第八章酶的定向进化
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第八章定向进化
第八章 酶的定向进化
• • 第一节 定向进化简介 第二节 定向进化的应用
第一节 定向进化简介
• • • • 一．理论来源 二．概念 三．定向进化的选择策略 四．杂合酶
一．理论来源
• 利用基因工程原理可以在实验室中模拟生 物进化过程
– 化学进化 – 生物进化
二．概念
• 酶分子改造,基于序列的合理化设计， sequential rational design
– 化学修饰，定点突变
• 定向进化，非合理设计 irrational design
酶分子的合理设计： 酶分子的合理设计： • 利用各种生物化学，晶体学，光谱学等方 法对天然酶或其突变体进行研究，获得酶 的分子特征、空间结构、结构和功能之间 的关系以及氨基酸残基功能等方面的信息， 以此为依据对酶分子进行改造。 酶分子的非合理设计： 酶分子的非合理设计： • 不需要准确的酶分子结构信息而通过随机 突变，基因重组，定向筛选等方法对其进 行改造。
• functional lipase secreted by Recombinants screened with BMMY plates
SDS-PAGE analysis of lipase on expression and purification
Model Chiral Reaction Catalyzed by Lipase B52
酶分子存在进化潜力的原因
1.天然酶在生物体内存在的环境和酶实际应 用的环境的不同。如非水相作为筛选压力。 2.生命体内的单个酶的进化受到整体调节， 进化机会有限。 3. 非生物体内所涉及的酶或蛋白质的性质， 如蛋白类药物改造消除其副作用。
三．定向进化的选择策略
定向进化=随机突变 正向重组 选择（或筛选） 定向进化 随机突变+正向重组 选择（或筛选） 随机突变 正向重组+选择 – 关键：突变和筛选 – 突变，采用回交法消除不利突变和中性突变 – 筛选，筛选方法必须灵敏，至少与目的性质有 关。 例：蛋白酶选择平板初选，配合活性染色和X 光片消化分析，44000个突变株筛选
• • 第一节 定向进化简介 第二节 定向进化的应用
第一节 定向进化简介
• • • • 一．理论来源 二．概念 三．定向进化的选择策略 四．杂合酶
一．理论来源
• 利用基因工程原理可以在实验室中模拟生 物进化过程
– 化学进化 – 生物进化
二．概念
• 酶分子改造,基于序列的合理化设计， sequential rational design
– 化学修饰，定点突变
• 定向进化，非合理设计 irrational design
酶分子的合理设计： 酶分子的合理设计： • 利用各种生物化学，晶体学，光谱学等方 法对天然酶或其突变体进行研究，获得酶 的分子特征、空间结构、结构和功能之间 的关系以及氨基酸残基功能等方面的信息， 以此为依据对酶分子进行改造。 酶分子的非合理设计： 酶分子的非合理设计： • 不需要准确的酶分子结构信息而通过随机 突变，基因重组，定向筛选等方法对其进 行改造。
• functional lipase secreted by Recombinants screened with BMMY plates
SDS-PAGE analysis of lipase on expression and purification
Model Chiral Reaction Catalyzed by Lipase B52
酶分子存在进化潜力的原因
1.天然酶在生物体内存在的环境和酶实际应 用的环境的不同。如非水相作为筛选压力。 2.生命体内的单个酶的进化受到整体调节， 进化机会有限。 3. 非生物体内所涉及的酶或蛋白质的性质， 如蛋白类药物改造消除其副作用。
三．定向进化的选择策略
定向进化=随机突变 正向重组 选择（或筛选） 定向进化 随机突变+正向重组 选择（或筛选） 随机突变 正向重组+选择 – 关键：突变和筛选 – 突变，采用回交法消除不利突变和中性突变 – 筛选，筛选方法必须灵敏，至少与目的性质有 关。 例：蛋白酶选择平板初选，配合活性染色和X 光片消化分析，44000个突变株筛选
2011酶工程 第八章 酶的定向进化
普通筛选方式
常见的96孔板高通量筛选技术
1 平板筛选技术
1）根据细胞生长情况筛选突变基因 热 抗生素 pH 高渗透压 低温 有毒物及抑制剂
OD-Monitor OD值测定传感器
2） 依据颜色变化筛选
颜色变化是最简便的追踪酶反应的方法，如用对硝 基苯基衍生物检测水解酶的活性。根据水解释放出的 黄色对硝基苯酚或对硝基苯胺来进行检测。下图显色 底物可检测葡萄糖苷酶。 碱性条件显色pH8 大多数酶并不能直接引起颜色变化，为了检测一个没 有生色集团的底物的反应，需要将反应产物转变为一 个有色化合物。
Stemmer W P C. , Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91: 10747- 10751
二 酶稳定性-耐有机溶剂
2001年，Song 和Rhee利用随机突变和重组的方法筛选得到 三株磷脂酶A1 突变体,可以在有机溶剂存在的条件下有效的 发挥作用, 其稳定性和活性都得到较大的提高。 Song J K, Rhee J S. Biochim Biophys Acta , 2001 , (1547) : 370～ 378. Arnold 等用定向进化方法提高P450 BM3对有机溶剂ＤＭＳ Ｏ耐受力提高了６倍，对ＴＨＦ的耐受力提高了１０倍。
基因型
表达型
融合蛋白
PIII
Lead
Hv
Link
Lv
E
PIII
4 酵母细胞表面展示技术
S. cerevisiae 易培养、安全、适用范围广
适用于真核生物蛋白库的构建，有较高的库容量
（ 105 -106 )
展示可溶性蛋白（104 -105 protein copies/cell），
酶工程课件 5 第八章_酶定向进化
通常采用连续易错PCR ( Sequential error prone PCR) ： 将一次PCR 扩增得到的有益突变基因作为下一次PCR 扩增的模板, 连续反复进行随机诱变。
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8.2.2 基因体外随机突变方法--易错PCR技术
易错PCR应用实例
Chen.K和Arnold采用易错PCR对枯草杆菌蛋白酶进行了 体外进化研究。他们通过降低反应体系中dATP的浓度,对 编码该酶从第49位氨基酸到C端的DNA片段进行易错 PCR,经筛选得到的几个突变株在高浓度的二甲基甲酰胺 (DMF)中酶活性明显提高,其中突变体PC3在60%的DMF 中,酶活力是野生型的256倍。将PC3再进行两个循环的定 向进化,得到的突变体酶活力比PC3还要高3倍。
7/169
生物的自然进化
➢进化过程：
突变→自然选择→遗传后代
➢进化结果：
基因多样性： 为完成同一功能所表现出的 多个 基因或同一个基因(同源性)
代谢途径的多样性： 同样产物，多条途径 代谢产物的多样性： 同一底物，不同产物
8/169
如何利用相对简单快速的方法对天然 酶的改造或构建新的非天然酶？
5/169
天然酶的局限性
酶催化的精确性和有效性常常不能很好地满足 酶学研究和工业化应用的要求 稳定性差 活性低使催化效率很低 缺乏有商业价值的催化功能
天然酶的局限性源于酶的自然进化过程。
6/169
现代生物工程对酶的要求
1、能具备长期稳定性和活性 2、能适用于水及非水相环境 3、能接受不同的底物甚至是自然界不存在的合成底物 4、进一步增强酶对多种底物的分解能力
用于突变后的分子群，起着选择某一方向的进化而排 除其他方向突变的作用，整个进化过程完全是在人为 控制下进行的
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8.2.2 基因体外随机突变方法--易错PCR技术
易错PCR应用实例
Chen.K和Arnold采用易错PCR对枯草杆菌蛋白酶进行了 体外进化研究。他们通过降低反应体系中dATP的浓度,对 编码该酶从第49位氨基酸到C端的DNA片段进行易错 PCR,经筛选得到的几个突变株在高浓度的二甲基甲酰胺 (DMF)中酶活性明显提高,其中突变体PC3在60%的DMF 中,酶活力是野生型的256倍。将PC3再进行两个循环的定 向进化,得到的突变体酶活力比PC3还要高3倍。
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生物的自然进化
➢进化过程：
突变→自然选择→遗传后代
➢进化结果：
基因多样性： 为完成同一功能所表现出的 多个 基因或同一个基因(同源性)
代谢途径的多样性： 同样产物，多条途径 代谢产物的多样性： 同一底物，不同产物
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如何利用相对简单快速的方法对天然 酶的改造或构建新的非天然酶？
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天然酶的局限性
酶催化的精确性和有效性常常不能很好地满足 酶学研究和工业化应用的要求 稳定性差 活性低使催化效率很低 缺乏有商业价值的催化功能
天然酶的局限性源于酶的自然进化过程。
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现代生物工程对酶的要求
1、能具备长期稳定性和活性 2、能适用于水及非水相环境 3、能接受不同的底物甚至是自然界不存在的合成底物 4、进一步增强酶对多种底物的分解能力
用于突变后的分子群，起着选择某一方向的进化而排 除其他方向突变的作用，整个进化过程完全是在人为 控制下进行的
酶的定向进化
2019/11/9
酶分子改造技术的分类 • 一是基于序列的合理化设计方案，如化学修饰，
定点突变等；二是利用基因的可操作性，通过模 拟自然界的演化进程进行非合理化设计方案。
酶分子的定向进化属于蛋白质的非合理设计 方式。
2019/11/9
酶分子定向进化的历史
• 1993年,美国科学家Arnold F H首先提出酶 分子的定向进化的概念,并用于天然酶的改 造或构建新的非天然酶.
2019/11/9
DNA
单一基因
重 组 原 理 图 示
2019/11/9
3.外显子改组技术
• 外显子改组(exonshuffling)类似于DNA改组, • 两者都是在各自含突变的片段间进行交换,
与DNA改组不同,外显子改组是靠同一种分 子间内含子的同源性带动,而DNA改组不受 任何限制,发生在整个基因片段上。外显子 改组更适用于真核生物,并可获得各种大小 的随机肽库。
酶分子的定向进化
2019/11/9
制作人：杨永亮 09级---生物工程
酶分子的定向进化
概念：模仿自然进化过程的人工进化策略。不需要事先了解 蛋白质的结构和作用机制，去获得期望功能或全新功能的蛋 白质或DNA。如从一个靶基因或一群相关家族基因或DNA 开始，用突变或重组等此方 法正在发展中。
1994年Stemmer等人首次利用基因从 组技术获得了理想的突变体，开拓了 酶分子定向进化的方法。
2019/11/9
• 2019年, Ryota等为基因片段重组这一思 想增添ndomInsertional - deletionalStrand
筛选
正突变基因
进化酶
目前酶定向进化的主要策略
• 1.易错PCR 技术 • 是指利用TaqDNA聚合酶不具有3’-5’ 外切酶活力，或改
酶分子改造技术的分类 • 一是基于序列的合理化设计方案，如化学修饰，
定点突变等；二是利用基因的可操作性，通过模 拟自然界的演化进程进行非合理化设计方案。
酶分子的定向进化属于蛋白质的非合理设计 方式。
2019/11/9
酶分子定向进化的历史
• 1993年,美国科学家Arnold F H首先提出酶 分子的定向进化的概念,并用于天然酶的改 造或构建新的非天然酶.
2019/11/9
DNA
单一基因
重 组 原 理 图 示
2019/11/9
3.外显子改组技术
• 外显子改组(exonshuffling)类似于DNA改组, • 两者都是在各自含突变的片段间进行交换,
与DNA改组不同,外显子改组是靠同一种分 子间内含子的同源性带动,而DNA改组不受 任何限制,发生在整个基因片段上。外显子 改组更适用于真核生物,并可获得各种大小 的随机肽库。
酶分子的定向进化
2019/11/9
制作人：杨永亮 09级---生物工程
酶分子的定向进化
概念：模仿自然进化过程的人工进化策略。不需要事先了解 蛋白质的结构和作用机制，去获得期望功能或全新功能的蛋 白质或DNA。如从一个靶基因或一群相关家族基因或DNA 开始，用突变或重组等此方 法正在发展中。
1994年Stemmer等人首次利用基因从 组技术获得了理想的突变体，开拓了 酶分子定向进化的方法。
2019/11/9
• 2019年, Ryota等为基因片段重组这一思 想增添ndomInsertional - deletionalStrand
筛选
正突变基因
进化酶
目前酶定向进化的主要策略
• 1.易错PCR 技术 • 是指利用TaqDNA聚合酶不具有3’-5’ 外切酶活力，或改
第八章酶分子的定向进化概要
张今等为解决空间结构未知酶的蛋白质工程问题 以天冬氨酸为模型通过控制DNA合成的碱基底物 种类和浓度比例实现碱基对的错配，向目的基因 引入突变同时限制突变减少筛选突变体的工作量， 探索了一种称为酶法体外随机、定向改造酶分子 的途径。
9
三、发展阶段
易错PCR(error-prone PCR)和DNA改组方 法成功开发标志着酶分子定向进化技术的成 熟。 在酶分子的定向进化改造中，易错PCR和 DNA改组技术配合使用通过随机突变和优势 重最早使用的载体系统，在载体本身的设计方面
已经相当成熟。 优点：
插入片段的载容量大，适合于大片段的克隆。 感染效率高、鉴定容易，有较好的质量控制指标。 基因质量高、代表性好，稳定性好，适合长期
▪ 酶分子的定向进化（directed evolution）即属于 蛋白质的非合理设计。
3
三、发展方向
酶催化的精确性和有效性往往并不能满足通常的工业 化要求，天然酶通常缺乏有商业价值的催化功能及其 他性质。因此，对天然酶分子水平上的改造，显得十 分重要。
酶分子仍具有巨大的进化潜力，是酶的体外定向进化 的基本先决条件。
关于外显子在蛋白质进化中的作用有两种观点：
“原生内含子”假说：认为当前所有的蛋白质都 经过外显子改组；
“后生内含子”假说：认为外显子改组仅出现在 真核细胞中，以提高这些生物基因的韧性。
两种假说都承认外显子改组是蛋白质进化的重要 机制，因此人为模拟此自然进化过程定向进化酶 分子将是获得新酶的颇具吸引力的途径。
21
七、突变库的构建及应用（一）构建理想的基因要考虑的因素1.基因的质量
（1）基因的代表性中包含的DNA分子应能完整地反映来源基因
（2）突变基因片段的序列完整性中重组或突变DNA片段应尽可能完整地反映出天然 基因的结构。
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三、发展阶段
易错PCR(error-prone PCR)和DNA改组方 法成功开发标志着酶分子定向进化技术的成 熟。 在酶分子的定向进化改造中，易错PCR和 DNA改组技术配合使用通过随机突变和优势 重最早使用的载体系统，在载体本身的设计方面
已经相当成熟。 优点：
插入片段的载容量大，适合于大片段的克隆。 感染效率高、鉴定容易，有较好的质量控制指标。 基因质量高、代表性好，稳定性好，适合长期
▪ 酶分子的定向进化（directed evolution）即属于 蛋白质的非合理设计。
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三、发展方向
酶催化的精确性和有效性往往并不能满足通常的工业 化要求，天然酶通常缺乏有商业价值的催化功能及其 他性质。因此，对天然酶分子水平上的改造，显得十 分重要。
酶分子仍具有巨大的进化潜力，是酶的体外定向进化 的基本先决条件。
关于外显子在蛋白质进化中的作用有两种观点：
“原生内含子”假说：认为当前所有的蛋白质都 经过外显子改组；
“后生内含子”假说：认为外显子改组仅出现在 真核细胞中，以提高这些生物基因的韧性。
两种假说都承认外显子改组是蛋白质进化的重要 机制，因此人为模拟此自然进化过程定向进化酶 分子将是获得新酶的颇具吸引力的途径。
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七、突变库的构建及应用（一）构建理想的基因要考虑的因素1.基因的质量
（1）基因的代表性中包含的DNA分子应能完整地反映来源基因
（2）突变基因片段的序列完整性中重组或突变DNA片段应尽可能完整地反映出天然 基因的结构。
第八章 酶定向进化
其基本操作过程如下 : 靶基因经随机突 变产生含不同突变类型的亲本基因群, 用 DNase I 随机切割; 得到的片段经过不加 引物的多次PCR 循环, 在该过程中, 这些 片段之间互为引物和模板进行扩增, 直至 获得全长基因; 再加入基因的两端引物进 行常规PCR, 最终获得发生改组的基因库。
2.1交错延伸重组(Stagger extension process)
图给出最常用的大肠杆菌克隆用质粒pUC19的图 谱，此质粒的复制起点处序列经过改造，能高频 率起动质粒复制，使一个细菌pUC19的拷贝数可 达500-700个； 质粒携带一个抗氨芐青霉素基因，编码能水解β内酰胺环，从而破坏氨芐青霉素的酶，当用 pUC19转化细菌后放入含氨芐青霉素的培养基中， 凡不含pUC19者都不能生长，结果长出的细菌就 是都含有pUC19的。
它是由两个相互独立的关键技术组成. 一个是随机基因文 库的构建, 另一个是特定酶( 特别是增加催化活性、增强 选择性或稳定性) 的筛选策略。
第二节 定向进化的方法
一、酶基因的随机突变
1.易错PCR技术 (Error prone PCR)
易错PCR 是指从酶的单一基因出发，通过 改变PCR 的反应条件 , 使碱基在一定程度上 随机错配而引入多点突变, 构建 行全面的筛选。为此要求构建 可能完变基库容量。
所有的质粒载体都有三个 共同的特征：一个复制子、一 个选择性标志和一个克隆位点。 复制子是含有DNA复制起始 位点的一段DNA（ori），也包 括表达由质粒编码的复制必需 的RNA和蛋白质的基因。 选择性标志对于质粒在细 胞内持续存在时必不可少的。 克隆位点是限制性内切酶 切割位点，外源性DNA可由此插 入质粒内，而且并不影响质粒 的复制能力，或为宿主提供选 择性表型。
酶工程 第八章 酶的定向进化 (1)
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酶的定向进化
• 基于序列的理性设计：分子修饰
利用已知酶分子的空间结构、结构和功能之间关系， 以及氨基酸残基功能等信息，对酶分子进行改造； • 利用基因操作模拟自然进化的非理性设计：定向进化 不需要准确的酶分子结构信息而通过随机突变、基 因重组等方法模拟自然进化机制在体外改造酶基因， 并定向筛选出所需突变酶；
• 缓冲液中另加0.5mmol/L Mn2+ • 提高Mg2+浓度
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1、易错PCR
• 优点：操作简便，随机突变的定向进化
• 难点：要控制好突变率
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1、易错PCR
连续易错PCR： 将一次PCR扩增得到的有用突变基因作为下一 次PCR扩增的模板，连续反复地进行随机诱变。
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酶的定向进化
酶定向进化的概念： 模拟自然进化（随机突变和自然选择） 的过程，在体外进行酶基因的人工随机突 变，并在人工控制条件的特殊环境下进行 定向选择，得到具有优良催化特性的酶的 突变体。所得到的酶称为进化酶。
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酶的定向进化
• 主要过程： 1、随机
DNA 改组 (DNA shuffling)
交错延伸PCR 随机引物体外重组 基因家族重排
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PCR
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1、易错PCR
• Taq酶不具有3’5’ 方向的 外切酶活性，有一定的错配 几率（5×10-5） • 易错PCR：提高PCR过程 的错配几率
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1、易错PCR
方法：
• 改变4种底物的浓度比，或降低一种dNTP的量（降 至5％-10％），同时加入dITP来代替被减少的 dNTP；
• 基因重组（of chapter 8
8.1进化的应用
34
第八章酶的定向进化
➢ 缺点：正突变基因少，需多次PCR。 定向进化的基本规则是“获取你所筛选的突变体”。
结果对单基因进化得到的突变酶中，对头孢羟羧氧胺的抗性最高的增加了8倍，而用家族同源重组进化的方法使抗性比其中两种微生物 来源的天然酶提高270倍，比段，经过不加引物的多次PCR循环，使DNA的碱因与载体重组，再转入 适宜的细胞或包装成重组λ黏粒载体
➢ 转化 ➢ 噬菌粒载体
➢ 转导
2、突变基因的筛选 （1）定向选择环境条件的设定 （2）高通量筛选技术
定向进化的特点 ➢ 适应面广； ➢ 目的性强； ➢ 效果显著。
定向进化的原理 ➢ 以很低的比率向目的基因中随机引入突变，构建突
变库，凭借定向的选择方法，选出所需性质的优化 酶(或蛋白质)，从而排除其他突变体。 ➢ 定向进化的基本规则是“获取你所筛选的突变体”。 ➢ 定向进化=随机突变+定向选择。
2、DNA重排技术为代表的有性进化 DNA重排技术：又称DNA改组技术，有性PCR片段，经过不加引物的 多次PCR循环，使DNA的碱基序列重新排布而引 起基因突变的技术突变频率高，进化速度快。 ➢段，经过不加引物的多次PCR循环，使DNA的碱基序列重新排布而引起 突变，构建突变库，凭借定向的选择方法，选出所需性质的优化酶(或蛋白质)，从而排除其他突变 体。
定向进化的基本规则是“获取你所筛选的突变体”。
改变四种底物浓度比等。
2、DNA重排技术为代表的有性进化 定义：将各种不同突变基因与载体重组，再转入适宜的细胞或包装成重组λ噬菌体的技术过程。 1、突变基因的构建 适用：较小基因的定向进化。
属于蛋白质的非合理设计，它不需事先了解酶的空间结构和催化机制。
酶分子的定向进化（directed evolution）：模拟自然进化过程（随机突变和自然选择），在体外进行酶基因的人段，经过不加引物的多次PCR循环，使DNA的碱基序列重新排布而引起
结果对单基因进化得到的突变酶中，对头孢羟羧氧胺的抗性最高的增加了8倍，而用家族同源重组进化的方法使抗性比其中两种微生物 来源的天然酶提高270倍，比段，经过不加引物的多次PCR循环，使DNA的碱因与载体重组，再转入 适宜的细胞或包装成重组λ黏粒载体
➢ 转化 ➢ 噬菌粒载体
➢ 转导
2、突变基因的筛选 （1）定向选择环境条件的设定 （2）高通量筛选技术
定向进化的特点 ➢ 适应面广； ➢ 目的性强； ➢ 效果显著。
定向进化的原理 ➢ 以很低的比率向目的基因中随机引入突变，构建突
变库，凭借定向的选择方法，选出所需性质的优化 酶(或蛋白质)，从而排除其他突变体。 ➢ 定向进化的基本规则是“获取你所筛选的突变体”。 ➢ 定向进化=随机突变+定向选择。
2、DNA重排技术为代表的有性进化 DNA重排技术：又称DNA改组技术，有性PCR片段，经过不加引物的 多次PCR循环，使DNA的碱基序列重新排布而引 起基因突变的技术突变频率高，进化速度快。 ➢段，经过不加引物的多次PCR循环，使DNA的碱基序列重新排布而引起 突变，构建突变库，凭借定向的选择方法，选出所需性质的优化酶(或蛋白质)，从而排除其他突变 体。
定向进化的基本规则是“获取你所筛选的突变体”。
改变四种底物浓度比等。
2、DNA重排技术为代表的有性进化 定义：将各种不同突变基因与载体重组，再转入适宜的细胞或包装成重组λ噬菌体的技术过程。 1、突变基因的构建 适用：较小基因的定向进化。
属于蛋白质的非合理设计，它不需事先了解酶的空间结构和催化机制。
酶分子的定向进化（directed evolution）：模拟自然进化过程（随机突变和自然选择），在体外进行酶基因的人段，经过不加引物的多次PCR循环，使DNA的碱基序列重新排布而引起
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改进方法
其它改组方法
交错延伸重组( 交错延伸重组 StEP : Stagger extension process) 随机引物体外重组( 随机引物体外重组 RPR: Random2priming in vitro recombination) 临时模板随机嵌合生长( 临时模板随机嵌合生长 RACHITT : Random chimeragenesis on transient templates)
定向进化的历史
1 萌芽阶段 首先在分子水平上进行改造 单一分子的是 Sol Spiegelman在20世纪60年代,利用RNA噬 菌体Q进行的试验,目的是证明达尔文的自然 选择也可在非细胞体进行. 病毒基因组 Q复制酶扩增 DNA突变库 复制快的保留(能被Q酶选择识别的)
2奠基阶段
1981年,Hall B G等报道了他们定向改变了 大肠杆菌K12中的第二半乳糖苷酶的底物专 一性,开发出对几种糖苷键有水解能力的酶. HallB G等利用lacz缺陷型的菌株为宿主菌, 分别在含有某种碳源的培养基上培养.从酶 的自发突变库中筛选出分别可以水解半乳糖, 乳果糖,乳糖酸的突变酶,而野生型的酶不 能水解这些底物.
第八章 酶的定向进化
8.1 简介
通常可通过两条途径获得具有新功能和特性 的酶 一是从大量未知的生物种系中寻找; 二是改造现有已知的酶.
人工改造之定点突变
首先分析蛋白质的三维空间结构,搞清结构 与功能的关系,然后采用定点突变技术改变 蛋白质中的个别氨基酸残基,从而得到新的 蛋白质,理性化设计. 定点突变技术对天然酶蛋白的催化活性,抗 氧化性,底物特异性,热稳定性及拓宽酶反 应的底物范围,改进酶的别构效应等进行了 成功的改造.
实例
Stemmer 等从不同种微生物中选择编码头孢 菌素酶的4 个同源基因, 对它们进行单独进化 和同源重组进化, 来对这两种进化模式进行比 较.在对单基因进化得到的突变酶中, 对头孢 羟羧氧胺的抗性最高的增加了8 倍, 而采用 Family shuffling 的方法使抗性比其中两种微 生物来源的天然酶提高270 倍, 比另两种酶提 高了540 倍.
又称为有性PCR (Sexual PCR) , 其目的是创造将亲 本基因群中的突变尽可能组合的机会, 以致更大的 变异, 获得具有最佳突变组合的酶.基本操作过程 如下: 靶基因经随机突变产生含不同突变类型的亲 本基因群, 用DNase I 随机切割; 得到的片段经过不 加引物的多次PCR 循环, 在该过程中, 这些片段之间 互为引物和模板进行扩增, 直至获得全长基因; 再加 入基因的两端引物进行常规PCR , 最终获得发生改 组的基因库(图1) .该技术不仅可加速积累有益突变, 而且可实现目的蛋白多种特性的共进化, 所以无论 在理论上, 还是在实际应用中, 均优于连续易错PCR.
8.2 酶的定向进化常用方法
一,易错PCR技术为代表的无性进化 二,DNA改组技术为代表的有性进化
一,易错PCR技术为代表的无性进化
无性突变是向单一酶分子基因内随机引入突 变,制造突变酶库以便筛选.主要的手段包 括易错PCR,盒式诱变,随机定位诱变等 易错PCR是在采用Taq酶进行PCR 扩增目的 基因时,通过调整反应条件,例如提高镁离 子浓度,加入锰离子.改变体系中四种dNTP 的浓度等,使用低保真度的Taq酶,从而向目 的基因中.以一定的频率随机引入突变构建 突变库,然后选择或筛选需要的突变体.
定点突变的缺点
只能对天然酶蛋白中少数的氨基酸残基进行 替换,删除或插入,不改变酶蛋白的高级结 构,因而对酶功能的改造较有限. 本法仅适用于三维结构清楚,结构和功能的 相互关系也较清楚的酶.当对酶结构不甚了 解时,定点突变就无能为力了.
定向进化
利用基因的可操作性,模拟自然界的演化进程的非合理设计 方案, 定向进化(directed evolution),杂合进化(hybrid evolution)等. 定义: 酶的体外定向进化 vitro directed evolution)是在人 酶的体外定向进化(in 工模拟自然进化过程的条件下,通过容错PCR,DNA 改组, 交错延伸技术,随机引物引导重组和递增截短技术等方法对 经高通量筛选获得性能 编码酶的基因进行突变和体外重组,经高通量筛选 经高通量筛选 更优良或全新的酶.本法不需了解酶的结构信息,因此称为 非理性化设计.
由致突变株产生
Greener等构建了一株DNA修复途径缺陷的大肠杆 菌突变株 XL1-Red,其体内的 DNA 突变率比野生 型高出 5000 倍.将带有拟突变基因的质粒转化到 XL1-Red菌株内培养过夜,可产生随机突变,频率 一般为 1/2000. 本法产生的随机突变的特点为:(1)每代筛选出1 个最佳的突变体作为下一代的亲本,通过累积正突 变加快进化进程,但要将有益的突变组合到一起较 困难 ;(2)常会发生突变的复原;(3)无法删除 有害突变,连续突变也会累积有害突变,往往导致 进化提前终止.
实例
枯草杆菌蛋白酶:洗涤剂合成,鞣革和医药领域的重 要工业酶制剂. Chen 和Arnold] 采用易错PCR 对该酶进行了体外进 化研究.他们通过降低反应体系中dATP 的浓度, 对 编码该酶从第49 位氨基酸到C 端的DNA 片段进行 易错PCR , 经筛选得到的几个突变株在高浓度的二 甲基甲酰胺(DMF) 中酶活性明显提高 突变体PC3 在60 %的DMF 中, 酶活力是野生型的 256 倍.将PC3 再进行两个循环的定向进化, 得到 的突变体13M酶活力比PC3 还要高3 倍.
常用方法
利用底物显色反应 改变培养条件(如逐步提高培养温度, 或改变培养基 的pH 等) 利用某些蛋白的固有性质,如产生绿色荧光 高通量筛选(HTS: High Throughout Screening) , 该 技术可以根据待测样品的合成路线分为液相和固相 筛选, 也可以根据筛选目标物分为纯蛋白受体亲合 性筛选, 酶活性筛选, 细胞活性筛选等.
8.3
酶分子定向进化的筛选策略
与基因的定点突变不同, 在酶分子的定向进化 中,突变是随机发生的, 但通过筛选特定方向 的突变, 便可限定进化的趋势, 再加上适当的 控制实验条件, 不仅可大大的减少工作量, 还 加快了酶某种特征的进化速度. 通常, 采用的定向筛选方法必须灵敏, 且应与 目的性质相关
易错PCR
遗传变化只发生在单一分子内部, 属于无性进化.较为费力, 耗时, 一般多用于较小基因片段( < 800bp) 的改造.通常, 经 一轮的易错PCR,定向筛选, 很难获得令人满意的结果.由 此发展出了连续易错PCR(Sequential error-prone PCR) , 将 一次PCR 扩增得到的有益突变基因作为下一次PCR 扩增的 模板, 连续反复进行随机诱变, 使得每一次获得的少量突变累 积而产生重要的有益突变.
HTS
HTS 现有的方法有: 固相筛选,使用放射性 染料筛选,荧光筛选,闪烁接近化验,LISA, 利用细胞的功能筛选和利用小鼠显型的表型 遗传学筛选等等. 高通量筛选( HTS) 体系将组合化学,基因组 研究,生物信息和自动化仪器,机器人等先 进技术进行了有机组合,快速 筛选得到目的物.
90 年代初期, 一个实验室采用传统的方法, 借助20 余种药物作用靶位, 一年内仅能筛选 75 000个样品; 到了1997 年HTS 发展的初期, 采用100 余种靶位, 每年可筛选1 000 000个 样品; 而到1999 年, 由于HTS 的进一步完善, 每天的筛选量就高达100 000种化合物, 因而, 称之为超高通量筛选.
特点
(1)DNase I酶切获得片段大小一般应控制 在20～50bp; (2)伴随重组程的不断重复,可有少数点突 变同时发生; (3)可体外实现同源序列间的改组,创造亲 本基因群中突变尽可能组合在一起的机会, 加速累积有益突变最终获家族之间的同源重组 Family shuffling
根据定向进化的基本思想,作者确定了易错 PCR一筛选一(优势突变重组一筛选)n的实验 路线.共进行了4轮易错PCR,每一轮易错 PCR约筛选了3000个菌落.最终得到了一株 酶活力提高28倍的突变体.对天然酶和进化 酶的酶学性质进行了分析,结果表明进化酶 的pH稳定性和热稳定性均优于天然酶,因此 更适合于工业化生产L—天冬氨酸.
3 发展阶段
易错PCR (error-prone PCR)和DNA改组方法被成 功开发,标志着酶分子定向进化技术的成熟. 1992年Gram H.等用噬菌体呈现技术体外筛选抗 体时,用易错PCR向抗体的重链可变区和轻链可变 区引入突变. Stemmer将DNA改组方法引用到酶分子定向进化中, 他用β内酰胺酶作为模型分子,对其正向突变库进 行DNA改组,以逐渐增加头孢氨噻的浓度为筛选压 力,经过三轮DNA改组获得酶活力增加32000倍的 突变体.
Family shuffling 指用DNA shuffling 技术, 改 组进化上相关的一系列基因. 当从自然界中存在的基因家族出发, 利用它们 之间的同源序列进行DNA 改组.由于每一个 天然酶的基因都经过千百万年的进化, 并且基 因之间存在比较显著的差异, 所以获得的重组 基因库充分体现了基因的多样化,又最大限 度的排除了那些不需要的突变.
荧光HTS
8.4 实际应用
一,提高酶分子的催化活力
这是对酶分子进行改造的最基本的愿望之一, 大多实验都涉及对目的酶催化活力的提高, 例如,吉林大学分于酶学工程教育部重点实 验室张今教授课题组对L—天冬氨酸酶,等进 行定向进化研究,以提高催化活力.
实例1;L—天冬氨酸酶定向进化研究
L天冬氨酸酶是一种重要的工业用酶,可催化富 马酸和氨生成L-天冬氨酸.L-天冬氨酸在医药,食 品,化工等领域具有非常广泛的用途.由于天冬氨 酸酶的活性部位尚未完全确定,催化机理也需进一 步证实,在这种条件下通过酶的合理化设计来进一 步提高酶活力具有一定困难.为此,采用定向进化 的方法对酶基因进行改造,以期获得较高活力的酶.