Clark等(1963)的透析标记法。 1．Marsshall法 (1)材料抗体球蛋白溶液、0．5mol／L(pH9．0)碳酸盐缓冲液、无菌生理盐水、异硫氰酸荧光素、1％硫柳汞水溶液、50ml小烧杯、4℃冰箱、电磁搅拌器、透析袋、玻棒、pH7．2或 3．0的0．01mol／LPBS等。 (2)方法及步骤①抗体的准备取适量已知浓度的球蛋白溶液于烧杯中，再加人生理盐水及碳酸盐缓冲液，使最后免疫球蛋白浓度为

20mg／ml，碳酸盐缓冲液容量为总量的1／10，混匀，将烧瓴置电磁搅拌器上(速度适当以不起泡沫为宜)5～10min。 ②荧光素的准备根据欲标记的蛋白质总量，按每毫克免疫球蛋白加0．01mg荧光色素，用分析天平准确称取所需的异硫氰酸荧光素粉末。也可用下述公式计算出免疫球蛋白、荧光素的量，还可以算出需加缓冲液的量。 a．蛋白溶液：含量Amg／m1；容积Bml。 b．总蛋白量(AXB)＝Crag。 c．C／20～C／10＝Dmg(如蛋白含量低于20mg／ml，用C／10；如高于20mg／ml，用C／20)。 d．荧光素FITC的量：(1／50～2／100)XC＝Emg。 e．巳0．5mol／L(pH9．5)碳酸盐缓冲液D／10＝Fml。 f．PBS量D-(B+F)=Gml。注：A为蛋白含量，mg／ml；B为蛋白质溶液的容积；C为蛋白总量，mg；D为常数，mg；正为荧光素的量，mg；F为碳酸盐缓冲液的容积，ml；G为PBS的容积，ml。 ③结合(或标记) 边搅拌边将称取的荧光色素渐渐加入球蛋白溶液中，避免将荧光素粘于烧瓶壁(大约在5—10min内加完)，加完后，

时间分辨荧光分析技术

1.1 时间分辨荧光分析技术时间分辨荧光生化分析技术是基于稀土荧光配合物特殊的荧光性质而建立起来的，自1978年提出以来[1]，已广泛的应用于免疫分析、核酸测定、荧光显微镜成像、细胞识别、单细胞原位测定、生物芯片等生化领域，并发展出了相应的时间分辨荧光免疫测定法、时间分辨荧光DNA 杂交测定法、时间分辨荧光显微镜成像测定法、时间分辨荧光细胞活性测定法及时间分辨荧光生物芯片测定法等分支。本节主要对稀土荧光配合物的发光机理、荧光性质，时间分辨荧光测定的原理，时间分辨荧光免疫分析技术，时间分辨荧光显微镜成像技术的研究进展等加以介绍。 1.1.1 稀土荧光配合物的发光机理及荧光性质稀土元素指的是元素周期表中IIIB 族的镧系元素以及钪和钇，共17种元素。其中镧系元素的外层电子结构为4f 0-145d 0-106s 1-2，由于5s 和5p 电子对4f 电子的屏蔽作用，导致这些金属及其离子的性质十分相似。图1.1给出了四种三价稀土离子的基态及激发态电子能级图[2]。 1020 152530355 E N E R G Y ,103c m -1 6 H 5/2 G 5/2 6 H 15/2 7 F 0 F 2D 0 5D 1 7F 6 F 5 4 5D 3 13/2 4 9/2 Sm 3+ Eu 3+ Tb 3+ Dy 3+ H 9/2 图1.1 部分三价稀土离子的电子能级图 Fig. 1.1 Electronic energy levels of certain lanthanide(III) ions 大部分稀土离子本身是不具有荧光性质的，只有Sm 3+、Eu 3+、Tb 3+和Dy 3+的水溶液在紫外光或可见光的激发下能够发出微弱的荧光。当Sm 3+、Eu 3+、Tb 3+和Dy 3+与某些有机配位体形成配合物时其荧光强度会显著增强，这种发光是基于配合物内由配位体到中心稀土离子的能量转移所产生的[3-8]。以铕(III)配合物为

时间分辨荧光免疫分析法(Time-resolved fluoroimmunoassay)操作

时间分辨荧光免疫分析法(Time-resolved fluoroimmunoassay)是在荧光分析的基础上发展起来的一种特殊的荧光分析。它利用具有长效荧光的稀土金属（Eu、Tb、Sm、Dy）作标记物，充分利用激发光与发射光之间的降移与发射光较长的半寿期，在激发光后延时测量发射光的强度。从而所测的荧光不受激发光和被检物中的非特异荧光干扰，提高了检测的特异性与灵敏度。在激发光后延时400微秒，测量400微秒，间歇200微秒后进入下一个测量周期，每一个周期为1000微秒。对每一个样品实施1秒钟的测量，意味着完成了1000个周期的测量，测量精确度极高。（一）Auto DELFIA自动时间分辨荧光免疫分析仪开/关程序 1 开机 1.1 依次打开样品处理器电源，微孔板处理器电源，打印机电源。 1.2 打开计算机显示器。 1.3 启动计算机。 1.4 运行系统软件：Auto DELFIA与Multicalc系统软件在Windows启动后自动运行。Auto DELFIA workstation软件用于控制Auto DELFIA的运行，MultiCalc的主要功能是与主机通讯，对测试结果进行评估和对质控及其他数据处理（可通过双击屏幕上图标不运行）。在MultiCalc Auto DELFIA环境下，只有键盘有效，鼠标无效。 2 开机后准备 1.1 清洗液准备 1.1.1 微孔板处理器洗液（250ml浓缩液＋600ml去离子水混合），每做一块板至少1升用量，洗液在密闭条件可保存2周时间。 1.1.2 准备样品处理器洗液（50ml浓缩液＋5000ml去离子水混合），每做一块板至少需要800ml洗液，洗液在密闭条件下可保存1周时间。 1.2 样品处理器准备 1.2.1 在Wash bottle（清洗液瓶）、Rinse bottle (冲洗液瓶)分别注入足够用量的清洗液和去离子水，倒空废液瓶。拧紧各瓶盖，确保废液瓶管路向下。 1.2.2 如样品需要稀释，放入稀释杯和稀释液。系统安装时已调好有71ml和190ml两种规格的稀释杯，若使用71ml的稀释杯，从最右端开始放置，如有预处理样品，则不能使用190ml 的稀释杯。不能使用多个稀释杯。 1.3 微孔板处理器准备。

荧光标记二抗的选择

荧光标记二抗的选择来源: 生物耗材网发布日期: 2012-2-28 一般来讲，耦联到二抗上的探针主要有酶（辣根过氧化酶HRP和碱性磷酸酶AP或其衍生物APAAP，PAP），荧光基团（FITC, RRX, TR, PE, Rhodamine）和生物素。选用哪种探针的二抗主要取决于具体的实验。对于Western Blot和ELISA，最常用的二抗是酶标二抗；而细胞或组织标记实验（细胞免疫化学，组织免疫化学，流式细胞术）中通常使用荧光标记的二抗。如果想要更大程度的放大检测信号，可以使用Biotin/Avidin检测系统。其中荧光素是具有光致荧光特性的染料，荧光染料种类很多，目前常用于荧光标记二抗有以下几种：【异硫氰酸荧光素-Fluorescein Isothiocyanate (FITC)荧光标记二抗】FITC 纯品为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水和酒精溶剂。FITC分子量为389.4，最大吸收光波长为490～495nm，最大发射光波长为520～530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。FITC在冷暗干燥处可保存多年，是目前应用最广泛的荧光素。由于FITC是小分子化合物，每一个抗体可标记几个FITC分子，IgM通常用小分子的荧光素标记，如FITC、Cy3/5、Texas Red等。FITC荧光二抗主要优点是人眼对黄绿色较为敏感，通常切片标本中的绿色荧光少于红色。然而FITC 的最大缺点是淬灭快，因此要和抗淬灭剂一起使用。【四甲基异硫氰酸罗丹明-Tetramethyl Rhodamin Isothiocyanate(TRITC)，Rhodamine Red-X(RRX), Texas Red(TR)荧光标记二抗】这些罗丹明的衍生物耦联基团具有不同的吸收波长(550, 570, 596nm)和最大发射波长（570, 590, 620nm）。尽管TRITC经常和FITC一起在双标记实验中使用，使用RRX和TR可以得到更好的颜色区分。在使用装有氪氩灯的激光共聚焦扫描显微镜作三标记的实验时，RRX尤其有用，可以和Cy2(或者FITC)和Cy5一起使用，因为RRX的发射波长在Cy2和Cy5中间，而且和这两者覆盖都很少。氪氩灯激发光为488nm，598nm和647nm，分别是Cy2(FITC), RRX和Cy5的理想激发波长。因为FITC和PE可以被氩灯的488nm波长激发, 在流式细胞仪中用FITC作双标，另一种用藻红蛋白（PE）耦联基团要比罗丹明好。TRITC 为罗丹明的衍生物，呈紫红色粉末，较稳定。最大吸收光波长为550nm，最大发射光波长为620nm，呈现橙红色荧光，与FITC的绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色。因其荧光淬灭慢，也可用于单独标记染色。【菁类染料-Cyanine dyes(Cy2, Cy3, Cy5)】 Cy2 耦联基团激发波长为492nm，发光为波长510nm的绿色可见光。Cy2和