细胞活力的测定
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
阅读(103)评论(0)编辑删除
酸性
一、原理
T淋巴细胞质内含有酯酶，可以水解α-醋酸萘酯，产生α-萘酚，α-萘酚又可与重氮付品红偶联生成不溶性的偶氮付品红萘酚，在T淋巴细胞浆酯酶存在的部位生成不溶性的黑红色的颗粒沉淀，而B淋巴细胞无此反应。以资鉴别。
二、材料与试剂
1．固定液40%甲醛(可用2.5%戊二醛代替)
THP-1细胞的传代就比较简单了。可以有两种传代方法。如果镜下观察细胞状态很好，没有其它杂质即细胞裂解物之类的，就 可以采用直接传代法。传代前将细胞培养瓶直立一个半小时使细胞自然下沉。吸弃上层少量培养液约三分之一，将余下的培养液分成两瓶，再分别补加培养液即可。如果镜下观察觉得培养液中有杂质即可采用离心传代法。如果细胞数目较多可以低速离心约600转离心六分钟，细胞可以沉淀下来而且可以去除细胞碎片之类的杂 质。如果觉得细胞数目不多比较宝贵，那就提高转速可以1000转离心六分钟，这样细胞损失很少但可能也有些杂质会一起沉淀下来。离心后去除上清液，加入新 的培养液吹打浑匀即可分瓶传代了。
3．染色液
（1）副品红液：取2g副品红加入2N HCl 100ml,温水浴溶解后保存于4℃备用。
（2）亚硝酸钠溶液（现用现配）：取0.14g亚硝酸钠加入双蒸馏水10 ml，振荡溶解。
（3）α-醋酸萘酯溶液：取2gα-醋酸萘酯溶于乙二醇单甲醚（可用丙酮代替）100ml中，贮于棕色瓶内，于4℃保存。
（4）0.067 Mol/L pH7.6PB液
\聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度梯度离心法分离外周血单个核细胞【试剂及配制】（1）聚蔗糖-泛影葡胺分层液：有成品供应，比重为1.077±0.0001。（2）台盼蓝染液：称取4g台盼蓝，于研钵中用少量双蒸水研磨，加双蒸水至100ml，1500r/min离心15min，吸取上层液，即为4%水溶液。用前，用1.8%氯化钠溶液稀释1倍，即为2%台盼蓝染液。（3）HBSS或RPMI-1640液【操作方法】（1）采集静脉血若干ml(随需要而定),注入盛有肝素的无菌小瓶中(每1ml全血用0.1ml 125～250U/ml肝素溶液抗凝),加盖后立即轻轻摇匀,使血液抗凝；（2）用吸管加入等体积的室温HBSS或PBS,使血液等倍稀释,可降低红细胞的凝聚,提高分离效果（此步骤亦可省去）；（3）吸取淋巴细胞分层液(每10ml稀释血加5ml分层液)置于15ml或50ml离心管中,然后将离心管倾斜45°角,将稀释血液在距分层液界面上1cm处沿试管壁缓慢加至分层液上面(亦可将吸管嘴插入离心管底部,将分层液缓慢加在稀释血液的下面),应注意保持两者界面清晰,勿使血液混入分层液内；（4）将离心管置水平式离心机内,在18℃～20℃下,以2，000r/min离心20min。离心后,管内可分为以下四层:上层为血浆、血液稀释液及绝大部分血小板；下层为红细胞及粒细胞；中层为细胞分层液；分层液与血浆交界部位混浊的灰白色层即为单个核细胞层。见图1。Ficoll-Hypaque离心法分离血液成分（5）用毛细吸管轻轻插入灰白色层,沿管壁轻轻吸出灰白色的单个核细胞,盛入另一支离心管中;或先吸去上层的血浆、稀释液及血小板,再用另一支毛细吸管仔细吸取单个核细胞。既要尽量吸取所有单个核细胞,又要避免吸取过多的分层液或血浆,以免混入其他细胞成分；（6）将所得到的PBMC悬液用5倍体积的HBSS或RPMI-1640洗涤2次,依次以2，000r/min、1500r/min在室温下(18～25℃)离心10min,可去掉大部分混杂的血小板；（7）用完全RPMI-1640定容细胞,计数细胞后再调整细胞所需浓度。一般每ml健康成人血可分离出1×106～2×106个单个核细胞；（8）用台盼蓝染液检查所分离的细胞活性:取2滴细胞悬液加1滴2％台盼蓝染液,5～10min后取样作湿片高倍镜检。活细胞不着色,死细胞染成蓝色。计数200个细胞,计算活细胞百分率,一般活性应在95％以上。【注意事项】（1）与血液样品接触时应注意生物安全防护,避免血源性传染病。（2）操作应轻柔,细胞悬液应充分混匀,避免损伤细胞活性及细胞丢失。（3）细胞分层液的密度是影响分离效果的关键之一,最适密度在室温下应为1.077±0.001g/L;应避光4℃下保存,取出后逐渐升至室温后混匀,方可使用;使用中应避免细菌污染。（4）稀释血液可降低红细胞的凝聚,提高淋巴细胞收获量,但如果要保留血浆成分作其它实验用时,则不能稀释血液,以免影响血浆成分。（5）离心时的温度对分离效果亦有影响,温度过低,离心时间需适当延长,淋巴细胞丢失增多;温度过高,增加红细胞凝聚,且影响淋巴细胞活性.离心时最适温度为18～20℃。（6）若从未抗凝血中分离单个核细胞,可先用链激酶溶解血凝块,然后再按上述方法分离。（7）分离组织中的单个核细胞亦可采用上述方法。
目前的方法就这些，希望对新手有所帮助[/indent]
THP-1 细胞是悬浮细胞，相对贴壁细胞要求高一点。细胞养不好，可能的原因有，THP-1细胞特别依赖细胞浓度，ATCC上10 5到106每ML，是一个很高的密度，细胞少了就不太容易养好。1、细胞株的来源很重要，如直接来源于ATCC（American Type Culture Collection 美国模式菌种保藏中心）生命力要强于国内细胞库的
高密度淋巴细胞分离液的配制及其应用
市售淋巴细胞分离液密度为1.077±0.002 g/m1,适于人外周血淋巴细胞的分离…。小鼠脾淋巴细胞的分离应使用密度为1.088 g/m1的淋巴细胞分离液。国外已有该分离液出售,但目前国内尚无供应。我们用聚蔗糖(Ficoll 400)和泛影葡胺(Hypaque)将市售淋巴细胞分离液的密度调至1.C89g/ml,用于小鼠脾淋巴细胞分离,取得了满意的效果。 材料和方法 淋巴细胞分离液(P=l,哪9 g/m1)的配制 量取40％Ficoll 400溶液(上海试剂二厂)72 m1,∞％泛影葡胺注射液(北京第三制药厂)25.3 ml,双蒸水72.7 ml,混匀后加入密度1.077g/m1的淋巴细胞分离液(上海试剂二厂)340 m1,再混匀。司P20℃用比重天平测其密度;用冰点渗透压计测定渗透压两次,取平均值。抽滤除菌后分装,每瓶6 ml,低温保存。 小鼠脾淋巴细胞的分离雄性BALB/e小鼠,16—20周龄,体重14—18 g,摘除眼球放...
2、注意细胞的密度一定要高，介于5×105—— 106/ML之间，增值的快。细胞数量太少，不适合THP-1生长，一般状态不好的THP-1在培养了3天后数量仍然不多，继续培养一天或者两天，培养基 严重泛黄，细胞数量会巨增。这一点不同于同是单核细胞系的U937细胞。3、THP-1细胞适合在细胞ph环境偏酸环境生长，对培养基变化非常敏感，所以 尽量使用相同ph的1640，4、还要注意，传代后切忌常移出培养箱观察，否则会影响细胞生长，状态变差，一般首先表现为细胞内颗粒变多。一般THP-1 生长相当快，对于状态已经不好的情况，建议传代后3～4天再观察，一般4天时间培养基已明显泛黄，细胞数量巨增。1)THP-1细胞喜欢酸性条件，你不要 老是换培养基。越酸的条件，细胞密度越大，细胞就长得越好。2） 不要频繁换液，一般2-3次换液离心一次（只是补充培养基）3） 使用1640（ATCC推荐），注意加碳酸氢钠2.5g就可以了，宁酸勿碱 4） 注意冻存的时候密度大些，推荐用血清冻存5）感觉Hyclone的血清比较好6）复苏比较慢，建议开始用小瓶，不要用一次性的
有人主张孵育液的pH值必须在.5.8～6.4
2．固定液可用2.5%戊二醛代替甲醛，据认为其效果更好，标本清晰，颗粒鲜明。固定方法为4℃固定10min，然后用蒸馏水冲洗，自然干燥。制片后迅速固定，以免细胞死亡破裂，酶外溢，造成假阴性。
几种动物的T淋巴细胞正常值
马57.8+2.009%
骡51.8+2.037%
小白鼠76.42+4.44%
豚鼠73.43+8.04%
兔77.0+2.79%
人62.3+源自文库.62%
五、注意事项
1．本试验对染色剂的pH值要求比较严格否则不易染上。染色时间在各动物也不一致，见表19-1。
表19-1人与几种动物酯酶染色的最适pH值与染色时间
2．分层液（聚蔗糖－泛影葡胺）比重1.077+0.001，配制见细胞分离技术一章。聚蔗糖—泛影葡胺液:聚蔗糖(polysucrose solution),商品名Ficoll,分子量400 000,多配制成40±1%(W/V)水溶液,也有干粉出售.应用时,用蒸馏水配制9%溶液.泛影葡胺溶液(Meglumini diatrizoici),商品名Vrografin,结构式为3,5—二乙酰氨基2,4,6三碘苯甲酸1—去氧—甲氨基山梨醇.含量为60%或75%,每安瓶为20ml装,常用于人的脏器造影.应用时,取60%泛影葡胺原液20ml,加双蒸馏水15.38ml,即为33.9%泛影葡胺. 1.077±0.001聚蔗糖—泛影葡胺的配制: 9%聚蔗糖液24份33.9%泛影葡胺液10份混合即可.必要时,可测比重.需要备用,可用G5漏斗过滤除菌或114.3℃高压灭菌15min,4℃保存.一般可保存3个月.如要配制不同比例的分层液,可按下列公式计算:式中dm为分层液的比重,d1和d2分别为9%聚蔗糖和33.9%泛影葡胺的比重,V1和V2分别为它们的体积.如需配制1.077比重的聚蔗糖—泛影葡胺的分层液,则9%的聚蔗糖和33.9%的泛影葡胺的比例应为100∶46.3.
甲液KH2PO49.08溶于1 000ml双蒸馏水
乙液KH2PO49.47g溶于1 000ml双蒸馏水
（6）甲基绿复染液：取1g甲基绿，溶于100ml双馏水中，4℃保存。
（7）应用染色液（孵育液）的配制取1ml亚硝酸钠溶液缓慢滴入1ml的付品红液中，边加边摇匀，付品红液由红色变为浅黄色，混合后，静置1min～2min，将此混合液倒入30ml pH7.6PB液中，充分混合后，再加入α-醋酸萘酯溶液0.85ml，边加边搅拌，混匀后使用。
由于我们实验室养细胞的时间也不是很长，所以也只能说说自己平时的操作了。
先说皮肤成纤维细胞。当细胞铺满瓶底，也就是细胞与细胞之间没有间隙时，就可以传代了。一般十天左右传一代。先吸弃旧培养液，用D-Hanks液洗两遍，再 加入0.25%的胰酶，加入的量以能覆盖瓶底为准。加入后轻轻摇晃培养瓶使液体覆盖瓶底，然后静置两分钟左右，最好是能在显微镜下观察，当细胞之间出现间 隙且有一部分细胞呈现圆形后即可。吸去胰酶，加入含血清培养液，摇晃瓶子使培养液覆盖瓶底就行了。因为血清可以终止胰酶的消化。然后吹打瓶底各处使细胞脱 落。再分瓶补加培养液。
http://www.dxy.cn/bbs/thread/36127#36127细胞污染的分析
http://www.chem17.com/st118460/Article_376526.html淋巴细胞完全培养液的成分
皮肤成纤维细胞和THP-1
[indent]细胞：皮肤成纤维细胞是贴壁生长的。THP-1细胞是悬浮的。
三、操作方法
1．标本的制备取肝素抗凝血1ml，加等量或适量的生理盐水稀释，取分层液2ml加入离心管内，然后将上述稀释的血液沿管壁缓缓加入至分层液上，注意不要打破两层界面。以水平转子离心机1 000～1 500r/min离心20min。结果形成四层，最上面第一层为血浆层，第二层为淋巴细胞（包括单核细胞）层，第三层为分层液，第四层为红血球。用毛细管吸取血浆层，然后吸取淋巴细胞放入适量的Hank’s液（或生理盐水）中，充分摇匀。2 000r/min离心5min～10min弃上清液，再重复洗涤一次，即获淋巴细胞。以此淋巴细胞粥涂片。自然干燥后，以40%甲醛蒸汽固定10min。
2．染色镜检
（1）于固定的标本片上滴加孵育液，以覆盖为度，37℃染45min～60min，蒸馏水冲洗。
（2）甲基氯复染1min～5min，蒸馏水冲洗。
（3）自然干燥，镜检。
四、结果判定
在胞浆内出现大小不一、数量不等的黑红色颗粒的细胞为T淋巴细胞，无此颗粒的为B淋巴细胞。同时计数淋巴细胞100～200个。求出它们各占的百分比。
酸性
一、原理
T淋巴细胞质内含有酯酶，可以水解α-醋酸萘酯，产生α-萘酚，α-萘酚又可与重氮付品红偶联生成不溶性的偶氮付品红萘酚，在T淋巴细胞浆酯酶存在的部位生成不溶性的黑红色的颗粒沉淀，而B淋巴细胞无此反应。以资鉴别。
二、材料与试剂
1．固定液40%甲醛(可用2.5%戊二醛代替)
THP-1细胞的传代就比较简单了。可以有两种传代方法。如果镜下观察细胞状态很好，没有其它杂质即细胞裂解物之类的，就 可以采用直接传代法。传代前将细胞培养瓶直立一个半小时使细胞自然下沉。吸弃上层少量培养液约三分之一，将余下的培养液分成两瓶，再分别补加培养液即可。如果镜下观察觉得培养液中有杂质即可采用离心传代法。如果细胞数目较多可以低速离心约600转离心六分钟，细胞可以沉淀下来而且可以去除细胞碎片之类的杂 质。如果觉得细胞数目不多比较宝贵，那就提高转速可以1000转离心六分钟，这样细胞损失很少但可能也有些杂质会一起沉淀下来。离心后去除上清液，加入新 的培养液吹打浑匀即可分瓶传代了。
3．染色液
（1）副品红液：取2g副品红加入2N HCl 100ml,温水浴溶解后保存于4℃备用。
（2）亚硝酸钠溶液（现用现配）：取0.14g亚硝酸钠加入双蒸馏水10 ml，振荡溶解。
（3）α-醋酸萘酯溶液：取2gα-醋酸萘酯溶于乙二醇单甲醚（可用丙酮代替）100ml中，贮于棕色瓶内，于4℃保存。
（4）0.067 Mol/L pH7.6PB液
\聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度梯度离心法分离外周血单个核细胞【试剂及配制】（1）聚蔗糖-泛影葡胺分层液：有成品供应，比重为1.077±0.0001。（2）台盼蓝染液：称取4g台盼蓝，于研钵中用少量双蒸水研磨，加双蒸水至100ml，1500r/min离心15min，吸取上层液，即为4%水溶液。用前，用1.8%氯化钠溶液稀释1倍，即为2%台盼蓝染液。（3）HBSS或RPMI-1640液【操作方法】（1）采集静脉血若干ml(随需要而定),注入盛有肝素的无菌小瓶中(每1ml全血用0.1ml 125～250U/ml肝素溶液抗凝),加盖后立即轻轻摇匀,使血液抗凝；（2）用吸管加入等体积的室温HBSS或PBS,使血液等倍稀释,可降低红细胞的凝聚,提高分离效果（此步骤亦可省去）；（3）吸取淋巴细胞分层液(每10ml稀释血加5ml分层液)置于15ml或50ml离心管中,然后将离心管倾斜45°角,将稀释血液在距分层液界面上1cm处沿试管壁缓慢加至分层液上面(亦可将吸管嘴插入离心管底部,将分层液缓慢加在稀释血液的下面),应注意保持两者界面清晰,勿使血液混入分层液内；（4）将离心管置水平式离心机内,在18℃～20℃下,以2，000r/min离心20min。离心后,管内可分为以下四层:上层为血浆、血液稀释液及绝大部分血小板；下层为红细胞及粒细胞；中层为细胞分层液；分层液与血浆交界部位混浊的灰白色层即为单个核细胞层。见图1。Ficoll-Hypaque离心法分离血液成分（5）用毛细吸管轻轻插入灰白色层,沿管壁轻轻吸出灰白色的单个核细胞,盛入另一支离心管中;或先吸去上层的血浆、稀释液及血小板,再用另一支毛细吸管仔细吸取单个核细胞。既要尽量吸取所有单个核细胞,又要避免吸取过多的分层液或血浆,以免混入其他细胞成分；（6）将所得到的PBMC悬液用5倍体积的HBSS或RPMI-1640洗涤2次,依次以2，000r/min、1500r/min在室温下(18～25℃)离心10min,可去掉大部分混杂的血小板；（7）用完全RPMI-1640定容细胞,计数细胞后再调整细胞所需浓度。一般每ml健康成人血可分离出1×106～2×106个单个核细胞；（8）用台盼蓝染液检查所分离的细胞活性:取2滴细胞悬液加1滴2％台盼蓝染液,5～10min后取样作湿片高倍镜检。活细胞不着色,死细胞染成蓝色。计数200个细胞,计算活细胞百分率,一般活性应在95％以上。【注意事项】（1）与血液样品接触时应注意生物安全防护,避免血源性传染病。（2）操作应轻柔,细胞悬液应充分混匀,避免损伤细胞活性及细胞丢失。（3）细胞分层液的密度是影响分离效果的关键之一,最适密度在室温下应为1.077±0.001g/L;应避光4℃下保存,取出后逐渐升至室温后混匀,方可使用;使用中应避免细菌污染。（4）稀释血液可降低红细胞的凝聚,提高淋巴细胞收获量,但如果要保留血浆成分作其它实验用时,则不能稀释血液,以免影响血浆成分。（5）离心时的温度对分离效果亦有影响,温度过低,离心时间需适当延长,淋巴细胞丢失增多;温度过高,增加红细胞凝聚,且影响淋巴细胞活性.离心时最适温度为18～20℃。（6）若从未抗凝血中分离单个核细胞,可先用链激酶溶解血凝块,然后再按上述方法分离。（7）分离组织中的单个核细胞亦可采用上述方法。
目前的方法就这些，希望对新手有所帮助[/indent]
THP-1 细胞是悬浮细胞，相对贴壁细胞要求高一点。细胞养不好，可能的原因有，THP-1细胞特别依赖细胞浓度，ATCC上10 5到106每ML，是一个很高的密度，细胞少了就不太容易养好。1、细胞株的来源很重要，如直接来源于ATCC（American Type Culture Collection 美国模式菌种保藏中心）生命力要强于国内细胞库的
高密度淋巴细胞分离液的配制及其应用
市售淋巴细胞分离液密度为1.077±0.002 g/m1,适于人外周血淋巴细胞的分离…。小鼠脾淋巴细胞的分离应使用密度为1.088 g/m1的淋巴细胞分离液。国外已有该分离液出售,但目前国内尚无供应。我们用聚蔗糖(Ficoll 400)和泛影葡胺(Hypaque)将市售淋巴细胞分离液的密度调至1.C89g/ml,用于小鼠脾淋巴细胞分离,取得了满意的效果。 材料和方法 淋巴细胞分离液(P=l,哪9 g/m1)的配制 量取40％Ficoll 400溶液(上海试剂二厂)72 m1,∞％泛影葡胺注射液(北京第三制药厂)25.3 ml,双蒸水72.7 ml,混匀后加入密度1.077g/m1的淋巴细胞分离液(上海试剂二厂)340 m1,再混匀。司P20℃用比重天平测其密度;用冰点渗透压计测定渗透压两次,取平均值。抽滤除菌后分装,每瓶6 ml,低温保存。 小鼠脾淋巴细胞的分离雄性BALB/e小鼠,16—20周龄,体重14—18 g,摘除眼球放...
2、注意细胞的密度一定要高，介于5×105—— 106/ML之间，增值的快。细胞数量太少，不适合THP-1生长，一般状态不好的THP-1在培养了3天后数量仍然不多，继续培养一天或者两天，培养基 严重泛黄，细胞数量会巨增。这一点不同于同是单核细胞系的U937细胞。3、THP-1细胞适合在细胞ph环境偏酸环境生长，对培养基变化非常敏感，所以 尽量使用相同ph的1640，4、还要注意，传代后切忌常移出培养箱观察，否则会影响细胞生长，状态变差，一般首先表现为细胞内颗粒变多。一般THP-1 生长相当快，对于状态已经不好的情况，建议传代后3～4天再观察，一般4天时间培养基已明显泛黄，细胞数量巨增。1)THP-1细胞喜欢酸性条件，你不要 老是换培养基。越酸的条件，细胞密度越大，细胞就长得越好。2） 不要频繁换液，一般2-3次换液离心一次（只是补充培养基）3） 使用1640（ATCC推荐），注意加碳酸氢钠2.5g就可以了，宁酸勿碱 4） 注意冻存的时候密度大些，推荐用血清冻存5）感觉Hyclone的血清比较好6）复苏比较慢，建议开始用小瓶，不要用一次性的
有人主张孵育液的pH值必须在.5.8～6.4
2．固定液可用2.5%戊二醛代替甲醛，据认为其效果更好，标本清晰，颗粒鲜明。固定方法为4℃固定10min，然后用蒸馏水冲洗，自然干燥。制片后迅速固定，以免细胞死亡破裂，酶外溢，造成假阴性。
几种动物的T淋巴细胞正常值
马57.8+2.009%
骡51.8+2.037%
小白鼠76.42+4.44%
豚鼠73.43+8.04%
兔77.0+2.79%
人62.3+源自文库.62%
五、注意事项
1．本试验对染色剂的pH值要求比较严格否则不易染上。染色时间在各动物也不一致，见表19-1。
表19-1人与几种动物酯酶染色的最适pH值与染色时间
2．分层液（聚蔗糖－泛影葡胺）比重1.077+0.001，配制见细胞分离技术一章。聚蔗糖—泛影葡胺液:聚蔗糖(polysucrose solution),商品名Ficoll,分子量400 000,多配制成40±1%(W/V)水溶液,也有干粉出售.应用时,用蒸馏水配制9%溶液.泛影葡胺溶液(Meglumini diatrizoici),商品名Vrografin,结构式为3,5—二乙酰氨基2,4,6三碘苯甲酸1—去氧—甲氨基山梨醇.含量为60%或75%,每安瓶为20ml装,常用于人的脏器造影.应用时,取60%泛影葡胺原液20ml,加双蒸馏水15.38ml,即为33.9%泛影葡胺. 1.077±0.001聚蔗糖—泛影葡胺的配制: 9%聚蔗糖液24份33.9%泛影葡胺液10份混合即可.必要时,可测比重.需要备用,可用G5漏斗过滤除菌或114.3℃高压灭菌15min,4℃保存.一般可保存3个月.如要配制不同比例的分层液,可按下列公式计算:式中dm为分层液的比重,d1和d2分别为9%聚蔗糖和33.9%泛影葡胺的比重,V1和V2分别为它们的体积.如需配制1.077比重的聚蔗糖—泛影葡胺的分层液,则9%的聚蔗糖和33.9%的泛影葡胺的比例应为100∶46.3.
甲液KH2PO49.08溶于1 000ml双蒸馏水
乙液KH2PO49.47g溶于1 000ml双蒸馏水
（6）甲基绿复染液：取1g甲基绿，溶于100ml双馏水中，4℃保存。
（7）应用染色液（孵育液）的配制取1ml亚硝酸钠溶液缓慢滴入1ml的付品红液中，边加边摇匀，付品红液由红色变为浅黄色，混合后，静置1min～2min，将此混合液倒入30ml pH7.6PB液中，充分混合后，再加入α-醋酸萘酯溶液0.85ml，边加边搅拌，混匀后使用。
由于我们实验室养细胞的时间也不是很长，所以也只能说说自己平时的操作了。
先说皮肤成纤维细胞。当细胞铺满瓶底，也就是细胞与细胞之间没有间隙时，就可以传代了。一般十天左右传一代。先吸弃旧培养液，用D-Hanks液洗两遍，再 加入0.25%的胰酶，加入的量以能覆盖瓶底为准。加入后轻轻摇晃培养瓶使液体覆盖瓶底，然后静置两分钟左右，最好是能在显微镜下观察，当细胞之间出现间 隙且有一部分细胞呈现圆形后即可。吸去胰酶，加入含血清培养液，摇晃瓶子使培养液覆盖瓶底就行了。因为血清可以终止胰酶的消化。然后吹打瓶底各处使细胞脱 落。再分瓶补加培养液。
http://www.dxy.cn/bbs/thread/36127#36127细胞污染的分析
http://www.chem17.com/st118460/Article_376526.html淋巴细胞完全培养液的成分
皮肤成纤维细胞和THP-1
[indent]细胞：皮肤成纤维细胞是贴壁生长的。THP-1细胞是悬浮的。
三、操作方法
1．标本的制备取肝素抗凝血1ml，加等量或适量的生理盐水稀释，取分层液2ml加入离心管内，然后将上述稀释的血液沿管壁缓缓加入至分层液上，注意不要打破两层界面。以水平转子离心机1 000～1 500r/min离心20min。结果形成四层，最上面第一层为血浆层，第二层为淋巴细胞（包括单核细胞）层，第三层为分层液，第四层为红血球。用毛细管吸取血浆层，然后吸取淋巴细胞放入适量的Hank’s液（或生理盐水）中，充分摇匀。2 000r/min离心5min～10min弃上清液，再重复洗涤一次，即获淋巴细胞。以此淋巴细胞粥涂片。自然干燥后，以40%甲醛蒸汽固定10min。
2．染色镜检
（1）于固定的标本片上滴加孵育液，以覆盖为度，37℃染45min～60min，蒸馏水冲洗。
（2）甲基氯复染1min～5min，蒸馏水冲洗。
（3）自然干燥，镜检。
四、结果判定
在胞浆内出现大小不一、数量不等的黑红色颗粒的细胞为T淋巴细胞，无此颗粒的为B淋巴细胞。同时计数淋巴细胞100～200个。求出它们各占的百分比。