高效液相色谱法的分离实验

高效液相色谱法的分离实验

一、实验目的

1、了解高效液相色谱仪的结构。

2、掌握高效液相色谱仪的基本操作方法和主要实验条件的选择。

3、掌握液相色谱定性定量分析技术。

二、实验原理

在互不相溶的两相——流动相和固定相的体系中，当两相作相对运动时，第三组分（即溶质或吸附质）连续不断地在两相之间进行分配，这种分配过程即为色谱过程。由于流动相、固定相以及溶质混合物性质的不同，在色谱过程中溶质混合物中的各组分表现出不同的色谱行为，从而使各组分彼此相互分离，这就是色谱分析法的实质。

液相色谱由泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成，试剂瓶中的流动相被泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动，经过反复多次的吸附—解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪。

三、仪器和试剂

ThermoFisher Ultimate 3000高效液相色谱仪、紫外检测器、C18柱。

10~100μL移液枪，100mL容量瓶，10mL移液管，2.5mL一次性注射器，针头过滤器，100μL微量进样器。

甲醇（色谱纯）、超纯水、苯（分析纯）、甲苯（分析纯）。

四、实验步骤

1、试样的配制。

配制试样溶液，苯和甲苯溶于色谱纯甲醇中，浓度为10μL/L。（写清楚配制方法）

2、开机。

写清楚开机顺序。

3、选择实验条件。

流动相比例，流速，进样量，柱温，紫外检测器波长。

4、操作方法。

过滤、洗针、进样、流出曲线。

五、数据处理

1、色谱流出曲线图。

标出保留时间，各峰对应的组分。

2、理论计算。

计算理论塔板数和分离度。

思考题

1、紫外光度检测器是否适用于检测所有的有机化合物，为什么？

2、流动相为什么要进行脱气操作？

3、进样前，试样溶液为什么要用针头过滤器过滤？