无血清培养
无血清培养基的组成和作用介绍
无血清培养基的组成和作用介绍在细胞培养中大多数动物细胞体外培养时都需要加入血清提供营养，但由于血清存在很多潜在风险，促使科学家们进行无血清驯化细胞的研究。
所以，在1976 年Hayashi 等人提出了无血清培养基的概念，此后，大量生物医药学家开始对无血清培养基进行研制。
80 年代后，无血清培养基的研究与制备广泛发展，到 90 年代已有一些商业化无血清培养基。
与传统的培养基相比较，无血清培养基是不含动物血清，但仍可以维持细胞在体外较长时间生长、增殖的一种培养基。
无血清培养基由于其组成成分相对清楚，制备过程简单，在现代生物技术学领域得到广泛应用。
无血清培养基的组成和作用1.葡萄糖动物细胞培养基中添加的糖主要是葡萄糖，添加量通常在5-25mM之间。
葡萄糖的主要代谢途径是通过糖酵解代谢成丙酮酸，进而降解成乳酸。
这最终会导致乳酸在培养基中积累。
代谢流研究分析发现，只有一小部分（约20-30%）的葡萄糖流向其它途径包括三羧酸循环和戊糖磷酸旁路。
除了葡萄糖，研究发现，动物细胞也能利用谷氨酰胺作为主要的能量物质。
谷氨酰胺的添加量常常高于其它氨基酸（2-4mM），也是很多细胞系生长需要的物质。
在大多数情况下，谷氨酰胺和葡萄糖会分别被快速利用，在耗尽之前，会引起细胞生长抑制。
2.氨基酸细胞不同，所需的特定营养也不同，同理，它们所需的必需氨基酸（动物体内不能自身合成）也是不同的。
一些非必需氨基酸通常也会加入到培养基中，这是因为有些细胞系自身不能产生相应的氨基酸，从而会限制细胞生长。
培养基中氨基酸限制会降低细胞生长速率和/或最高细胞密度。
其它非必需氨基酸细胞可以产生，但是不足以维持优生长。
一些氨基酸如谷氨酰胺在培养基中不稳定，因此需要单独加入以维持其在一个合适的浓度水平。
支链氨基酸被很多细胞包括MDCK细胞、人成纤维细胞、小鼠骨髓瘤细胞和BHK 细胞等消耗得特别快。
研究发现，当杂交瘤细胞利用谷氨酰胺利用率很低的时候，支链氨基酸被氧化的更多。
细胞适应无血清培养基的方法
细胞适应无血清培育基的方法目前，血清仍是动物细胞培育中最基本的的添加物，尤其是在原代培育或者细胞生长情形不良时，常常会先使用有血清的培育液进行培育，待细胞生长旺盛以后，再换成无血清培育液。
细胞转入无血清培育基培育要有一个适应过程，一般要渐渐降低血清浓度，从10%削减到5%，3%，1%，直至无血清培育。
在降低过程中要注意察看细胞形态是否发生变更，是否有部分细胞死亡，存活细胞是否还保持原有的功能和生物学特性等。
在试验后这些细胞一般不再连续保管，很少有细胞能够长期培育于无血清培育基而不发生更改的。
细胞转入无血清培育之前，要留有种子细胞，种子细胞按常规培育于含血清的培育基中，以保证细胞的特性不发生变更。
为了使细胞适应无血清培育，关键的是使所培育细胞：1.处于对数生长中期2.90%活细胞率3.适应时以较高的起始细胞接种细胞适应无血清培育基的方法：1. 直接适应细胞从添加血清的培育基转换到无血清培育基（SFM）中。
一些类型细胞可直接从包含血清的培育基适应无血清培育基。
对于直接适应，接种细胞密度应当:2.5105～3.5105细胞/ml。
当细胞密度实现1106～3106细胞/ml时，传代培育细胞。
当细胞密度在培育4到7天后实现2106～4106细胞/ml时，细胞wan全适应了无血清培育基。
每隔3～5天，当细胞密度实现1106～3106细胞/ml，细胞活率在90％时，储备的适应了无血清培育基的细胞培育物应当再次传代培育。
2. 连续适应分好几步把细胞从添加血清的培育基转换到无血清培育基（SFM）中，与直接适应相比较，连续适应趋向对于细胞更加不冷不热一些。
（1）、以2倍正常接种密度接种生长活跃的细胞培育物到75%有血清培育基：25％SFM混合培育基中，传代培育。
（2）、当细胞密度5105细胞/ml时，以2105到3105细胞/ml细胞密度，在有血清培育基：SFM为50∶50的混合培育基中传代培育。
（3）、以2106到3106细胞/ml细胞密度，25％有血清培育基和75%SFM中传代培育。
无血清培养基
无血清培养基(serum free medium,SFM):是不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基。
但是它们可能包含个别蛋白或大量蛋白组分。
虽然基础培养基加少量血清所配制的完全培养基可以满足大部分细胞培养的要求，但对有些实验却不适合，如观察一种生长因子对某种细胞的作用，这时需要排除其他生长因子的干扰作用。
而血清中可能含有各种生长因子；又如需要测定某种细胞在培养过程中分泌某种物质（抗体、生长因子）的能力；或者要大规模的培养某种细胞，以获得它们的分泌产物。
因此研制出无血清培养基一直是生物科学工作者努力的目标。
上海恒利安生物科技有限公司已成功开发了商业化的多种无血清培养基，可满足众多厂商的需求。
一、无血清培养基的基本配方:基本成分为基础培养基及添加组分两大部分。
用于生物制药和疫苗生产的细胞在体外培养时，多数呈贴壁生长或兼性贴壁生长；而当其在无血清、无蛋白培养基中生长时，由于缺乏血清中的各种粘附贴壁因子如纤粘连蛋白、层粘连蛋白、胶原、玻表粘连蛋白，细胞往往以悬浮形式生长。
添加组分包括以下几大类物质：(1）促贴壁物质：许多细胞必须贴壁才能生长，这种情况下无血清培养基中一定要添加促贴壁和扩展因子，一般为细胞外基质，如纤连蛋白、层粘连蛋白等。
它们还是重要的分裂素以及维持正常细胞功能的分化因子，对许多细胞的繁殖和分化，起着重要作用。
纤连蛋白主要促进来自中胚层细胞的贴壁与分化，这些细胞包括成纤维细胞、肉瘤细胞、粒细胞、肾上皮细胞、肾上腺皮质细胞、CHO细胞、成肌细胞等。
(2）促生长因子及激素：针对不同细胞添加不同的生长因子。
激素也是刺激细胞生长、维持细胞功能的重要物质，有些激素是许多细胞必不可少的，如胰岛素。
(3）酶抑制剂：培养贴壁生长的细胞，需要用胰酶消化传代，在无血清培养基中必不可少须含酶抑制剂，以终止酶的消化作用，达到保护细胞的目的。
最常用的是大豆胰酶；抑制剂。
(4）结合蛋白和转运蛋白：常见如转铁蛋白和牛血清白蛋白。
植物源无血清培养基的研究进展
科技视界SCIENCE & TECHNOLOGY VISION0 引言与传统的培养基相比，无血清培养基不含动物血清或其他生物提取物，能支持细胞在体外长时间生长和繁殖，是继天然培养基和合成培养基之后的第三类培养基。
目前商业化的无血清细胞培养基有明显的特征区别，通常可分为4种类型：无血清培养基（Serum -free medium ，SFM ）、 无动物源培养基（Animal -component -free medium ，ACFM ）、无蛋白培养基（Protein -free medium ，PFM ）、化学成分限定培养基（Chemically defined medium ，CDM ）。
无血清培养基中没有添加血清，但会添加一些额外的成分来维持细胞的生长，因此，无血清培养基通常是由基础培养基和合适比例的激素、生长因子、贴壁因子和结合蛋白等添加因子组成。
在过去的几十年里，血清已经被各种成分所取代，如重组表皮生长因子（Epidermal growthfactor ，EGF ）、胰岛素、转铁蛋白、皮质醇，最常见的是牛垂体提取物（Bovine pituitary extract ，BPE ）用于培养贴壁角质形成细胞。
在基础培养基中添加血清的主要目的是提供促细胞生长成分，作为营养物质、激素、生长因子以及蛋白酶抑制剂，同时血清能够使细胞贴壁以及平铺在细胞瓶中，提供特殊的保护机制来避免细胞的机械损伤和剪切力，还可以抑制有毒部分对细胞的冲击，提高培养基的缓冲能力[1-3]。
血清中含有可以转运脂类、脂肪酸、激素和微量元素（尤其是铁元素）的白蛋白和转铁蛋白。
但是随着欧洲许多国家爆发疯牛病（Bovine spongiform encephalopathy ，BSE ），血清的应用受到越来越多的质疑。
由于批量使用的动物血清来源于自然生物体（主要是新生牛），它本身携带和采集、加工过程有污染外源微生物和致病因子的可能，因此，使用新生牛血清存在作者简介：张凯茵，南京财经大学本科生，主要研究方向为粮油副产品生物转化技术。
动物细胞无血清培养基团体标准
动物细胞无血清培养基团体标准
《动物细胞无血清培养基团体标准》
一、定义
动物细胞无血清培养基团体标准是指经过医药品监督管理局批准，由生物制药企业研发生产的，满足过敏原性和病原性安全要求，具备良好的培养细胞生长效果，符合国家监督管理部门要求的，用于动物细胞培养的无血清培养基产品集合。
二、统一标准
1、细胞壳物质：
需要满足AHG良好质量控制，无害性，无病原体残留，包装完整和干燥。
2、培养基中的营养物质：
必须具有良好的可溶性，符合规定的营养成分，并具有良好的生长效果。
3、无血清培养基的质量：
材料按照标准要求，经质量检测符合国家监督管理部门的要求，使用安全可靠。
4、培养基的操作性能：
必须符合国家监督管理部门的要求，具有良好的操作性能，操作简便，满足细胞生长的需要，保证实验数据的准确性。
5、多元化配方：
根据实验要求，将培养基以多元、多样的配方提供，根据细胞
个体的特性，提供相应的配方，满足细胞的培养需求。
三、使用规范
1、根据用途选择正确的培养基：
根据实验要求，选择合适的培养基，满足实验需要，有效防止实验失败。
2、遵循正确的操作方式：
按照培养基的使用说明正确操作，以防出现不可预料的意外。
3、注意保存培养基：
将培养基储存在室温下，避免阳光直射，注意防止污染。
4、正确处理培养基：
使用完的培养基应及时处理，以免造成环境污染。
动物细胞无血清培养基的优势、特点与实验研究
动物细胞无血清培养基的优势、特点与实验研究摘要：动物细胞无血清培养基相比天然培养基、合成培养基等传统培养基有无可比拟的优势，其组成成分相对清楚，制备过程简单，日益得到生物技术界的重视。
运用统计学实验方法，可科学有效地考察细胞培养基中多因素、多水平间的交互作用。
应用新型蛋白质组分分析技术及生物芯片技术定位胞浆信号通路相关蛋白、膜表面的生长因子受体、激素受体、细胞因子受体、粘附分子等，用以确定细胞培养基中调控分子的添加组合。
对无血清培养基的优势特点及常用的实验研究进行概述。
以期为动物细胞无血清培养基的研究与研制提供参考。
关键词：动物细胞；无血清培养基；实验设计动物细胞培养技术是当今生物工程领域中的前沿研究课题之一，无论是在基础研究还是生产实践方面都得到生物技术界的重视。
随着哺乳动物细胞培养规模的扩大和生物药物需求的增长，基于细胞及产品特性的无血清培养基的研制已成为细胞工程领域的重要课题。
无血清细胞培养技术的研究日益得到人们的重视。
近年来，有关无血清培养基的研制和开发得到了迅速发展，推动了基因工程产品及产业的发展。
1 无血清培养基的优势特点及分类细胞培养基是细胞体外培养的最重要因素。
无血清培养基是继天然培养基、合成培养基之后的第三类培养基。
与传统的培养基相比，无血清培养基是一种不含有动物血清或其他生物提取液，但仍可以维持细胞在体外较长时间生长、繁殖的一种培养基。
无血清培养基由于其组成成分相对清楚，制备过程简单，在现代生物技术学领域得到广泛应用。
无血清培养技术也是阐明细胞生长、增殖、分化及基因表达调控的基础研究问题的有力工具。
常规细胞培养基的制备方法是在基础培养基中添加相应量的血清或组织提取物，其中最常用于培养基的血清是一种组分很不明确的混合物。
所以常规血清细胞培养基存在以下缺点：（1）血清来自于动物体，其对细胞在体外培养时的主要作用是提供生长因子、激素、结合蛋白，并提供保护作用，但同时也有细胞生长抑制因子和毒性因子，所以存在潜在毒性。
一种无血清细胞培养基制备方法
一种无血清细胞培养基制备方法
无血清细胞培养基制备方法
无血清细胞培养基是一种新兴的培养基类型，相较于传统的含血清培养基，无血清细胞培养基具有更好的稳定性和适应性。
本文介绍一种简易的无血清细胞培养基制备方法。
材料准备：
1. 高糖DMEM培养基
2. Pen/Strep 抗生素
3. L-谷氨酸
4. 精胺
5. 尿素
6. FBS-游离的胎牛血清
步骤：
1. 取一烧杯，将200 mL高糖DMEM培养基倒入其中。
2. 向培养基中加入100 μg/mL的Pen/Strep 抗生素，混匀。
3. 加入L-谷氨酸至最终浓度为 4 mM，混匀。
4. 加入精胺至最终浓度为 0.8 mM，混匀。
5. 加入尿素至最终浓度为 0.4 mM，混匀。
6. 加入2 mL FBS-游离的胎牛血清，混匀。
7. 倒入含有过滤器的瓶中，高温高压灭菌后即可使用。
值得注意的是，该培养基不宜长时间存储，需每周更换一次。
通过以上步骤，即可制备一种简易的无血清细胞培养基。
该培养基适用于多种常见细胞系的培养，具有较好的生长效果和细胞活力。
同时，由于不含血清成分，可以避免因批次不同导致的影响，保证实验的重复性和可靠性，具有一定的应用前景。
无血清培养基介绍
无血清培养基介绍无血清培养基是一种无需添加动物血清的培养基，适用于细胞的体外培养。
相较于传统的含有动物血清的培养基，无血清培养基具有许多优势，如避免了潜在的传染病传播风险、提高了细胞培养的一致性和可重复性，同时也降低了培养的成本。
本文将介绍无血清培养基的成分、制备方法以及应用领域等方面的内容。
无血清培养基的基本成分包括碳源、氮源、微量元素、维生素、生长因子、胶原蛋白和附加物等。
碳源常用的有葡萄糖、果糖等，氮源常用的有谷氨酸、天冬酰胺等。
微量元素是重要的细胞营养物质，包括铁、锌、铜、锰等，其浓度一般较低。
维生素在细胞的代谢过程中起到重要的辅酶和辅因子的作用，为细胞的正常生长提供必需物质。
生长因子是一类具有特定生物活性的蛋白质，能够直接影响细胞的增殖和分化。
胶原蛋白是一种结构性蛋白质，可以提供细胞粘附的基质支持。
其他附加物如氨基酸、核酸、脂质等也可以根据具体需要添加到培养基中。
无血清培养基的制备过程主要包括消毒、配制、滤过、灭菌等步骤。
消毒包括培养器皿、玻璃棒、试剂瓶等的高压蒸汽灭菌，确保杂菌的清除。
配制过程中需要将不同成分按照一定比例配制成培养基液。
滤过是为了除去微生物和大分子物质，常用的有0.22μm的滤膜过滤。
灭菌是一种无菌操作，可以使用高压蒸汽灭菌器或者紫外线灭菌器，确保培养基的无菌性。
无血清培养基在许多领域具有广泛的应用。
在生物医学研究领域，无血清培养基可以用于细胞培养、细胞扩增和细胞实验等。
细胞培养是生物医学研究中非常重要的实验手段，可以用于研究细胞的生理和病理功能，评估药物的毒性和疗效等。
在生物制药领域，无血清培养基可以用于生产重组蛋白、疫苗和细胞疗法等。
传统的生物制药方法中，常使用含有动物血清的培养基，但是这种方法存在一些问题，如潜在的传染病传播风险、批次差异大等。
无血清培养基不仅可以提高生产一致性和控制性，还可以降低成本和生产风险。
总结来说，无血清培养基是一种无需添加动物血清的培养基，具有许多优势，如避免了传染病传播风险、提高了培养一致性和可重复性，降低了培养的成本。
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无血清培养
无血清培养基(serum free medium,SFM):是不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基。
但是它们可能包含个别蛋白或大量蛋白组分。
虽然基础培养基加少量血清所配制的完全培养基可以满足大部分细胞培养的要求，但对有些实验却不适合，如观察一种生长因子对某种细胞的作用，这时需要排除其他生长因子的干扰作用。
而血清中可能含有各种生长因子；又如需要测定某种细胞在培养过程中分泌某种物质（抗体、生长因子）的能力；或者要大规模的培养某种细胞，以获得它们的分泌产物。
无血清培养基的基本配方:基本成分为基础培养基及添加组分两大部分。
用于生物制药和疫苗生产的细胞在体外培养时，多数呈贴壁生长或兼性贴壁生长；而当其在无血清、无蛋白培养基中生长时，由于缺乏血清中的各种粘附贴壁因子如纤粘连蛋白、层粘连蛋白、胶原、玻表粘连蛋白，细胞往往以悬浮形式生长。
添加组分
1. 促贴壁物质：许多细胞必须贴壁才能生长，这种情况下无血清培养基中一定要添加促贴壁和扩展因子，一般为细胞外基质，如纤连蛋白、层粘连蛋白等。
它们还是重要的分裂素以及维持正常细胞功能的分化因子，对许多细胞的繁殖和分化，起着重要作用。
纤连蛋白主要促进来自中胚层细胞的贴壁与分化，这些细胞包括成纤维细胞、肉瘤细胞、粒细胞、肾上皮细胞、肾上腺皮质细胞、CHO细胞、成肌细胞等。
2. 促生长因子及激素：针对不同细胞添加不同的生长因子。
激素也是刺激细胞生长、维持细胞功能的重要物质，有些激素是许多细胞必不可少的，如胰岛素。
3. 酶抑制剂：培养贴壁生长的细胞，需要用胰酶消化传代，在无血清培养基中必不可少须含酶抑制剂，以终止酶的消化作用，达到保护细胞的目的。
最常用的是大豆胰酶；抑制剂。
4. 结合蛋白和转运蛋白：常见如转铁蛋白和牛血清白蛋白。
牛血清白蛋白的添加比较大，可增加培养基的粘度，保护细胞免受机械损伤。
许多旋转式培养的无血清培养基都含有牛血清白蛋白。
5. 微量元素：硒是最常见的。
使用方法
目前，血清仍是动物细胞培养中最基本的的添加物，尤其是在原代培养或者细胞生长状况不良时，常常会先使用有血清的培养液进行培养，待细胞生长旺盛以后，再换成无血清培养液。
细胞转入无血清培养基培养要有一个适应过程，一般要逐步降低血清浓度，从10%减少到5%，3%，1%，直至无血清培养。
在降低过程中要注意观察细胞形态是否发生变化，是否有部分细胞死亡，存活细胞是否还保持原有的功能和生物学特性等。
在实验后这些细胞一般不再继续保留，很少有细胞能够长期培养于无血清培养基而不发生改变的。
细胞转入无血清培养之前，要留有种子细胞，种子细胞按常规培养于含血清的培养基中，以保证细胞的特性不发生变化。
为了使细胞适应无血清培养，关键的是使所培养细胞：
1. 处于对数生长中期
2. >90% 活细胞率
3. 适应时以较高的起始细胞接种
细胞适应无血清培养基的方法
1. 直接适应——细胞从添加血清的培养基转换到无血清培养基（SFM）中。
一些类型细胞可直接从包含血清的培养基适应无血清培养基。
对于直接适应，接种细胞密度应该:2.5×105~3.5×105细胞/ml。
当细胞密度达到1×106~3×106细胞/ml时，传代培养细胞。
当细胞密度在培养4到7天后达到2×106~4×106细胞/ml时，细胞完全适应了无血清培养基。
每隔3~5天，当细胞密度达到1×106~3×106细胞/ml，细胞活率在90％时，贮备的适应了无血清培养基的细胞培养物应该再次传代培养。
2. 连续适应——分好几步把细胞从添加血清的培养基转换到无血清培养基（SFM）中，与直接适应相比较，连续适应趋向对于细胞更加温和一些。
（1）以2倍正常接种密度接种生长活跃的细胞培养物到75%有血清培养基：25％SFM 混合培养基中，传代培养。
（2）当细胞密度>5×105细胞/ml时，以2×105到3×105细胞/ml细胞密度，在有血清培养基：SFM为50∶50的混合培养基中传代培养。
（3）以2×106到3×106细胞/ml细胞密度，25％有血清培养基和75% SFM中传代培养。
（4）当细胞密度达到1×106到3×106细胞/ml（接种后4到6天），在100％SFM培养基中传代培养。
（5）每隔3到5天，当细胞密度达到1×106到3×106细胞/ml，细胞活率在90％时，贮备的适应了无血清培养基的细胞培养物应该再次传代培养。
建议备份前一次混合培养的培养物，直到每一次细胞适应了新的混合培养基。
每一次减少血清前，可能需要在SFM/有血清混合培养基中进行几次传代。
在适应过程中，最好不要让细胞生长过度。
这将增加选择亚群的可能性。
需要注意，与有血清培养基相比，大部分SFM包含非常少的蛋白质，因而更易于受外界因素的影响。
细胞培养适应替代血清：许多细胞利用连续适应方法能很好的适应，用包含FBS的的培养基和包含有替代血清的培养基1∶1（v∶v）的混合培养基培养细胞。
通过下列的混合培养基的方式，连续几代减少当前培养基的量：1∶2，1∶4，1∶16和100％替代培养基。
每次适应改变血清比例时，传代细胞2到3次。
培养可以直接从FBS转换到替代血清。
一开始就使用相同于FBS的浓度的替代物或血清，生长的延迟可能会发生，4允许进行2到3次的传代，使生长率恢复到以前的水平。
特别需要强调的是：配制无血清培养液必须使用高质量的水，如石英玻璃蒸馏器经三次蒸馏或超纯水净化装置制备的水。
因为无血清培养基缺乏了血清中天然成分中和毒素、保护细胞的大分子，既便水中的有毒物质含量甚微，也可能对细胞产生致死性损害。
这是无血清培养能否成功的关键因素之一。
无血清培养基的优点：
1. 可避免血清批次间的质量变动，提高细胞培养和实验结果的重复性。
2. 避免血清对细胞的毒性作用和血清源性污染。
3. 避免血清组分对实验研究的影响。
4. 有利于体外培养细胞的分化。
5. 可提高产品的表达水平并使细胞产品易于纯化。
无血清培养基的缺点：
1. 细胞在无血清培养基中易受某些机械因素和化学因素的影响，培养基的保存和应用不如传统的合成培养基方便。
2. 成本较高。
3. 针对性很强，一种无血清培养基仅适合某一类细胞的培养。
无血清培养基一些配方
1. 神经细胞，干细胞，PC12细胞
成份终浓度
葡萄糖－－0.6%
谷氨酰胺－2mM
NaHCO3－－3mM
Hepes －－5mM
胰岛素－－2.5μg/ml
转铁蛋白－100ng/ml
孕酮－－20nM
丁二胺－－60μM
硒酸钠－－30nM
青霉素－－50mg/ml
链霉素－－50mg/ml
最后用DF12添加到100ml即可
2. 各类小鼠胚胎癌细胞系培养基
DMEM/F12 1:1混合成1000ml
NaHCO3 2.4g
HEPES(1.5M) 10.0ul
硒酸（5*10-6M) 10.0ug
纤粘连蛋白 1ug/cm2(37度作用15－30分钟）胰岛素 1000.0ug
转铁蛋白 5000.0ug
3. NIH3T3小鼠成纤维细胞培养基
DMEM/F12 1:1混合成1000ml
HEPES 15mM
大豆胰酶抑制剂 0.1％
胰岛素 10.0ug/ml
转铁蛋白 25.0ug/ml
纤粘连蛋白 5.0ug/ml
4. 杂交瘤细胞培养基
DMEM/F12 1:1混合成1000ml
NaHCO3 1.2g/L
HEPES 15mM
胰岛素 5.0ug/ml
氨基乙醇 20.0uM
硒酸 2.5mM
转铁蛋白 35.5ug/ml。