药品生产设备表面微生物取样方法确认

药品生产设备表面微生物取样方法确认

颜若曦北京紫竹药业有限公司，北京

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摘要：目前国内外法规在药品生产设备的清洁验证中仅仅要求对化学残留的取样方法进行验证。本文提出在药品生产设备清洁验证中对微生物取样方法进行评估、确认的必要性，建立了一种评价药品生产设备表面微生物取样回收率和重复性的方法：采用304 不锈钢板作载体，以大肠埃希菌作为细菌的代表，白色念珠珠作为真菌的代表，同步制备菌种载体，同时检测菌种载体活菌数计算回收率，方法消除了载体制备过程中微生物死亡对回收率计算的影响。同时对目前国内药品生产企业常用的表面微生物取样方法（玻璃棉签擦拭、一次性医用棉签擦拭和淋洗水取样）进行评价，建立检测药品生产设备表面真实活菌数的方法。

关键词：表面微生物；回收率；清洁验证

中图分类号：TQ

0 引言

国内外法规均规定：“药品生产的每道工序完成后，需对药品生产设备进行清洁，并对清洁的方法进行验证，在清洁验证中要求对化学残留的取样方法进行验证”，却未要求对微生物的取样方法进行确认。[2-5，10]目前为此，尚未发现关于表面微生物采样方法确认的文献与报道。微生物在适当的温湿度下以残留物中的有机物为营养可大量繁殖，产生各种代谢物，从而大大增加残留物的复杂性和危害程度。进而对下批产品造成不良影响。[5]因此必须药品生产设备的微生物进行严格控制。不进行微生物取样方法的确认，检测结果将是不可信的。不准确的检测结果将对药品的生产造成不良的影响。为解决这一问题，本文建立了一种评价药品生产设备表面微生物取样回收率的方法，并对目前国内药品生产企业常用的表面微生物取样方法进行简单分析。

1 实验试剂、原料及菌种

1.1 实验试剂及原料

1.1.1 培养基

实验用营养琼脂培养基干粉试剂、玫瑰红钠琼脂培养基干粉试剂、pH7.0 氯化钠—蛋白胨缓冲液干粉试剂、营养肉汤培养基干粉试剂、改良马丁培养基干粉试剂均为北京三药科技开发公司生产。

1.2.2 试剂及原料氯化钠（分析纯）：北京化工厂；医用脱脂棉：河南省焦作市联盟卫生材

料有限公司。

1.2 菌种

实验用菌种：大肠埃希菌（CMCC 编号：44102）、白色念珠菌（CMCC 编号：98001）均为中国药品与生物制品检定所生产。检测时均按中国药典要求，取3-5 代菌种进行实验。[1，6，7]

2 表面微生物取样方法评价

2.1 评价方法描述

微生物是的特性决定其取样方法的评价不能参照化学残留的取样方法进行，因为在载体制备的过程中，将会有大量微生物死亡，故不能使用取样结果除去实际的染菌数来计算回收率。本文采用同时制备且放置相同时间的菌种载体进行对比，用待确认的取样方法对载体1 取样，同时检测载体2 上的实际活菌数，以二者的比值来计算回收率。并根据多次微生物取样检测结果计算RSD 值。

2.1.1 菌种及菌液制备

以大肠埃希菌（CMCC 编号：44102）作为细菌的代表，白色念珠菌（CMCC 编号：98001）作为真菌的代表。接种大肠埃希菌的新鲜培养物至10ml 营养肉汤中，30～35℃培养18～24 小时，取此培养液1ml 加0.9％无菌氯化钠溶液9ml，采用10 倍递增稀释法，稀释至10-2，使菌数约为50～100 cfu/ml。接种白色念珠菌的新鲜培养物至10ml 改良马丁培养基中，23～28℃培养42～48 小时，取此培养液1ml 加0.9％无菌氯化钠溶液9ml，采用10 倍递增稀释法，稀释至10-2，使菌数约为50～100cfu/ml。

2.1.2 菌种载体的制备取面积为5cm×5cm的304不锈钢板做为载体。载体于染菌前，应进行

脱脂和灭菌处理处

理。脱脂方法如下：①将载体放在含洗涤剂的水中煮沸30 min；②以自来水洗净；③用蒸馏水煮沸10min；④用蒸馏水漂洗至pH 呈中性；⑤晾干备用。[9]

采用湿热灭菌法（121℃湿，30min）对经过脱脂处理后的载体进行灭菌处理后即可染菌。

染菌：将经灭菌的载体平铺于无菌平皿内，逐片滴加菌液。菌液滴加量每片为10μl，用100μl移液器接灭菌塑料吸头滴染菌液后用吸头将菌液均匀擦拭整个载体表面（单面）。滴染菌液后，放置至干燥。

2.1.3 评价方法

将制备后的菌种载体分为2 组，每组3-5 片，分为待测取样方法取样检测组和菌种载体实际活菌检测组，同时另取3 片未染菌的载体做为阴性对照组。

待测取样方法取样检测组：使用待确认的微生物取样方法对菌种载体微生物进行采样，制备供试液后检测各菌种载体上活菌数；

菌种载体实际活菌检测组：将菌种载体放入装有100ml 生理盐水的500ml 烧杯中，使用漩涡振荡器振荡3min 后，取出烧杯中的生理盐水作为供试液，检测菌种载体上菌数；分别对3 个菌种载体进行检测（检测时取取20ml 供试液进行活菌计数，计数结果的5 倍为菌种载体的计数结果），以3 次检测结果的平均值作为菌种载体的实际活菌数。

阴性对照组：将未染菌的载体放入装有100ml 生理盐水的500ml 烧杯中，使用漩涡振荡器振荡3min 后，取出烧杯中的生理盐水作为供试液，取全部供试液进行活菌计数，以3 片未染菌的载体计数结果的平均值作为阴性对照结果。

对菌种载体实际活菌计数方法的确认：将菌种载体放入装有100ml生理盐水的500ml烧杯中，使用漩涡振荡器振荡3min后，取出烧杯中的生理盐水作为供试液1；将烧杯中的不锈钢载体取出放入装有100ml生理盐水的500ml烧杯中，使用漩涡振荡器振荡3min后，取出烧杯中的生理盐水作为供试液2。分别检测供试液1和供试液2中的活菌数。实验发现供试液2 中的活菌数为不超过5cfu,而供试液1中的活菌数均大于150cfu。可认为漩涡振荡器振荡3min 后已将菌种载体上的活菌全部分散于生理盐水中。

2.2 常用微生物取样方法评价

根据上述方法对国内制药企业常用的微生物取样方法：棉签取样（玻璃棉签、一次性无菌棉签），淋洗水取样进行评价。

2.2.1 表面微生物取样（棉签擦拭取样）

1）取样工具目前国内制药企业常用的微生物取样工具主要是玻璃棉签（企业自制）或一次性使用医

用棉签，玻璃棉签一般由药品生产企业自行制备，制备方法如下：

a) 采用中空玻璃棒（长约18cm，顶端粗糙，底端突起）、硅胶塞及医用脱脂棉制备取样

棉签，如图1 所示：

图1 取样棉签的制备材料

b) 制备过程：将玻璃棒底端插入硅胶塞孔内，然后将脱脂棉剪为长×宽×高（厚）约为

2.8cm×2.5cm×0.1cm 大小后残绕在玻璃棒顶端的粗糙部分，用力沿顺时针方向环绕，使脱脂棉紧贴于玻璃棒上。如图2 所示：

图2 玻璃棉签的制备