8_9个月SD大鼠小胶质细胞的纯化分离培养
大鼠脊髓小胶质细胞体外纯化培养方法的建立
大鼠脊髓小胶质细胞体外纯化培养方法的建立陈雪;张婷;李彩红;王伟;骆翔;喻志源【摘要】Objective: To establish a simple and highly efficient primary culture method for microglia from rat spinal cord. Methods: Mixed glial cells were obtained from the spinal cord of newborn SD rats. On day 3, the culture medium was changed until the cultured microgila became fused on day 10. The microglia were purified using shocking methods (37 ℃, 180 rpm, 1~2 h) with different adhesion time (20~40 min). The isolated and purified microglia were identified with Iba1 and CD11b after 24 h. Results: The rat spinal cord microglia were successfully isolated and purified. The cultured microglia presented round or fusiform, highly refractive morpholo-gy. Iba1 and CD11b fluorescence tests showed that the purity of microglia was more than 95%. Conclusion:Using nutrition deprivation, Shock and different adhesion time methods, a primary spinal cord microglia culture method with high yield and purity was established, providing a useful tool for studying rat spinal cord microglia in vitro.%目的：建立一种简易高效的大鼠脊髓小胶质细胞原代培养方法。
SD大鼠类胚胎干细胞(rESCs)的分离与初步培养的开题报告
SD大鼠类胚胎干细胞(rESCs)的分离与初步培养的开题报
告
研究目的：
本研究旨在分离和初步培养SD大鼠类胚胎干细胞(rESCs)，为深入研究该细胞的分化、应用和疾病机制提供实验材料。
研究方法：
1. 制备培养基：采用DMEM/F12（1:1）为基础，添加15%胎牛血清（FBS）、1%非必需氨基酸、1%L-谷氨酰胺、1%β-巯基乙醇、10 ng/ml LIF、2 mM L-脯氨酸和1%青霉素/链霉素混合抗生素。
2. SD大鼠类胚胎的分离：由6-8周大的SD雌鼠配对，自然交配，怀孕1
3.5 d
时处死母鼠，取出子宫，找到胚胎，取出放在PBS中，去掉头、内脏和四肢，取其体
细胞做为来源。
3. rESCs的分离：将胚体细胞放入0.25%胰蛋白酶1-EDTA中消化，加入培养基，放入生物安全柜中，避免污染，将细胞均匀涂布在明胶涂层的96孔板上，放入主要培养基，一定时间后观察到单个、圆形、紧密粘附的细胞集群，即可进行进一步培养。
4. rESCs的初步培养：活细胞用PBS冲洗一遍，再用0.05%胰酶-EDTA与PBS 1∶2的混合液消化断裂，离心2 min(1000r/min)，吸掉上清液，用10 ml保护性培养液(MEF+LIF+胰岛素+VEGF)将细胞复悬后，均匀分配在25cm2培养瓶中，为初级培养（P0）。
保持在5%CO2条件下进行培养。
预期结果：
通过本研究，我们将成功分离和初步培养SD大鼠类胚胎干细胞，获得高质量的
细胞材料，为进一步研究类胚胎干细胞分化、生长调节、功能鉴定等方面提供有效的
实验手段和平台。
9-8大鼠脂肪干细胞的分离培养1
大鼠脂肪干细胞的分离培养1.试剂配制1.1双抗培养基的配制用100万单位链霉素溶解在10ml去离子水中，抽出0.8ml以及用80万单位的青霉素溶解在8ml的去离子水中，抽出0.5ml，分别加入DM EM培养基中，即配成100U/m1青霉素，100U/m1链霉素双抗培养基。
1.2成骨诱导剂的配制地塞米松259溶解于100ml去离子水中，抽出10ul;10gβ一甘油磷酸钠溶解于6ml去离子水中，抽出lml;25g抗坏血酸溶解于100ml去离子水中，抽出100ul，分别加入100ml的培养基中，既配成了含1nmol/L 地塞米松，50ug/m1抗坏血酸，10mmol/Lβ一甘油磷酸钠的成骨诱导剂。
1.3 DMEM培养基的配制取一瓶DM EM溶解于1000ml去离子水中，搅拌均匀后，用7%NAHC03调节其PH值为7.2-7.4。
用滤器过滤，分装在100ml的清洁无菌生理盐水瓶中置4℃冰箱中。
1.4含10%胎牛血清的DM EM完全培养基的配制取10ml胎牛血清溶解于90mLDM EM培养基中，即可配成含10%胎牛血清的DM EM培养基，装在100ml的生理盐水瓶中置4℃冰箱中。
1.5 0.25%胰蛋白酶的配制用精确的天平称250mg胰蛋白酶，并溶解于100ml培养基中，即浓度为0.25%。
用7%NaHC03调节其PH值为7.2-7.4。
用滤器过滤后，分装在100ml的清洁无菌生理盐水瓶中置4℃冰箱中。
1.6 Ⅰ型胶原多克隆抗体配制I型胶原多克隆抗体用去离子水配成1:100工作浓度，置4℃冰箱中备用。
1.7 二氮联苯胺(diminob ℃nzidin ℃DAB)显色剂的配制分别取lml试剂A，50ul试剂B，50ul试剂按A到C加入，即配成lmLDAB显色剂。
在配制成30min内用于免疫细胞化学染色。
1.8 地塞米松(DXM)液的配制地塞米松25g溶解于100ml去离子水中，抽出10ul。
既配成了含1nmol/L地塞米松，使用时根据需要配制成不同浓度。
大鼠少突胶质细胞的纯化培养与鉴定
大鼠少突胶质细胞的纯化培养与鉴定
徐明杰;王玮
【期刊名称】《局解手术学杂志》
【年(卷),期】2008(17)6
【摘要】目的探讨新生2 d Sprague-Dawley(SD)大鼠脑少突胶质细胞的分离方法和生长条件,为少突胶质细胞损伤后髓鞘形成障碍或脱髓鞘疾病的研究奠定基础.方法根据星形胶质细胞和少突胶质细胞的生长时间差异、细胞生长方式及细胞对培养层粘附等特性的不同,采用两次恒温摇床振荡分离纯化法和条件限定培养基培养获取并鉴定高纯度的大鼠少突胶质细胞.结果培养出突起有如蜘蛛网状的成熟少突胶质细胞,半乳糖脑苷脂(Galactocerebroside,Gal)阳性.结论两次恒温摇床振荡分离纯化法和条件限定培养基培养可获取高纯度的大鼠少突胶质细胞.
【总页数】3页(P379-381)
【作者】徐明杰;王玮
【作者单位】福建医科大学神经生物学研究中心,福建,福州,350004;福建医科大学神经生物学研究中心,福建,福州,350004
【正文语种】中文
【中图分类】R651;Q813.11
【相关文献】
1.大鼠星形胶质细胞和少突胶质细胞的纯化培养与鉴定 [J], 伍亚民;马海涵;廖维宏
2.新生大鼠视神经少突胶质细胞体外培养纯化及鉴定 [J], 彭锡嘉;刘少章;叶剑;袁
容娣
3.大鼠脑皮质少突胶质细胞培养与鉴定 [J], 周静;谢骐骥;余资江;孙宝飞;戈果
4.少突胶质细胞体外培养、纯化、鉴定及缺氧模型建立 [J], 杨晖;王玮
5.新生大鼠大脑少突胶质细胞系的分离纯化和定向分化培养 [J], 何平;沈馨亚;杨勤;汪洋;邱云芳;刘才栋
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大鼠少突胶质前体细胞(OPCs)纯化培养及糖氧剥夺(OGD)模型的建立
大鼠少突胶质前体细胞(OPCs)纯化培养及糖氧剥夺(OGD)模型的建立付佩彩;黄珊珊;唐荣华;赵东明【摘要】目的建立大鼠脑少突胶质前体细胞(oligodendrocyte precursor cells,OPCs)分离纯化培养及糖氧剥夺(oxygenglucose deprivation,OGD)模型.方法出生3d内的SD大鼠乳鼠取脑,经胰蛋白酶消化法培养混合胶质细胞,混合培养10d后,震摇及差速贴壁法分离纯化OPCs,纯化培养3d后鉴定、诱导分化OPCs 为少突胶质细胞(oligodendrocyte,OL)及进一步OGD干预.免疫荧光法鉴定OPCs纯度及分化为OL的能力;MTT法检测OGD(37℃,1％O2,5％ CO2)干预0.5h、1h、2h及4h时细胞活力改变,Edu染色检测细胞增殖情况.结果免疫荧光显示纯化培养的OPCs 95％以上表达NG2+ A2B5,且可分化为MBP阳性的OL.OGD 2h时,MTT显示细胞活力明显下降,EdU染色阳性率明显降低.结论震摇及差速贴壁法可获得高纯度的OPCs,且细胞具有分化为OL的能力.2h可作为OPCs OGD模型缺血缺氧损伤合适时间.【期刊名称】《中国组织化学与细胞化学杂志》【年(卷),期】2015(024)005【总页数】5页(P470-474)【关键词】少突胶质前体细胞;细胞培养;糖氧剥夺;EdU【作者】付佩彩;黄珊珊;唐荣华;赵东明【作者单位】华中科技大学同济医学院附属同济医院神经内科,武汉430030;华中科技大学同济医学院附属同济医院神经内科,武汉430030;华中科技大学同济医学院附属同济医院神经内科,武汉430030;华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科,武汉430030【正文语种】中文【中图分类】Q813.11少突胶质前体细胞(OPCs)是近年来发现的神经胶质前体细胞，约占成年中枢神经系统(CNS)中所有胶质细胞的5%－8%。
8_9个月SD大鼠小胶质细胞的纯化分离培养
#论 著#8-9个月SD 大鼠小胶质细胞的纯化分离培养耿 慧 钟 远=摘要> 目的 建立培养8-9个月SD 大鼠大脑皮层小胶质细胞的方法。
方法以M cCarthy 的方法为基础,并加以改进,采用振摇结合贴壁分离法纯化小胶质细胞;CD11b 免疫细胞化学染色对纯化的小胶质细胞纯度进行鉴定;相差显微镜下进行细胞形态观察和细胞计数;CCK-8比色法检测纯化的小胶质细胞在不同时间点的活力和增殖。
结果 培养的8-9个月SD 大鼠大脑皮层小胶质细胞,纯度达到95%,培养过程中未出现明显的增殖。
结论 8-9个月SD 大鼠大脑皮层的小胶质细胞在体外亦可成功培养,为小胶质细胞在老年疾病中的研究奠定了基础的。
=关键词>小胶质细胞;细胞培养;衰老;阿尔茨海默病中图分类号:R 331 文献标识码:A 文章编号:1006-351X (2010)02-0152-03The pr i m ary cu lture m e thod for isolation of m icrogli a fro m 8-9m on th rats GE N G H u i ,Z H ONG Yuan .D epart m entof G e ronti s m,the S i x t h P eop le s 'H osp ita l o f Shangha i Ji ao t ong U n i ve rs i ty ,Shangha i 200233,Ch i na Correspond i ng au thor : ZHONG Y uan ,Ema i:l zhongyuan60@yahoo =Abstract > O bjective T o se t up an easy and e ffecti ve m ethod for pr i m ary cu lti vate and pur ifi cation of the m i crog lia cells .M eth odsBased on class i ca lm i crog li a pri m ary cu lture m e t hod o fM cCa rt hy ,and w e i m proved th i sm ethod .In the l a ter pur ifi cation phase o f ce ll cu lti va tion ,m i crog lias w ere parall y ope ra ted and culti v ated w ith m echan ical separa ti on m ethod .M orpho log i c changes and the nu mber of ce lls were reco rded under the sa m e m agn ifi ed fi e l d o f scope .The acti v ity and t he pro liferati on w ere exam i ned by C ell Counting K it .R es u lts P resen t m od ifi edm ethod stead ily produced m icrog li a from 8-9m ont h SD rat w ith hi gh pur it y.N o sign ificant pro lifera ti on w as found i nnor m a l cu lt ura l cond iti on .Con clusi onThe m i crog lia ce lls i solated from 8-9m ont h SD rat can a lso be cu lti vatedsuccessfull y i n v itro ,prov i ding a basis f o r furt her research o f the m icrog lia i n A l zhe i m er d i sease .=K ey words >M icrog li a ;Ce ll culture ;A g i ng ;A lz he i m er s 'disease作者单位:200233上海,上海交通大学附属第六人民医院老年科通信作者:钟远,Em ai:l z hongyuan60@yahoo .co 小胶质细胞是脑内的免疫效应细胞,大约占中枢神经系统脑实质胶质细胞数量的10%。
SD大鼠少突胶质前体细胞系的分离、培养及鉴定
SD大鼠少突胶质前体细胞系的分离、培养及鉴定唐军;钟琳;姚裕家;陈娟【期刊名称】《中华实用儿科临床杂志》【年(卷),期】2006(012)023【摘要】目的获取高纯度的少突胶质前体细胞系,并作鉴定.方法根据星形胶质细胞和少突胶质前体细胞系生长时间的差异,细胞黏附特性的不同,利用振荡分离纯化法获得纯化的SD大鼠少突胶质前体细胞,再用添加了神经营养因子(N2)、血小板衍生生长因子(PDGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的无血清培养基传代培养.免疫荧光法对表面抗原进行细胞鉴定.结果获得纯度95%以上少突胶质前体细胞,少突胶质祖细胞A2B5、O4抗体阳性;未成熟少突胶质细胞O4、O1阳性;胶质细丝酸性蛋白(GFAP)均为阴性.结论通过振荡分离纯化法及结合少突胶质细胞定向培养基是培养少突胶质前体细胞的可靠方法;N2、PDGF、bFGF的添加可显著提高细胞产量,并使细胞保持在未成熟阶段.【总页数】3页(P1657-1659)【作者】唐军;钟琳;姚裕家;陈娟【作者单位】四川大学华西第二医院,儿科,成都,610041;四川大学华西第二医院,儿科,成都,610041;四川大学华西第二医院,儿科,成都,610041;四川大学华西第二医院,儿科,成都,610041【正文语种】中文【中图分类】R729【相关文献】1.成年SD大鼠胃窦Cajal间质细胞分离、培养及鉴定 [J], 张程程;彭艳;陈海交;杨建文;刘薇薇;刘丽2.SD大鼠腹腔脂肪干细胞分离培养和鉴定 [J], 张洋洋;陈良安3.新生SD大鼠心肌细胞分离培养及纯化的快速便捷方法及鉴定 [J], 付微;刘飞;乔陆明;张绪东4.新生大鼠高纯度少突胶质前体细胞系细胞的培养与鉴定:改良振荡分离纯化法的特点 [J], 殷红兵;丁爱石;吴卫平;范明5.新生大鼠大脑皮层少突胶质前体细胞的培养分离及鉴定 [J], 吴波;任先军因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
SD大鼠睾丸支持细胞的分离、培养、纯化及鉴定
ｔ ｎ ｕ ｉ ｇｔ ｒ ｅ ｅ ｚ ｍｅ ｄ ｄ ｆ ｒ ｎｉｔ ｄ ａ ｃ ｏ ｎ ｔ ０ ． ｈ ｈ ａ ｔ ｃｕ ｅ ｏ ｅ ｏ ｅ ａ ｄ ｎ ｉ ｅ ｓｎ ｉ ｓ ｅ ｎ ｙ ｓａ ｉ ｅｅ ｔ ｅ ｈ ｒ ｇ ｍｅｌ ｄ Ｔ ｅｕ ｒｓｒ ｔｒ ｆｓ ａ ｈ ｃ ｌ ｗ ｓ ｉｅ ｔ ｄ ｕ ｉｇ ＨＥ． ｌ ｏ ｎ ｈ ｎ ａ ｎ ｉ ｌ ｕ ｉ ｆ Ｏｉ
ｔ ｌ ｓｕ ｔ ｈ ｕ ｖｖ ａｅａ ｏ ｅ９ ％． ｅｃ ｌ ｂ ｇ ｎｔ ｎ ｈ ｒａｔｒ５ｈ ｕｓ／ ／ ｏｃ ｌ ｒ ． ｎ ｈ ｒｗ ｈｒｔ ｆ ｉ ｅｔ ｓ ｅｗｉ ｔｅｓ ｒｉａ ｒｔ ｂ ｖ ０ Ｔ ｅｌ ｅ ａ ａ ｃ ｏ ｆ ｏ ｒ ｎ ｖｔ ｕｔ ｅ ａ ｄｔｅｇｏ ｔ ａｅｏ ｃ ｉ ｈ ｌ ｈ ｏ ｅ ｒ ｕ
构与支持细胞 的形态特征一致 。 可见 ， 采用三酶两步消化法和差异贴壁法 ， 可达到分离 、 培养 、 纯化Ｓ 大鼠支持细胞 的 Ｄ
目的 。
关键词： 睾丸 ； 支持细胞 ； 体外培养 ； 鉴定 ； Ｄ 鼠 Ｓ大
中图分类号 ：８ ２１ Ｑ ５ ．— ３１ ￥ ５ ．； ９４６ ３ ＋ 文献标识码 ： Ａ 文章编号 ：０２ ８ ６ （０ ０ Ｏ — ２ ９ ０ １０ — １ １２ １ ）３ ０５ — ４
（ Ｃ ｒ ｇ ｆ ｎｍ ｌ ｃｅｃ ｎ ｅｈ ｏｏｙ Ｇ ａｇｉ ｎｖｒｔ， ａｎｎ ３０ ５ Ｃ ｉ ； ｉｅ Ｂｏ ｃ ｎｌ １ ｏ ｅｅ ｉ ａ Ｓ ｉ ｅａｄＴｃ ｎｌ ， ｕ ｎｘ Ｕ ｉ ｓｙ Ｎ ｎ ｉ ５ ０ ０ ， ｈｎ ２Ｗｅ ｉ ｉｅｈ ｏ ｇ ｔ ｏＡ ｎ ｇ ｅｉ ｇ ａ ｍ ｔ ｏ ｙ
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#论 著#8-9个月SD 大鼠小胶质细胞的纯化分离培养耿 慧 钟 远=摘要> 目的 建立培养8-9个月SD 大鼠大脑皮层小胶质细胞的方法。
方法以M cCarthy 的方法为基础,并加以改进,采用振摇结合贴壁分离法纯化小胶质细胞;CD11b 免疫细胞化学染色对纯化的小胶质细胞纯度进行鉴定;相差显微镜下进行细胞形态观察和细胞计数;CCK-8比色法检测纯化的小胶质细胞在不同时间点的活力和增殖。
结果 培养的8-9个月SD 大鼠大脑皮层小胶质细胞,纯度达到95%,培养过程中未出现明显的增殖。
结论 8-9个月SD 大鼠大脑皮层的小胶质细胞在体外亦可成功培养,为小胶质细胞在老年疾病中的研究奠定了基础的。
=关键词>小胶质细胞;细胞培养;衰老;阿尔茨海默病中图分类号:R 331 文献标识码:A 文章编号:1006-351X (2010)02-0152-03The pr i m ary cu lture m e thod for isolation of m icrogli a fro m 8-9m on th rats GE N G H u i ,Z H ONG Yuan .D epart m entof G e ronti s m,the S i x t h P eop le s 'H osp ita l o f Shangha i Ji ao t ong U n i ve rs i ty ,Shangha i 200233,Ch i na Correspond i ng au thor : ZHONG Y uan ,Ema i:l zhongyuan60@yahoo =Abstract > O bjective T o se t up an easy and e ffecti ve m ethod for pr i m ary cu lti vate and pur ifi cation of the m i crog lia cells .M eth odsBased on class i ca lm i crog li a pri m ary cu lture m e t hod o fM cCa rt hy ,and w e i m proved th i sm ethod .In the l a ter pur ifi cation phase o f ce ll cu lti va tion ,m i crog lias w ere parall y ope ra ted and culti v ated w ith m echan ical separa ti on m ethod .M orpho log i c changes and the nu mber of ce lls were reco rded under the sa m e m agn ifi ed fi e l d o f scope .The acti v ity and t he pro liferati on w ere exam i ned by C ell Counting K it .R es u lts P resen t m od ifi edm ethod stead ily produced m icrog li a from 8-9m ont h SD rat w ith hi gh pur it y.N o sign ificant pro lifera ti on w as found i nnor m a l cu lt ura l cond iti on .Con clusi onThe m i crog lia ce lls i solated from 8-9m ont h SD rat can a lso be cu lti vatedsuccessfull y i n v itro ,prov i ding a basis f o r furt her research o f the m icrog lia i n A l zhe i m er d i sease .=K ey words >M icrog li a ;Ce ll culture ;A g i ng ;A lz he i m er s 'disease作者单位:200233上海,上海交通大学附属第六人民医院老年科通信作者:钟远,Em ai:l z hongyuan60@yahoo .co 小胶质细胞是脑内的免疫效应细胞,大约占中枢神经系统脑实质胶质细胞数量的10%。
研究表明,小胶质细胞与脑外伤、脑肿瘤、脑缺血、阿尔茨海默病(A lzhei m er s 'd isease ,AD)、帕金森病与实验性自身免疫性脑脊膜炎等中枢神经系统疾病有关。
小胶质细胞的纯化分离培养对于离体条件下进行小胶质细胞的实验研究具有广泛的实用价值。
但由于其细胞数目所占比例较小,在体外较难分裂增殖,研究多采用新生大鼠源性的小胶质细胞。
但是已有研究证实新生鼠源性的小胶质细胞在很多生物学特性上跟成年鼠的小胶质细胞有很大的差别。
为了深入研究小胶质细胞在阿尔茨海默病等老化相关性疾病中的作用,本文以M c Carthy 的方法为基础并加以改进,在体外成功培养成年SD 大鼠源性的小胶质细胞,为小胶质细胞在增龄性疾病中作用的研究奠定了基础。
材料和方法一、实验动物和试剂1.实验动物成年SD 大鼠(8-9月龄),上海实验动物中心提供。
2.试剂D ME M /F12高糖培养基(含双抗,青霉素100U /m ,l 链霉素100U /m l),胰蛋白酶(G I BCO 公司),优质胎牛血清(H yclone 公司),小鼠抗大鼠CD11b 单克隆抗体,DAB 显色试剂盒(武汉博士德公司),CCK-8试剂盒(日本同仁化工)。
二、实验方法1.混合胶质细胞培养8-9月龄SD 大鼠无菌条件下开颅取脑,取两侧大脑半球用冷D-H anks 溶液清洗并仔细剔除脑膜及血管,钳取皮质并充分剪碎(约0.5@0.5@0.5mm大小,尽量细碎);用抛光后的吸管轻轻吹打,使其成细胞悬液,加入0.125%胰蛋白酶2m l并置于37e培养箱内消化15m i n;加入15m l D ME M/F12完全培养基(10%胎牛血清,双抗)终止反应,再次用抛光成口径为1mm的吸管轻轻吹打20次,静止10分钟待组织下沉后,将细胞悬液移入另一新的离心管;再加入15m l DME M/F12完全培养基至剩余组织中,抛光吸管稍用力吹打,再让组织下沉,收集细胞悬液;重复上一步骤2~3次,将收集的细胞悬液用200目筛网过滤;过滤后的细胞悬液用50m l离心管分装,1000rpm离心10m in;弃上清,用含20%胎牛血清的D M E M/F12培养基重新悬浮细胞,胎盼蓝染色计数活细胞数量,调整细胞浓度为1@106 cells/m l接种至50m l一次性培养瓶中;置37e、5% CO2培养箱中培养。
2.小胶质细胞纯化分离上述混合培养的胶质细胞在培养箱中培养48h后全量换液(10%胎牛血清);次日置于37e恒温摇床中以250r/m in振速摇动处理2h,收集摇晃下来的细胞悬液并接种到另一50m l培养瓶中,37e、5%CO2培养箱中培养1h,弃去未貼壁细胞,获得的细胞即为纯化的小胶质细胞;胎盼蓝染色检测活细胞数目。
3.小胶质细胞培养分离纯化培养的小胶质细胞以2000cells/w ell的密度接种于96孔培养板,以4@104/c m2接种于预先埋植盖玻片的30m l培养皿中,加入含10%胎牛血清的D M E M/F12培养基继续培养,根据细胞代谢情况1~2天换液一次;倒置显微镜下每日观察小胶质细胞形态。
4.小胶质细胞的鉴定小胶质细胞长成片后,取出盖玻片,依次用0.9%生理盐水清洗3次,每次5分钟;4%多聚甲醛固定40分钟;0.01M pH7.3的PBS清洗3次,每次5分钟,放入4e冰箱中保存备用。
SP法免疫:取长有细胞的盖玻片,0.25%T rition X-100(用0.01M PBS稀释),室温,5~10m in;5%羊血清(用0.01M PBS稀释),37e孵育30m in;CD11b(稀释度1:50)的单克隆抗体标记小胶质细胞,4e,孵育24h;生物素标记羊抗小鼠抗体1:100,37e,孵育2h;辣根酶标记链霉卵白素1:100,37e,孵育2h;DAB呈色,苏木素复染1分钟,盐酸分化,氨水返蓝,封片,镜下观察。
以PBS代替一抗做阴性对照。
5.细胞计数及CCK-8细胞活力分析分别于纯化后24h、48h、72h、96h在相差显微镜高倍镜(25@10)视野下随机选取10个视野计数小胶质细胞;将细胞种植于96孔板,种植浓度为2000ce lls/ w e l,l分时检测,每个时间点设8个复孔,另设8孔空白对照,空白对照为含10%胎牛血清的DME M/F12培养基。
分别于培养24h、48h、72h、96h后用进行胎盼蓝染色活细胞计数和CCK-8法检测细胞活力。
ELX-800酶标仪测定各孔OD值,测定波长450n m。
三、统计学分析应用SPSS11.0医学统计软件包进行数据统计处理。
随机抽取5张免疫细胞染色盖玻片进行小胶质细胞的纯度鉴定,每张片子分别计数3个高倍镜视野下的细胞数和阳性细胞数,计算阳性细胞数所占总细胞数比值,并用单样本t检验对阳性细胞率进行统计分析,P>0.05为差异无统计学意义。
不同时间点细胞数目及CCK-8OD值数据以x?s表示,进行方差分析, P<0.05为差异有统计学意义。
结果1.小胶质细胞的鉴定及一般形态观察纯化分离的小胶质细胞进行CD11b抗体染色阳性细胞\95%(阳性细胞率为0.956?0.013,且P> 0.05,差异无统计学意义(图4)。
纯化分离的小胶质细胞多在30m i n~1h贴壁,形态上为圆形,边缘不规则。
培养第2天,可见小胶质细胞形态与第1天基本相同(图1);培养第3天,少数小胶质细胞出现单极突起(图2);培养第4天,绝大多数小胶质细胞出现双极突起并长成片(图3)。
2.细胞计数和CCK-8细胞活力分析经方差分析各时间点之间,小胶质细胞数目无显著性差异(P>0.05);CC K-8结果显示各时间点间细胞活力无明显改变(P>0.05,表)。
表不同时间细胞数及活力分析培养时间细胞数目(n=10)CCK-8OD值(n=8) 24h27.4?1.840.446?0.04048h27.9?1.450.426?0.04772h27.5?1.960.461?0.04696h28.2?2.100.459?0.038注:不同时间点细胞数目方差分析结果,F=0.253,P=0.859;不同时间点CCK-8OD值方差分析结果,F=0.413,P=0.745,差异均无统计学意义图1 纯化培养第2天 图2 纯化培养第3天图3 纯化培养第4天 图4 CD11b 免疫细胞鉴定讨 论小胶质细胞作为脑内的免疫效应细胞,是神经系统与免疫系统的交汇点,在脑内行使免疫监视和防御功能。