高中生物动物细胞培养学案(公开课)

动物细胞培养

【教学目标】1.简述动物细胞培养的过程

2.了解动物细胞培养的条件

3.知道动物细胞培养的的应用

【重点、难点】动物细胞培养的过程

【自主学习】阅读教材P44-46内容----动物细胞的培养

1.动物细胞培养的概念：从动物机体中取出相关的组织，将它分散成______________，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞______ __和_____ ______。

2.动物细胞培养的过程：P45图2—16

3.动物细胞培养的条件：

（1）无菌无毒的环境：对和进行无菌处理，还可以在培养液中添加一定量的。此外，应定期。

（2）营养：合成培养基中有、、、

、等，通常需加入等天然成分。

（3）温度和PH ：哺乳动物适宜温度为，多数细胞生存的适宜PH为。

（4）气体环境：主要是和。_________________是细胞代谢所必需的，CO2的主要作用是。

4.举例说出动物细胞培养技术的应用：

①大规模生产有重要价值的生物制品。如：、、等。

②动物细胞是基因工程技术中常用的细胞，因此，也离不开动物细胞的培养。

③培养的动物细胞还可以用于，判断某种物质的毒性。

④科学家培养正常或各种病变的细胞，用于、、等方面的研究。如：。

【合作探究】

【探究一】动物细胞培养的过程

1.动物细胞培养的选材有什么要求？取出动物组织后，怎样制备细胞悬液？

2.动物细胞培养用到什么酶？它的作用什么？

3.什么是“原代培养”和“传代培养”？为什么要进行“传代培养”

4.什么是“细胞贴壁”和“接触抑制”

5.动物细胞能无限制的传代下去吗？

6.目前使用的或冷冻保存的正常细胞通常为几代以内的细胞？为什么？

7.通过动物细胞培养能获得动物个体吗？为什么？

归纳总结：根据以上的探究并结合教材44-45页动物细胞培养过程，构建动物细胞培养流程图。

【探究二】动物细胞培养的条件

1.怎样保证被培养的细胞处于无菌无毒的环境中？

2.为什么培养动物细胞时通常要加入动物血清？

3.动物细胞培养所需的气体主要有哪些？主要作用分别是什么？

【探究三】动物细胞培养技术的应用

如何用动物细胞培养技术来检测有毒物质的毒性？

【小结】:植物组织培养和动物细胞培养的比较

培养基性质

培养基特有成分

培养结果

培养目的

【当堂检测】

1、实验小鼠皮肤细胞培养（非克隆培养）的基本过程

如图所示。下列叙述错误的是( )

A．甲过程需要对实验小鼠进行消毒

B．乙过程对皮肤组织可用胰蛋白酶消化

C．丙过程得到的细胞大多具有异倍体核型

D．丁过程得到的细胞具有异质性

2、下列关于动物细胞培养的叙述,正确的是( )

A.培养保留接触抑制的细胞在培养瓶壁上可形成多层细胞

B.克隆培养法培养过程中多数细胞的基因型会发生改变

C.二倍体细胞的传代培养次数通常是无限的

D.恶性细胞系的细胞可进行传代培养

3、（2013大纲卷）关于动物细胞培养和植物组织培养的叙述，错误的是（）

A.动物细胞培养和植物组织培养所用培养基不同

B.动物细胞培养和植物组织培养过程中都要用到胰蛋白酶

C.烟草叶片离体培养能产生新个体，小鼠杂交瘤细胞可离体培养增殖

D.动物细胞培养可用于检测有毒物质，茎尖培养可用于植物脱除病毒

4、用动、植物成体的体细胞进行离体培养,下列叙述正确的是( )

A.都需要用CO2培养箱

B.都需要用液体培养基

C.都要在无菌条件下进行

D.都可体现细胞的全能性

5.右图是动物细胞培养的基本过程示意图。请据此回答：

（1）容器A中放置的是动物器官或组织。它一般取自。原因是___ ___。

（2）容器A的动物器官或组织首先要进行的处理是，然后用酶处理，这是为了使细胞分散开。这样做的目的是。

（3）培养首先在B瓶中进行。瓶中的培养基成分有

等。在此瓶中培养一段时间，

这时的培养称为。

（4）为了把B瓶中的细胞分装到C瓶中，用

处理，然后配置成，

再分装，继续培养，称为。

【课后巩固】

1.下列关于动物细胞培养的叙述中，正确的是（）

A.动物细胞培养的目的就是为获得细胞分泌蛋白

B.动物细胞培养前要用胰蛋白酶处理使细胞分散开

C.动物细胞培养通常不会出现接触抑制现象

D.可以通过细胞培养技术获得完整的动物个体

2.一般来说，动物细胞体外培养需要满足以下条件（）

①无毒的环境②无菌的环境③合成培养基需加血浆④温度与动物体温相近⑤需要O2，不需要CO2⑥CO2能调培养液pH

A.①②③④⑤⑥

B.①②③④

C.①③④⑤⑥

D.①②③④⑥

3.下列关于动物细胞培养的说法错误的是（）

A.正常细胞体外条件下不能无限传代

B.细胞在培养瓶中进行有丝分裂，一般不分化

C.细胞遗传物质稳定，不会发生变异现象

D.细胞培养常用于分泌性蛋白的生产

4.（2008年宁夏理综）回答下列有关动物细胞培养的问题：

（1）在动物细胞培养过程中，当贴壁细胞分裂生长到细胞表面时，细胞会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的。此时，瓶壁上形成细胞层数是。要使贴壁的细胞从瓶壁上分离下来，需要用酶处理，可用的酶是。

（2）随着细胞传代次数的增多，绝大部分细胞分裂停止，进而出现现象，但极少数细胞可以连续增殖，其中有些细胞会因遗传物质发生改变而变成

细胞，该细胞黏着性，细胞膜表面蛋白质（糖蛋白）的量。

（3）检查某种毒物是否能改变细胞染色体的数目，最好选用细胞分裂到期的细胞用显微镜进行观察。

（5）在细胞培养过程中，通常在冷冻（如液氮）条件下保存细胞，因为在这种条件下，细胞中

的活性降低，细胞的速率降低。

（6）给患者移植经细胞培养形成的皮肤组织后，发生了排斥现象，这是因为机体把移植的皮肤组织当作进行攻击。

5.某研究小组进行药物试验时，以动物肝细胞为材料，测定药物对体外培养细胞的毒性。供培养的细胞有甲、乙两种，甲细胞为肝肿瘤细胞，乙细胞为正常肝细胞。请回答下列有关动物细胞培养的问题：

（1）将数量相等的甲细胞和乙细胞分别置于培养瓶中培养，培养液及其它培养条件均相同。一段时间后，观察到甲细胞数量比乙细胞数量。

（2）在动物细胞培养时，通常在合成培养基中加入适量血清，其原因是。细胞培养应在含5% CO2的恒温培养箱中进行，CO2的作用是。

（3）在两种细胞生长过程中，当乙细胞铺满瓶壁时，其生长。药物试验需要大量细胞，两种细胞频繁传代，甲细胞比乙细胞可以传代的次数更。若用动物的肝脏组织块制备肝细胞悬液，需用消化处理。

（4）为了防止细胞培养过程中细菌的污染，可向培养液中加入适量的。

（5）已知癌基因X过量表达与肝肿瘤的发生密切相关，要试验一种抗肿瘤药物Y对甲细胞生长的影响，可将甲细胞分为A、B两组，A组细胞培养液中加入，B组细胞培养液中加入无菌生理盐水，经培养后，从A、B两组收集等量细胞，通过分别检测X基因在A、B两组细胞中的

或合成水平的差异，确定Y的药效。

答案：(1)动物胚胎或幼年动物的器官组织因为这些组织或器官上的细胞增殖能力强，有丝分裂旺盛(2)剪碎胰蛋白使每个细胞能与培养液接触

(3)葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清原代培养

(4)胰蛋白酶细胞悬浮液传代培养

答案：（1）相互接触接触抑制单层（或一层）胰蛋白酶

（2）衰老甚至死亡不死性降低减少

（3）由于活细胞的膜具有选择透过性，大分子染料不能进入活细胞内，故活细胞不能着色（或由于死细胞的膜丧失了选择透过性，大分子染料能够进入死细胞内而着色）

（4）中（5）冷冻（或超低温、液氮）酶新陈代谢

（6）抗原

答案：(1)多

(2)血清可以补充合成培养基中缺乏的物质维持培养液的pH

(3)停止多胰蛋白酶(4)抗生素

（5）Y mRNA 蛋白质

(完整word版)2015 动物细胞培养技术实验报告

一、实验目的 1、学习并掌握动物细胞培养的无菌操作技术。 2、学习并掌握细胞传代培养的方法。 3、学习并掌握用倒置荧光显微镜观察细胞细胞形态。二、实验原理细胞培养（cell culture）：细胞在体外条件下生长，细胞不再形成组织。动物细胞培养（animal cell culture）就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞（使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶）然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。由于细胞具有生长和自我复制的能力，为细胞体外培养和研究提供可能。动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。原代培养（primary culture）即直接从动物机体分离、获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法。传代培养（subculture）当细胞生长增值达到一定密度，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，将细胞转移到新的培养皿中扩大培养的方法。高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的，但如果把或细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则方便简单的多。被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类探索防治各种疾病途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，因此，动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。三、细胞培养相关设施及材料 1、细胞培养室无菌操作区：只限于细胞培养及其它无菌操作，与外界隔离。孵育区：培养箱设定的条件为37℃，5%CO2。制备区：培养液及有关培养用液体的制备，液体制备后应该在净化工作台进行过滤除菌。储藏区：包括冰箱、干燥箱、液氮罐等。清洗区和消毒灭菌区：清洗区为相对污染区，消毒灭菌区与清洗区分开。 2、细胞培养常用基本设施：荧光显微镜、超净工作台、孵箱、电热鼓风干燥箱、冰箱、液氮罐、消毒器、恒温水浴槽、滤器等。细胞培养常用器皿：培养瓶、培养板、培养皿，玻璃瓶、吸管，离心管、冻存管，注射器，烧杯、量筒等。 3、细胞培养用品的清洗、消毒新玻璃器皿要用5%稀盐酸浸泡，以中和其表面碱性物质：刷洗：硫酸清洁液浸泡：浓硫酸+重铬酸钾+蒸馏水；冲洗：流水冲洗15-20次，蒸馏水冲洗3次，三蒸水漂洗1-3次。所有需灭菌的器械、物品灭菌前均需包装，防止灭菌后污染。使用时放入超净工

《动物细胞工程学案》

《动物细胞工程学案》张建尚/江苏【学习目标】站得高——明确学习目标。 1.简述动物细胞培养的过程、条件及应用。 2.简述通过动物体细胞核移植技术克隆动物的过程和应用前景。 3.举例说出动物细胞融合的与单克隆抗体的原理和应用。【重点和难点】重点：1.动物细胞培养的过程及条件。 2.用动物体细胞核移植技术克隆动物的过程。 3.单克隆抗体的制备和应用。难点：1.用动物体细胞核移植技术克隆动物的过程。 2.单克隆抗体的制备和应用。【学法提示】 1.利用动物细胞培养过程示意图学习动物细胞培养过程，对每一步采取的措施要掌握其目的、原因，区分原代培养和传代培养，并与植物组织培养进行比较。 2.从植物原生质体融合入手，理解动物细胞融合的方法、过程；根据B淋巴细胞和骨髓瘤细胞的特点，理解单克隆抗体制备的方法、意义和利用。【课前预习】起步稳——知识源于生活。 1.动物细胞工程常用的技术手段有①、②、③、 ④等，其中⑤技术是其他动物工程的基础。 2.动物细胞培养的流程：取动物组织块→剪碎→用①处理分散成②→制成③→放入培养瓶中进行④培养。对动物细胞进行培养时，要求培养瓶或培养皿内表面⑤。当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的⑥。贴满瓶壁的细胞需要重新用 ⑦处理，然后分瓶继续培养，让细胞继续增殖，这样的培养称为⑧。 3.动物细胞培养的培养液应进行①处理，通常还要在培养液中添加一定量的②，以防培养过程中的污染。此外，应定期更换培养液，防止③对细胞自身造成危害。合成培养基的成分主要有④等，通常还需加入⑤等天然成分。细胞培养中的O2是⑥所必需，CO2的主要作用是⑦。 4.动物细胞核移植是将动物的一个细胞的①，移入一个已经去掉细胞核的②中，使其重组并发育成一个新的③，并最终发育为动物个体。哺乳动物核移植可以分为④核移植（比较容易）和⑤核移植。 5.动物细胞融合也称①，融合后形成的具有原来②细胞遗传信息的单核细胞，称为③。动物细胞融合不同于植物原生质体融合的诱导方法是④。 6.将效应B细胞与骨髓瘤细胞进行融合，经过筛选后得到①细胞，这种细胞既能大量②，又能产生③。将这样的细胞群在④条件下或注射到⑤内增殖，就可以获得大量的单克隆抗体。单克隆抗体最主要的优点是⑥，并可能大量制备。答案1.①动物细胞培养②动物细胞核移植③动物细胞融合④生产单克隆抗体⑤动物细胞培养2.①胰蛋白酶或胶原蛋白酶②单个细胞③细胞悬液④原代培养⑤光滑、无毒、易于贴附

原代细胞培养与分离

原代细胞的培养与建系凡是来源于胚胎、组织器官及外周血，经特殊分离方法制备而来的原初培养的细胞称之为原代细胞。细胞的纯化或细胞克隆技术是细胞培养工作的基础。原代细胞的取材人和动物细胞的取材是原代细胞培养成功的首要条件，直接影响细胞的体外培养。一、取材的基本要求 .1．取材要注意新鲜和保鲜 .2．应严格无菌 .3．防止机械损伤 .4．去除无用组织和避免干燥 .5．应注意组织类型、分化程度、年龄等 .6．作好记录二、各类组织的取材技术皮肤和粘膜的取材内脏和实体瘤的取材血液细胞的取材骨髓、羊水、胸/腹水细胞取材动物组织取材人胚体组织取材鸡（鸭）鸟类胚胎组织取材鸡（鸭）鸟类胚胎组织取材皮肤和粘膜的取材主要取自于手术过程中的皮片，方法似外科取断层皮片手术操作，但面积一般2~4平方厘

米。内脏和实体瘤的取材内脏除消化道外基本是无菌的，但取材时要明确和熟悉所需组织的类型和部位，实体瘤取材时要取肿瘤细胞丰富的区域，要避开破溃、坏死液化部分，以防污染，尽量去除混杂的结缔组织。血液细胞的取材血细胞、淋巴细胞的取材，一般多抽取静脉外周血，或从淋巴组织中（如脾、扁桃体、胸腺、淋巴结等）分离细胞，取材时应注意抗凝。骨髓、羊水、胸/腹水细胞取材严格无菌，注意抗凝，还要尽快分离培养，离心后，用无钙、镁PBS洗两次，再用培养液洗一次后即可培养，不宜低温存放。动物组织取材 1、鼠胚组织取材首先用引颈或气管窒息致死法处死孕期合适的动物，然后将其整个浸泡在含有75%酒精的烧杯中，5分钟后（注意时间不能太长，以避免酒精从口或其他通道进入体内，影响组织活力），取出动物，在消毒过的木板上可用无菌的图钉或大头针固定四肢，切开皮肤，用无菌操作法解剖取胚或用无菌止血钳挟起皮肤、用无菌眼科剪沿躯干中部环形剪开皮肤，用止血钳分别挟住两侧皮肤拉向头尾，把动物反包，暴露躯干，然后再固定，更换无菌解剖器材，采用无菌操作法解剖取出胚胎。 2、幼鼠胚肾（或肺）取材幼鼠采用上述方法处死消毒后，腹部朝上固定在木板上，先切开游离毛皮并拉开至两侧：然后采用无菌法打开胸腔取肺，或背部朝上固定在木板上，先将背部毛皮切开游离并拉向两侧，

动物细胞培养基本操作

实验一动物细胞培养细胞培养是用无菌操作的方法将动物体内的组织(或器官)取出，模拟动物体内的生理条件，在体外进行培养．使其不断地生长、繁殖，人们借以观察细胞的生长、繁殖、细胞分化以及细胞衰老等过程的生命现象。细胞培养的突出优点，一是便于研究各种物理、化学等外界因素对细胞生长发育和分化等的影响；二是细胞培养便于人们对细胞内结构(如细胞骨架等)、细胞生长及发育等过程的观察。因而细胞培养是探索和指示细胞生命活动规律的—种简便易行的实验技术，同时我们也不可忽略的另一个因素，那就是它脱离乐生物机体后的—些变化。细胞培养技术目前已广泛地被应用于生物学的各个领域。如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿痛学及病毒学等为此有必要使学生在细胞培养方面得到一些初步的感性知识，了解动物细胞培养的基本操作过程，观察体外培养细胞的生长特征，对原代细胞与传代细胞有一个基本概念。本实验分两次进行．即清洗与消毒和传代细胞的培养与观察。 Ⅰ清洗与灭菌一、实验目的能独立地进行用于细胞培养的各种器皿的清洗与消毒，掌握干热灭菌法、湿热灭菌法和滤过除菌法的操作，了解化学消毒法的使用方法。二、实验原理清洗与消毒是组织培养实验的第一步，是组织培养中工作量最大，也是最基本的步骤。体外培养细胞所使用的各种玻璃或塑料器皿对清洁和无菌的要求程度很高。细胞养不好与清洗不彻底有很大关系。清洗后的玻璃器皿，不仅要求干净透明，无油迹，而且不能残留任何物质。如有毒的化学物质，哪怕残留0．1个，也可能影响细胞生长。灭菌手段的选择十分重要，对不同的物品需采用不同的灭菌方法。假如选用的方法不对，即使达到了无菌却使被灭菌药品丧失了营养价值、生物学特性或其他使用价值也不行。以下在每种灭菌步骤中都介绍其使用范围。三、实验材料、用品

原代细胞的培养与建系

原代细胞的培养与建系(一) 细胞的来源多样，培养方法也各不相同，凡是来源于胚胎、组织器官及外周血，经特殊分离方法制备而来的原初培养的细胞称之为原代细胞。原代细胞经分散接种之手段称为传代。凡能经传代方式进行再次培养的细胞称为传代细胞。若能稳定生长传至10~20代以上的细胞可确立为细胞系。若有条件能开展单细胞克隆、纯化，经大量扩增后所形成的生物学特性稳定的克隆化细胞群，称之为细胞株或克隆细胞。此过程称为细胞的纯化或细胞克隆。这些基本技术是从事细胞培养工作的基础，只有熟悉和掌握了基本技术，才可能更快捷地学习和掌握其他方法，本章重点叙述常用的基本技术。第一节原代细胞的取材人和动物细胞的取材是原代细胞培养成功的首要条件，是进行细胞培养的第一步，若取材不当，将会直接影响细胞的体外培养，现将取材的基本要求和注意事项叙述如下：一、取材的基本要求（1）取材要注意新鲜和保鲜新鲜组织易于培养成功，取材时应尽量在4~6h内能制作成细胞，尽快入箱培养，若不能即时培养，应将组织浸泡于培养液内，于4℃存放。若组织块较大，应在清除表面血块、坏死组织、脂肪和结缔组织后，切碎于培养液内4℃存放，但时间不能超过24h.对于已切碎的组织或血液、淋巴组织应加入含10%二甲基亚砜的培养基，按细胞冻存方式于液氮中冷冻保存。（2）取材应严格无菌所取标本材料应在无菌条件下进行，为了确保无菌，对所取材料若疑有污染的可能，应将所取组织在含高浓度抗菌素（400单位/mL）甚至加入适量的两性霉素B或10%达克宁液的培养液内于4℃下存放2小时以上，再用PBS洗2~3次，以确保所取材料无菌。要用无菌包装的器皿或事先消毒好的带少许培养液（内含400单位/mL抗菌素）的小瓶等便于携带的物品来取材，所取材料应避免接触有毒有害的化学物质，如碘、汞等。（3）取材和原代细胞制作时，要用锋利的器械，如手术刀或剃须刀片切碎组织，尽可能减少对细胞的机械损伤。（4）要仔细去除所取材料上的血液（血块）、脂肪、坏死组织及结缔组织，切碎组织时应避免组织干燥，可在含少量培养液的器皿中进行。（5）取材应注意组织类型、分化程度、年龄等，一般来讲，胚胎组织较成熟个体组织容易培养，分化低的较分化高的组织容易生长，肿瘤组织较正常组织容易培养。取材时应尽量选用易培养的组织进行培养。（6）原代细胞取材时要同时留好组织学标本和电镜标本。对组织的来源、部位、包括供体的一般情况要做详细的记录，以备以后查询。二、各类组织的取材技术

教师版221《动物细胞培养和核移植》导学案

学校：临清市第二中学学科：生物编写人：黄丽平审稿人：于振玲专题二细胞工程——.动物细胞工程 2.2.1动物细胞培养和核移植技术课前预习学案一、预习目标预习动物细胞培养的过程、条件及应用和核移植的过程及应用前景。二、预习内容（一）、动物细胞培养 1、动物细胞培养的概念：从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后，放在适宜的培养基中；让这些细胞生长和增殖。 2、动物细胞培养的过程：取动物组织块-----------剪碎组织；--------------胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理-------------分散成单个细胞；------------制成细胞悬液-------原代培养（贴壁生长）-----------------------分瓶----------传代培养10代以内，遗传物质未改变。------细胞株---------10~50代，遗传物质改变----------细胞系。 3、条件：（1）（2）（3） (4) 4、应用：（1）生产生物制品。（2）———————————————— （3）检测有毒物质。（二）：动物体细胞核移植技术 1、概念：将动物一个细胞的_________________,移入一个______________________________中，使其重组并发育成一个新的________________这个新的胚胎最终发育为新的个体。 2、过程： (1)取供体_________________ →供体细胞培养。 (2)从卵巢中采集_________________ →在体外培养到_______________________ →去核。 (3)将供体细胞注入_____________________ →使两细胞____________→供体核进人受体卵母细胞→构建_________________。 (4)将胚胎______________到代孕母体内→生出与供体遗传物质基本相同的个体。 3、应用：(1)加速家畜_________________进程，促进优良畜群繁育。 (2)保护_________________物种。 (3)生产_________________。 (4)作为异种移植的_____________。 (5)用于_________________的移植。

原代细胞培养和传代培养的方法及其注意事项

初代培养原理将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。仪器、材料及试剂仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃）材料：动物组织块试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s液，碘酒初代消化培养法 1. 准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。 2. 布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。 3. 处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。 4. 剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。 5. 消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。 6. 分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。 7. 计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。 8. 培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。初代组织块培养法 1. 剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm3块为止。 2. 摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一25ml培养瓶底可摆布20~30块。 3. 轻轻翻转培养瓶，另瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，塞好瓶塞，置36.5℃温箱培养2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。 4. 培养：从微箱中取出培养瓶，开塞，46度斜持培养瓶，箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液慢慢覆盖附于瓶地上的组织小块。置温箱中静止培养。待细胞从组织块游出数量增多后。再补加培养液。

动物细胞培养及无血清培养研究进展

动物细胞培养及无血清培养研究进展摘要：细胞培养是生物学中一项重要技术，应用较为广泛，目前已渗透到细胞生物学、生物化学、临床检验学等多个领域。其中动物细胞培养是动物细胞工程中最常用的技术手段，而且动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。本文主要介绍了动物细胞培养和其中发展较快的无血清培养技术的研究应用进展。为未来实际的研究和生产作一些总结和展望。关键词：动物细胞；细胞培养；无血清培养基 1 引言组织培养技术创建于18世纪末，之后于1907 年美国生物学家Harrison在无菌条件下，以淋巴液为培养基在试管中培养蛙胚神经组织宣告成功后，才逐渐发展成为一种从机体获取细胞，模拟体内生存环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使其生长繁殖并维持结构和功能的实验技术。这种技术为细胞学、遗传学、病毒学、免疫学的研究和应用做出了重要贡献。近年来生命科学迅速发展，各种在分子水平的实验如核移植、细胞杂交、DNA 介导的基因转移等，都是借助细胞培养技术而得以实现的。然而各领域的动物细胞培养技术发展并不平衡，存在许多的局限性，使用范围有限，还未出现适合整个生命科学研究领域的培养体系。因此本文对细胞培养及大规模培养、无血清培养做一些总结。 2动物细胞培养动物细胞培养方式包括原代和传代培养。培养方式有贴壁、悬浮以及固定化培养等方式。 2.1动物细胞培养的基本概念细胞培养指的是从体内组织取出细胞，并为其提供一个无菌、具有适当温度及酸碱度的环境，给予充分营养，使其生长繁殖并维持其结构和功能的一种培养技术。从体内取出的细胞进行的首次培养式细胞培养最初的阶段，也称为原代培养。原代培养式细胞培养当中重要的必经环节。原代培养细胞生长到一定时候后，由于受群体环境影响，需要转移到另一个容器，这种培养称为传代培养。传代后的动物细胞与原代培物形状一致的话，则表示传代成功，这些细胞称为细胞系或细胞株。 2.2动物细胞培养技术的内容

动物细胞培养技术实验

实验十五动物细胞培养技术及其应用一．实验目的通过本实验使学生掌握细胞培养、细胞检测和细胞表达等成套技术的原理和方法。二. 实验内容 1.培养基配制、细胞培养、细胞冻存与复苏等基本技术； 2.细胞生长曲线测定、细胞活性检测等常用技术； 3.细胞污染检测方法与技术； 4.病毒在细胞中的感染与增殖、重组病毒异源蛋白的细胞表达等实用技术。三．实验用品 1. 材料：Sf 细胞、Hi5 细胞等 2. 器材：CO2培养箱、超净工作台、倒置显微镜、培养基抽滤装置、电泳仪、离心机、pH 计、液氮罐（含液氮）、水浴锅、温度计、培养瓶、血清瓶、5 ml和10 ml 移液管、不锈钢移液管筒、大小不锈钢饭盒、酒精灯、吸耳球、血球计数板、96孔板、 24孔板、无菌冻存管、离心管、记号笔、一次性过滤器、微量加样器、精密pH 试纸、酒精棉球等 3. 试剂与药品：Grace培养基、胎牛血清、甘油、DMSO、双抗（青霉素、链霉素）100 u/ml、 Hank’s液、胰蛋白酶、台盼蓝、液氮、分析纯无水酒精、95%医用酒精、Tris 碱、硼酸、EDTA、琼脂糖粉（电泳用）、dNTPs、Taq酶、支原体检测试剂盒、 DNA提取试剂盒DNeasy Blood & Tissue kit （Qiagen）等。四．实验方法与步骤（一）培养基配制、细胞培养、细胞冻存与复苏 1. 缓冲液及培养基配制 Hank’s液：KH2PO4 0.06g，NaCl 8.0g，NaHCO3 0.35g，KCl 0.4g，葡萄糖1.0g，Na2HPO4·H2O 0.06g，加H2O至 1000ml，高压灭菌。4℃下保存。胰蛋白酶液：称取0.25克胰酶蛋白酶（活力为1：250），加入100ml无Ca2+、Mg2+的Hank’s 液溶解，滤器过滤除菌，4℃保存，用前可在37℃下回温。 4%台盼蓝染液：称取台盼蓝4克，加双蒸水至100 ml。 MTT溶液：MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液或无酚红的Hank’s液中。4℃下保存。Grace培养基：取一份GIBCO公司的Grace培养基粉剂，按说明用量加入1000ml三蒸水100单位／毫升青、链霉素，充分混匀使溶解，调节pH值至6.8左右。 0.22 μm 滤膜抽滤除菌，4℃下保存。此为基础培养基。使用前加入10%胎牛血清。细胞冻存液：基础培养基加入10%DSMO，20%胎牛血清，用前配制。 PBS缓冲液：137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 8.1 mmol/L Na2HPO4, 1.5 mmol/L KH2PO4,

动物细胞培养导学案

学习指导案课题动物细胞培养授课时间课型新授主备人教材分析动物细胞培养是其他动物细胞工程的基础，打好基础很重要。通过设计六道讨论题，在预习的基础上解决讨论题后，大部分学生能够掌握动物细胞培养的过程。学情基础分析及预习导学在植物组织培养的基础上，学习动物细胞培养，要通过对比，理解过程，结果、应用和条件课程目标知识与技能：简述动物细胞培养的过程、条件及应用。情感态度和价值观了解生物技术，关注实际生活能力方面通过讨论，了解动物细胞培养的过程。学习重点动物细胞培养的过程及条件。

学习难点动物细胞培养的过程教具准备多媒体课件和学案学习过程学习内容学习形式教师指导时间（一）引入新课利用植物细胞可以培育成植物体，那么，你利用动物细胞能不能大量繁殖动物体，以提高繁殖率呢？这节课我们来学习动物细胞工程。（二）进行新课 [问题]动物细胞工程的常用技术手段有哪些？最基础的技术手段是什么？动物细胞培养、动物细胞核移植、动物细胞融合、生产单克隆抗体等。最基础的技术手段是动物细胞培养。 1．动物细胞培养 1.1概念：从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。[来源:学_科_网] [分析]（1）需分散成单个细胞；（2）需要在培养基上培养；（3）动物细胞培养的实质是细胞增殖——原理 1.2动物细胞培养的过程： [问题]什么是细胞贴壁？什么是接触抑制？悬液中分散的细胞很快就贴附在有丝分裂，称为细胞贴壁。当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。 [问题]如何打破接触抑制？需要重新用胰蛋白酶等处理，然后分别继续培养，让细胞继续增殖。 [问题]细胞传代培养代数有什么特点？传代培养的细胞一般传至10代后就不易传下去了，一般来说，细胞在传至10～50代左右时，增殖会逐渐缓慢，以至于完全停止，这时部分细胞的细胞核型可能发生变化，当继续传代培

常规细胞培养方法(原代培养和传代培养)

原代上皮细胞与原代成纤维细胞培养的分离纯化 2010-12-02 10:29 来源：PriCells 点击次数：335 关键词：上皮细胞成纤维细胞培养分离纯化分享到：收藏夹腾讯微博新浪微博开心网 PriCells- 原代上皮细胞与原代成纤维细胞培养的分离纯化原代细胞、传代细胞绝大多数都呈混合生长，既有上皮样细胞又有纤维样细胞，纤维样细胞又包括成纤维细胞、肌细胞、骨细胞、滑膜细胞等。混杂的细胞会直接影响实验结果。在体外培养原代细胞时，为了保证实验结果的可靠性、一致性、稳定性、和可重复性，要求采用单一种类细胞来进行实验，这样才能对某一细胞的功能、形态等变化进行一系列研究，因而培养细胞的纯化就成为实验研究的重要一步，甚至需要从混杂的细胞群中分离出单个细胞来进行培养和开展实验研究。一、原代细胞增殖优势纯化方法：

自然纯化是利用某一种类细胞的增殖优势，在长期传代过程中靠自然淘汰法，不断排挤其他生长慢的细胞，靠自然增殖的潜力，最后留下生长优势旺盛的细胞，达到细胞纯化的目的。但这种方法常无法按照需要和实验要求及研究目的来选择细胞。此法花费时间长，留下的往往是成纤维细胞。仅有那些恶变的肿瘤细胞或突变的细胞可以通过此方法而保留下来的，不断纯化而建立细胞系。二、原代细胞常用纯化方法：人工纯化是利用人为手段造成对某一细胞生长有利的环境条件，抑制其他细胞的生长从而达到纯化细胞的目的。 1 、细胞时间差酶消化法：酶消化法是比较常用的纯化方法，不仅对贴壁细胞可行，能利用上皮细胞和成纤维细胞对胰蛋白酶的耐受性不同，是两者分开，达到纯化的目的；另外对贴壁细胞与半贴壁细胞及黏附细胞间的分离纯化也是十分有效的。

动物细胞培养教学设计

§2-2“动物细胞培养和核移植技术”第一课教学设计（青龙县木头凳高中秦维华066505）【设计思路】采用135互动课堂的教学模式，以问题为主线，通过一个个问题的解决，达到推动新课进行的目的。教学的思路问题——讨论——展示——质疑——答疑。教学中设计了自主探究、合作探究、课堂巩固、课堂检测、课后总结五个环节。自主探究部分，学生阅读课本P44-47，课前独立完成。合作探究部分，学生以小组为单位进行讨论完成。课堂巩固每个学生独立完成后，在小组内进行核对答案，讨论，会的教不会，然后展示，如果都不会，可向其它小组求助。课堂检测，以小组为单位，以抢答题的形式出现，并计分。总之，学生能说的让学生说，学生能做的让学生做，学生能思考的让学生思考，使学生始终能主动地参与学习，成为学习的主人。【教材分析】本节课为人教版新课程教材选修3第二章第二节的教学内容,本节内容设计2课时，本节课为第1课时。教学过程可以归纳成3个问题:(l) 什么是动物细胞培养? (2) 怎样进行动物细胞培养? (3)为什么要进行动物细胞培养?第3个问题是本节的重点。本节旨在通过这些问题让学生充分理解和认识生物工程的前沿技术,以此激发学生热爱科学、努力学习、积极探索的精神。【学情分析】高二年级多数学生已经掌握了一定的生物学基础知识,具备了独立思考和判断的能力,合作性学习能力较强,但是个体之间还是存在着较大的差异。因此本节课以学生的学习为主,以教师的组织和引导为辅。加强教材与生活的联系,引导和调动学生的情感体验,关注学生的心理变化,培养学生对事物有正确的情感态度。【教学目标】知识目标：1、简述动物细胞培养的过程、条件及应用 2、简述通过动物体细胞核移植技术克隆动物的过程及应用前景能力目标：运用细胞的基础知识，分析细胞工程的理论基础情感目标：关注细胞工程研究的发展和应用前景。【教学重点难点】

细胞原代培养细胞生物学实验报告

细胞生物学实验报告细胞原代培养姓名：学号：班级：专业：同组成员：一、实验原理

细胞培养是生物学和医学研究中最常用的手段之一，可分为原代培养和传代培养两种。原代培养是直接从生物体获取组织或器官的一部分进行培养。由于培养的细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段。同时也为以后传代培养创造条件。原代培养的方法： 1、组织块法在平皿中用弯头剪把组织尽量剪碎，每个组织块小于1mm3大小。用Hanks 液洗涤2—3次，自然沉淀。用吸管吸去上清液。将组织块贴于培养瓶进行培养。 2、酶消化法将1mm3大小的组织块放入1个三角瓶内加入10—30ml的%的胰蛋白酶。370C磁棒搅拌消化20－30分钟。然后终止消化。用几层无菌纱布过滤。取过滤液，离心800rpm 5—10分钟收集细胞。弃上清，加入带有双抗的培养基，放入培养瓶培养。取材注意事项：取材要注意新鲜和保鲜。取材应严格无菌。取材和原代细胞制作时，要用锋利的器械，如手术刀或剃须刀片切碎组织，尽可能减少对细胞的机械损伤。要仔细去除所取材料上的血液（血块）、脂肪、坏死组织及结缔组织，切碎组织时应避免组织干燥，可在含少量培养液的器皿中进行。取材应注意组织类型、分化程度、年龄等，一般来讲，胚胎组织较成熟个体组织容易培养，分化低的较分化高的组织容易生长，肿瘤组织较正常组织容易培养。二、实验目的 1、理解细胞原代培养原理 2、熟悉细胞原代培养方法与过程 3、了解细胞原代培养的应用 4、独立进行细胞原代培养操作三、实验材料手术小直剪刀、眼科直镊子、眼科弯镊子、玻璃平皿、培养瓶、试管、移液管、巴斯德吸管、废液缸、75%酒精棉球、酒精灯。动物：9-12日龄的鸡胚蛋四、实验步骤

(完整版)动物细胞培养及应用发展史

细胞培养技术

细胞培养发展史及其应用（一）前言 20世纪初，人们不知道神经纤维是由神经细胞的细胞质向外突出形成的，还是由神经细胞周围的其他细胞融合而成的。生物学家们就这个问题展开了激烈的争论。1907年，美国生物学家哈里森(Harriso n)从蝌蚪的脊索中分离出神经组织，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培养。蝌蚪的神经组织存活了好几周，并且从神经细胞中长出了神经纤维。哈里森的实验不仅解决了神经纤维的起源问题，而且开创了动物组织培养的先河。此后，在许多科学家的不懈努力下，动物组织培养不断改进并逐渐发展成为动物细胞培养。所谓动物细胞培养(亦称组织培养)既有别于植物细胞培养，又与微生物的培养完全不同。所谓动物细胞培养是指离散的动物活细胞在体外人工条件下的生长、增殖过程，在此过程中细胞不再形成组织。由于动物细胞培养是在人工条件下进行的，便于调控和观察，因而成为现今研究动物的物质代谢过程、染色体的形态变化、以及遗传物质的表达调控等高难领域的既便利而又有效的新方法。同时，随着现代生物化学、分子生物学、分子遗传学、以及现代医学的发展，细胞培养也在许多应用领域充分展示了其巨大的发展潜力，并已为世人所关注。尽管如此，动物细胞培养仍是一门年轻的新学科，在发展之初被混淆于动物组织培养之中。（二）细胞培养技术及其历史细胞培养的历史最早可追溯到19 世纪末，据可考证的资料记载W ilhelm Roux是第一个进行动物组织培养实验的人。 1885年Wilhelm Roux 将鸡胚髓板放置于温热盐水中使之维持存活了数天，是有记录的第一个体外移植成功的例子。 1887年Arnold把恺木的木髓碎片接种到蛙的身上。当白细胞侵入这些木髓碎片后，他把这些白细胞收集在盛将盐水的小碟中，接下来观察到这些白细胞在运动，并存活了一个短的时间。

常用的五种动物细胞培养方式

?一、半连续式培养 1.半连续式培养又称为重复分批式培养或换液培养。采用机械搅拌式生物反应器系统，悬浮培养形式。在细胞增长和产物形成过程中，每间隔一段时间，从中取出部分培养物，再用新的培养液补足到原有体积，使反应器内的总体积不变。这种类型的操作是将细胞接种一定体积的培养基，让其生长至一定的密度，在细胞生长至最大密度之前，用新鲜的培养基稀释培养物，每次稀释反应器培养体积的1/2~3/4，以维持细胞的指数生长状态，随着稀释率的增加培养体积逐步增加。或者在细胞增长和产物形成过程中，每隔一定时间，定期取出部分培养物，或是条件培养基，或是连同细胞、载体一起取出，然后补加细胞或载体，或是新鲜的培养基继续进行培养的一种操作模式。剩余的培养物可作为种子，继续培养，从而可维持反复培养，而无需反应器的清洗、消毒等一系列复杂的操作。在半连续式操作中由于细胞适应了生物反应器的培养环境和相当高的接种量，经过几次的稀释、换液培养过程，细胞密度常常会提高。 2.半连续式特点： ·培养物的体积逐步增加； ·可进行多次收获； ·细胞可持续指数生长，并可保持产物和细胞在一较高的浓度水平，培养过程可延续到很长时间。该操作方式的优点是操作简便，生产效率高，可长时期进行生产，反复收获产品，可使细胞密度和产品产量一直保持在较高的水平。在动物细胞培养和药品生产中被广泛应用。二、连续式培养 1.连续式培养是一种常见的悬浮培养模式，采用机械搅拌式生物反应器系统。该模式是将细胞接种与一定体积的培养基后，为了防止衰退期的出现，在细胞达最大密度之前，以一定速度向生物反应器连续添加新鲜培养基；同时，含有细胞的培养物以相同的速度连续从反应器流出，以保持培养体积的恒定。理论上讲，该过程可无限延续下去。

2.2.1动物细胞培养和核移植技术(第1课时) 导学案

2.2.1动物细胞培养和核移植技术（第1课时）导学案【学习目标】简述动物细胞培养的过程、条件及应用。【学习重难点】动物细胞培养的过程及条件【学习过程】一．知识链接： 1．植物组织培养的理论基础是什么？主要过程分为哪两步？ 2．不进行脱分化处理能否培养成完整的植物体？ 3．决定细胞脱分化、再分化的关键因素是什么？ 4．植物组织培养所必需的环境条件是什么？ 5．人体细胞生活的环境是怎样的？二．课前预习（一）动物细胞工程常用技术——、、、、等；其中技术是其他动物细胞工程技术的基础。（二）动物细胞培养： 1.动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的，将它分散成，然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞。 2. 动物细胞培养的原理。 3．动物细胞培养的过程过程：说明：（1）动物细胞培养特点：生长时、。细胞贴壁：在培养瓶中，悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。接触抑制：当贴壁细胞分裂生长到表面时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象叫做接触抑制。（2）分散成单个细胞的方法：剪碎、用或处理。（3）原代培养：将动物组织消化后的。（10代以内或分瓶之前）（4）传代培养：的细胞继续培养。（10代以后或分瓶之后）（5）两次停止期：①10代左右有些细胞不能传代，有些细胞继续传代。 ②50代左右绝大多数细胞死亡，部分细胞发生变化，获得，朝着等同于的方向发展，无限增殖。提示：分瓶之前，称原代培养；出现接触抑制用胰蛋白酶处理，再分瓶培养为传代培养。4.动物细胞培养的条件： 5.动物细胞培养技术的应用：三．课内探究学案 ①为什么选用幼龄的动物组织或胚胎？ ②为什么要把细胞分散？如何使组织分散为单个细胞？这说明细胞间的物质是什么？能不能用胃蛋白酶？ ③制成细胞悬液的主要目的是什么？ ④培养细胞的培养瓶或培养皿应具备什么条件？ ⑤贴满瓶壁的细胞要如何处理才能继续培养？ ⑥哪些细胞失去了接触抑制？ ⑦动物细胞培养能否象植物组织培养那样获得克隆个体？需要诱导其脱分化的过程吗？ ⑧目前使用的或冷冻保存的正常细胞通常为10代以内的，为什么？10～50代，50代以后细胞有什么变化？ ⑨动物细胞培养液的主要成分是什么？较植物组培培养基有何独特之处？ ⑩动物细胞培养时所需的气体及作用是什么？动物组织块剪碎 . 单个细胞加培养液制成细胞悬液. . 分瓶

细胞实验室

一．建设方案之动物细胞培养实验室（设备片）在生命科学科领域中细胞学有着至关重要的地位，近年来细胞学发展迅速，并取得了相当大的进展，细胞学相关实验室的建设也是各个研究院及院校生物学科必备的实验室。细胞相关实验所需仪器及耗材种类繁多，接下来就细胞培养实验室常用仪器作下简单介绍：一、纯水系统细胞培养用水一般要求双蒸水（0.8MΩ以上），实际上普通蒸馏水经玻璃器皿中按标准方法蒸馏二次得到的双蒸水是不能满足要求的，而且水中的内毒素直接参与细胞凋亡，血清中内毒素含量越低，对细胞毒性越小，越利于细胞的生长和传代；内毒素含量过高，会直接导致细胞提前老化。因此建议配置正式的水纯化系统。二、液氮罐为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存。冻存的温度一般为液氮温度-196℃，因此，需要液氮罐。在此环境中，一般细胞可以保存十年具有活性。三、超净工作台/生物安全柜细胞培养对无菌环境要求很高，在细胞操作时，一般需要在100级空气质量条件下进行，因此超净工作台或生物安全柜就必须配备。四、CO2培养箱 CO2培养箱是细胞培养的必备仪器，它为细胞提供了一个体外培养的舒适环境，如适宜的温度、湿度、酸碱度、O2浓度等。细胞在体外培养时很容易受到各种细菌、微生物的感染，因此，CO2培养箱的灭菌和抑菌能力就显得尤为重要。五、恒温水浴从液氮或超低温冰箱中取出细胞冻存管需要立即放于37℃水浴中快速复苏之后才传代培养，因此，恒温水浴也是细胞实验室必备仪器。六、超低温冰箱细胞的冻存过程需要一系列程序降温，一般4℃下存放30 min，转放-20℃ 1 hour，再转入-70至-80℃过夜，之后才可以转移到液氮内(-196℃)，这时就必须配备一台-86℃超低温冰箱。一般超低温冰箱保存细胞可达数月，对于不需要长期冻存的细胞，可暂时放于超低温冰箱保存。七、离心机细胞培养需要离心收集传代细胞，所以需要配置低速的常温离心机，对于后期细胞内容物的

高中生物人教版(2019)选择性必修三学案 2.2.1动物细胞培养

2.2 动物细胞工程（一）动物细胞培养学案学习目标 1. 说明动物细胞培养的条件和动物细胞培养过程中细胞生长的特点；比较动物细胞培养与植物组织培养的不同。 2. 说明干细胞在医学、药物安全性与有效性检测等领域的应用及存在的问题。一、动物细胞培养的条件 1. 动物细胞培养的概念：动物细胞培养是指从动物体中取出，将它分散成，然后在适宜的培养条件下，让这些细胞和的技术 2. 动物细胞培养的条件：（1）营养：无机物：等有机物：糖类、、、、等（2）无菌、无毒的环境 ①对培养液和所有进行无菌处理 ②在培养液中添加一定量的无毒：定期更换培养基，以便（3）温度和pH 温度：哺乳动物多以为宜 pH ：多数细胞生存的适宜pH 为（4）气体环境 O 2：细胞代谢所必需的 CO 2：维持培养液的二、动物细胞培养的过程 1. 细胞贴壁的概念：细胞往往贴附在，这种现象称为细胞贴壁 2. 接触抑制的概念：贴壁细胞在生长增殖时，还会发生接触抑制现象，即当贴壁细胞分裂生长到时，细胞通常会 3. 原代培养的概念：通常将的细胞培养，即动物组织经称 1.通过动物细胞培养获得大量细胞，可以证明动物细胞具有全能性（）二、干细胞培养及其应用无菌 95%空气加5%CO 2的混合气体

1.干细胞的种类：干细胞存在于、和等多种组织和器官中，包括和等 2.胚胎干细胞的特点：胚胎干细胞，（简称细胞）存在于中，具有分化成为成年动物体内的的细胞，并进一步形成机体的所有和甚至的潜能 3.成体干细胞的种类：成体干细胞是或内的干细胞，包括骨髓中的、神经系统中的和睾丸中的等 4.成体干细胞的特点：成体干细胞具有，只能分化成特定的或，不具有的能力 5.造血干细胞的分布：造血干细胞主要存在于成体的、和中课堂检测一、单选题 1.提供骨髓造血干细胞并不会对试管婴儿造成损伤，其原因是( ) A.骨髓造血干细胞已高度分化 B.骨髓造血干细胞可以无限再生 C.骨髓造血干细胞完成功能后不再发挥作用 D.骨髓造血干细胞有再生能力，捐献后可刺激骨髓加速造血 2.某研究小组为测定某种药物对体外培养细胞的毒性，准备对某种动物的肝肿瘤细胞（甲）和正常肝细胞（乙）进行动物细胞培养。下列叙述正确的是( ) A.动物细胞培养过程中，通常要通入5%的CO2刺激细胞呼吸 B.培养液需含有葡萄糖、氨基酸、无机盐、生长素和动物血清等 C.为了防止细胞培养过程中的细菌污染，可向培养液中加入适量的抗生素 D.甲、乙细胞在持续传代培养过程中，均会出现停止增殖的现象 3.下列有关动物细胞培养的叙述，正确的是( ) A.动物细胞培养技术的原理是细胞的全能性 B.原代培养过程中小部分细胞会发生细胞核型改变而获得不死性 C.传代培养时需要用胃蛋白酶处理贴壁生长的细胞 D.培养过程中细胞表面相互接触时，细胞会停止分裂增殖 4.下列关于动物细胞培养的叙述，正确的是( ) A.传代培养的正常动物细胞在培养瓶壁上可形成多层细胞

《细胞实验》02 原代细胞培养和传代培养的方法

原代细胞培养和传代培养的方法原代培养原理将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。仪器、材料及试剂仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃）材料：动物组织块试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s液，碘酒初代消化培养法 1. 准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。 2. 布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。 3. 处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。 4. 剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。 5. 消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。 6. 分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织

已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。 7. 计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。 8. 培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。初代组织块培养法 1. 剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm3块为止。 2. 摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一25ml培养瓶底可摆布20~30块。 3. 轻轻翻转培养瓶，另瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，塞好瓶塞，置36.5℃温箱培养2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。 4. 培养：从微箱中取出培养瓶，开塞，46度斜持培养瓶，箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液慢慢覆盖附于瓶地上的组织小块。置温箱中静止培养。待细胞从组织块游出数量增多后。再补加培养液。传代培养法原理细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。传代培养也是一种将细胞种保存下去