实验七、GUS组织化学定位
实验五、GUS染色检测基因瞬时表达
问题解决能力
实验态度转变
在实验过程中遇到问题时，我学会了独立 思考和团队协作，积极寻找解决方案。
通过认真对待每一个细节，ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ培养了严谨 的实验态度和科学精神。
gus染色检测基因瞬时表达的未来发展方向
应用拓展
除了基础研究，gus染色检测基因瞬时表 达在医学诊断和治疗等领域也有广阔的应
用前景。
A 技术优化
01
02
03
研究基因功能
通过瞬时表达技术可以快 速检测特定基因的功能， 了解其在细胞中的作用。
药物筛选
利用瞬时表达技术筛选对 特定基因有调控作用的候 选药物。
基因治疗
瞬时表达技术可用于基因 治疗的研究，为疾病治疗 提供新思路。
02 实验原理
gus染色检测基因瞬时表达的生物学基础
基因瞬时表达
基因瞬时表达是指通过转录和翻译在 短时间内产生大量蛋白质的过程。在 植物和某些微生物中，瞬时表达常用 于研究基因的功能和表达调控。
学习gus染色检测基因瞬时表达的方法
准备实验材料
X-Gluc、缓冲液、DNA转染试 剂、细胞培养板等。
GUS染色
将转染后的细胞用X-Gluc染色 ，观察蓝色产物。
转染DNA
将目的DNA与转染试剂混合， 加入细胞培养板中，使DNA瞬 时表达。
结果分析
根据蓝色产物的多少判断GUS 基因的瞬时表达量。
掌握gus染色检测基因瞬时表达的应用
显色反应
在适宜的温度和pH条件下，GUS酶 催化底物水解，产生蓝色产物。
结果观察
通过观察蓝色产物的生成情况，判断 目的基因是否成功瞬时表达。
03 实验步骤
准备实验材料和试剂
准备所需的gus基因瞬时表 达载体。
拟南芥防御素基因PDF1.2启动子与GUS重组载体的构建与转化
拟南芥防御素基因PDF1.2启动子与GUS重组载体的构建与转化刘志霞;周舟;蔡薇;程姣;任春梅【摘要】PDF1.2基因在植物的防御系统中扮演着重要的角色,其编码产生的植物防御素参与了植物对真菌入侵、病毒感染、不良环境等逆境胁迫的防御反应.试验利用从拟南芥中通过PCR扩增和克隆的该基因启动子构建GUS报告基因的表达载体,通过根癌农杆菌浸渍转化法将表达报告基因转入拟南芥中,筛选获得了转化植株.获得以下主要结果:(1)成功克隆了拟南芥PDF1.2基因的启动子并将其与带GUS 标记基因的载体进行了融合,得到了重组的融合载体;(2)成功的将带GUS标记基因的拟南芥PDF1.2基因启动子融合载体转入到拟南芥植株中并利用其自带抗性标记筛选到了抗性植株;(3)利用GUS染色技术检测了转基因植株中PDF1.2基因启动子的表达情况.%PDF1.2 gene plays an important role in plant defense systems,the plant defensins encoded by PDF1.2 gene participates in plant defensive response against to adversity stress such as fungal invasion,viral infection and adverse environment conditions.The promoter of PDF1.2 gene that amplified and cloned by PCR from Arabidopsis was used to construct the expression vector of GUS reporter gene in this experiment,then the expression reporter gene was transformed into Arabidopsis through agrobacterium tumefaciens transformation method and the transformed plants was obtained by screening.The main results were showed as follows:1.The promoter of Arabidopsis PDF1.2 gene was successfully cloned and fused with the vector carrying GUS report gene to obtain a recombinant fusion vector;2.The reconstructive vector wastransferred into Arabidopsis thaliana and the transgenic plants were screened successfully;3.The expression of the promoter of PDF1.2 gene in transgenic plants was detected by GUS staining.【期刊名称】《作物研究》【年(卷),期】2018(032)002【总页数】4页(P131-134)【关键词】载体构建;PDF1.2基因;克隆;转化【作者】刘志霞;周舟;蔡薇;程姣;任春梅【作者单位】湖南农业大学生物科学技术学院,长沙410128;湖南农业大学生物科学技术学院,长沙410128;湖南农业大学生物科学技术学院,长沙410128;湖南农业大学生物科学技术学院,长沙410128;湖南农业大学生物科学技术学院,长沙410128;作物基因工程湖南省重点实验室,长沙410128【正文语种】中文【中图分类】Q785PDF1.2基因是一个广泛存在于植物中与抗逆相关的基因［1～4］。
Gus染色试剂配制及使用方法
●产品简介：gus(β-glucuronidase，β-D- 葡萄糖苷酸酶)基因是目前常用的一种报告基因，其表达产物β-葡萄糖苷酸酶(GUS)是一种水解酶，能催化许多β-葡萄糖苷酯类物质的水解，它可以将5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸酯（X-gluc.htm' target=_blank>x-gluc）分解为蓝色的物质，其检测方法简单、快速、灵敏、稳定，且背景活性低。
因为绝大多数植物细胞内不存在内源的GUS活性，因此gus基因广泛用作转基因植物的报告基因，尤其是在研究外源基因瞬时表达的转化实验中广泛应用。
该试剂盒包含GUS染色的全部试剂，使用方便，只需将染色液和缓冲液按照比例混合即配成GUS染色液。
该试剂盒可以配制50ml GUS染色液。
●贮存和效期：X-gluc染色液-20℃保存；GUS染色缓冲液4℃贮存。
自开封之日起有效期一年。
●使用说明：一. GUS染色液配制：X-gluc染色液为50×浓缩液，使用前用GUS染色缓冲液稀释50倍即配成GUS染色液。
如0.1 ml X-gluc染色液加入到5 ml GUS染色缓冲液中，即配成5 ml GUS染色溶液。
该染色溶液最好现用现配，短期贮存可以-20℃保存2-3天。
二. GUS染色步骤：1.将准备好的材料浸泡在GUS染色液中，于25-37℃保温1小时至过夜。
2.叶片等绿色材料转入70%乙醇中脱色2-3次，至阴性对照材料呈白色。
3.肉眼或显微镜下观察，白色背景上的蓝色小点即为GUS表达位点。
注：用于染色的植物材料的制备方法要因涉及的特定组织和器官的不同而异。
例如，拟南芥的根、花和叶片以及烟草幼苗的根就可以不作任何预处理而直接染色。
但是像烟草和马铃薯这些植物的茎和叶就必须在染色前切成薄片（1-3mm）。
当操作大的组织和样品时，可以选用真空渗入法来帮助底物和酶渗入细胞。
GUS能与显色底物X-gluc 反应，显现蓝色，因而可以通过组织化学染色定性研究GUS的表达水平和表达模式。
gus染色原理
gus染色原理Gus染色原理。
Gus染色是一种常用的细胞染色技术，用于检测β-葡萄糖苷酶（β-glucuronidase）的活性。
β-葡萄糖苷酶是一种水解酶，能够水解含有葡萄糖醛酸酯的底物，产生游离的葡萄糖醛酸。
Gus染色的原理是利用β-葡萄糖苷酶水解底物后产生的蓝色产物，对细胞或组织进行染色，从而观察β-葡萄糖苷酶的活性和分布情况。
在进行Gus染色之前，首先需要准备Gus染色液和底物。
Gus染色液通常由染色缓冲液、染色底物和其它辅助试剂组成。
染色底物是一种含有葡萄糖醛酸酯的化合物，一般为5-溴-4-氯-3-吲哚基葡萄糖醛酸（X-gluc）。
X-gluc在β-葡萄糖苷酶的作用下会产生蓝色的沉淀物，用于显示β-葡萄糖苷酶的活性。
辅助试剂通常包括有机溶剂、金属离子螯合剂等，用于增强染色效果和稳定染色产物。
在实际操作中，将待检测的细胞或组织样品加入Gus染色液中进行染色处理。
在适当的温度和时间条件下，X-gluc会被β-葡萄糖苷酶水解，产生蓝色的沉淀物。
通过显微镜观察染色结果，可以直观地了解β-葡萄糖苷酶在样品中的活性和分布情况。
活性高的细胞或组织会呈现出深色的染色，而活性低的则呈现较浅的染色或无染色。
Gus染色技术在植物学、动物学和微生物学等领域得到了广泛的应用。
在植物学中，可以利用Gus染色观察植物各部位中β-葡萄糖苷酶的表达情况，从而研究植物的生长发育过程和应激响应机制。
在动物学中，Gus染色也可用于研究动物胚胎发育过程中的基因表达和细胞分化情况。
在微生物学中，Gus染色可以用于检测细菌和真菌中β-葡萄糖苷酶的活性，从而研究微生物的代谢特性和环境适应能力。
总之，Gus染色技术是一种简单、直观的细胞染色方法，能够有效地检测β-葡萄糖苷酶的活性和分布情况。
通过对样品进行Gus染色，可以为细胞生物学和生物化学研究提供重要的实验数据，促进对生物学问题的深入理解和探讨。
随着生物技术的不断发展，相信Gus染色技术在生命科学领域中会有更广泛的应用和深入的研究。
gus定量测定
2．GUS报导基因的定量检测GUS能与底物MUG（分子量352.3，4-甲基伞型酮-β-葡萄糖醛酸苷，4-methylumbelliferylβ-D-glucuronide）反应产生荧光物质MU（分子量198.2，4-甲基伞型酮，4-methylumbelliferone）。
MU的激发波长为365nm，发射波长为456，其含量可由荧光分光光度计测出。
因此，我们可以根据单位质量的植物总蛋白在单位时间内产生的荧光物质的多少来定量的检测GUS含量。
2.1试剂配制1)1mol/L Na2HPO4溶液：35.814g Na2HPO4溶于100ml水。
2)1mol/L NaH2PO4溶液：15.601g NaH2PO4溶于100ml水。
3)0.1M磷酸缓冲液(PH7.0)：1mol/L Na2HPO4取5.77ml，1mol/L NaH2PO4取4.23ml，定容至100ml。
4)10％SDS溶液：将90ml水稍微加热，加10g SDS，搅拌溶解，加入几滴浓盐酸调节PH至7.2，然后加水定容至100ml。
5)0.5 M EDTA (PH8.0)：在80ml水中加入18.61g Na2EDTA•2H2O，用NaOH调PH至8.0（约需2g左右的固体NaOH），溶解后定容至100ml。
6)GUS酶提取液：0.1M磷酸缓冲液（PH7.0）取50ml；10% SDS取1ml；0.5MEDTA(PH8.0)取2ml；Triton X-100取100ul；β-巯基乙醇100ul；用水定容至100ml。
7)MUG底物：称8.8mg MUG，溶于10ml GUS酶提取液中，配制成2mmol/L的工作浓度。
8)反应终止液（0.2 mol/L Na2CO3）：称2.12Na2CO3，用水定容到100ml。
9)考马斯亮蓝G250溶液：考马斯亮蓝G250 10mg, 95%乙醇5m1, H3PO410ml，定容至l00ml，过滤后4℃保存。
水稻Rubisco激酶基因叶绿体转运肽增强转基因表达
水稻Rubisco激酶基因叶绿体转运肽增强转基因表达李想;林智敏;陈在杰;王成虎;刘霞;王锋【摘要】将水稻RCA基因N端预测的转运肽(TP)序列融合报告基因GFP,构建瞬时表达载体pGD-RCATP-GFP,转化农杆菌后,注射侵染烟草叶片,通过荧光显微镜观察瞬时表达情况,结果表明外源蛋白GFP定位在叶绿体上,依此预测水稻RCA基因N端48 aa为叶绿体转运肽.将该序列与报告基因GUS融合,构建植物表达载体p1300-RCATP-AGS,转化水稻后,检测阳性株叶片的GUS酶活,其GUS蛋白表达效率是未连有叶绿体转运肽的转基因植物的4.2倍左右.%N -terminal sequence of the protein encoded by rice RCA gene was predicted to be a chloroplast transit peptide. The 144bp fragment of this gene was fused with GFP to construct a transient expression vector pGD-RCATP-GFP for genetic transformation. Transient transformation of tobacco was produced by the Agrobacterium - mediated infiltration method. Fluorescence microscopy analyses demonstrated that, in cells expressing the RCATP:: GFP fusion protein, the fluorescence was specifically targeted to chloroplast. Then this fragment was fused with GUS to construct a vector p1300-RCATP-AGS for genetic transformation. To analyze GUS activity for the leaves of the positive plants, we discovered that the RCA TP sequence increased GUS protein expression levels about 3 fold, when compared to without RCA TP sequence.【期刊名称】《福建农业学报》【年(卷),期】2013(028)002【总页数】6页(P95-100)【关键词】RCA(二磷酸核酮糖羧化酶激酶);叶绿体转运肽;GUS酶活分析【作者】李想;林智敏;陈在杰;王成虎;刘霞;王锋【作者单位】福建师范大学生命科学学院,福建福州 350000;福建省农业科学院生物技术研究所,福建福州 350003【正文语种】中文【中图分类】Q78;S511Rubisco（1，5-二磷酸核酮糖羧化酶／加氧酶）是光合作用植物叶片中含量最丰富的蛋白。
gus染色原理
gus染色原理Gus染色原理。
Gus染色是一种常用的生物学实验技术，主要用于检测β-葡萄糖苷酶（β-glucuronidase）的活性。
β-葡萄糖苷酶是一种水解酶，能够水解含有葡萄糖醛酸的底物。
在实验中，通过对含有β-葡萄糖苷酶的细胞或组织进行Gus染色，可以直观地观察到β-葡萄糖苷酶的活性分布情况，从而对生物学研究提供重要的信息。
Gus染色的原理主要包括底物、酶作用和染色三个步骤。
首先是选择合适的底物，通常使用5-溴-4-氯-3-吲哚基葡萄糖苷（X-Gluc）作为底物，它在β-葡萄糖苷酶的作用下会产生可染色的产物。
其次是酶作用，β-葡萄糖苷酶在底物的作用下水解产生的产物，这些产物会与染色剂发生化学反应，形成蓝色的沉淀物。
最后是染色，将样品浸泡在染色液中，待染色完成后观察样品的染色情况。
Gus染色的实验步骤相对简单，但在实验过程中仍需注意一些关键的技术细节。
首先是对样品的处理，样品的预处理对实验结果有着重要的影响。
其次是对底物和染色剂的选择，合适的底物和染色剂可以提高实验的准确性和可靠性。
最后是对实验条件的控制，包括温度、时间、pH值等因素的控制都会对实验结果产生影响。
Gus染色技术在生物学研究中有着广泛的应用，特别是在植物和微生物领域。
通过对植物组织进行Gus染色，可以观察到β-葡萄糖苷酶在不同组织和不同发育阶段的表达情况，从而研究植物的生长发育过程。
在微生物研究中，Gus染色也常用于检测转基因微生物中外源基因的表达情况，为基因功能研究提供重要的数据支持。
总的来说，Gus染色是一种简单而有效的生物学实验技术，通过对β-葡萄糖苷酶活性的检测，为生物学研究提供了重要的手段。
在实际应用中，我们需要充分理解其原理和操作技巧，才能更好地利用这一技术进行科学研究。
希望本文对Gus染色的原理有所帮助，谢谢阅读！。
胡萝卜的遗传转化及gus检测
5、外植体的脱菌及选择培养
• 脱菌培养 把共培养后的外植体转移到含有脱菌抗生素的培 养基上，以杀死或者抑制农杆菌的生长。 常用的抗生素有：羧苄青霉素，头孢霉素等。 • 选择培养 转化的细胞和未转化的细胞生长发育存在着竞争， 转化的细胞获得抗性。 常用的选择压力有：Km，Hyg，除草剂ppt等。
七、实验器材与试剂
• Gus检测方法
检测方法 底物 简称 分解产物 现象 5，5’-二溴-4， 化学染色 5-溴-4-氯-3-吲哚X-Gluc 蓝色沉淀 β-D葡萄糖苷酸酯 法 4-二氯靛蓝染料
荧光法
4-甲基伞形酮酰4-MUG 4-甲基伞形酮 455nm荧光 β-D葡萄糖醛酸苷
分光光度 对硝基苯基-β-D葡 PNPG 法 萄糖醛酸苷
三、实验步骤
• 将愈伤组织放入X-Gluc反应液中， 370C保温1~20 h； • 显微镜下或用肉眼观察。
四、思考题
•
gus基因用于检测的嵌合基因是否导入细胞的原
理及检测的方法？
• 器材
仪器设备：高压蒸汽灭菌锅、洁净工作台、循环水式真空泵、 电子天平、恒温培养摇床、离心机、光照培养箱等。 器具：搪瓷杯、三角瓶、试剂瓶、烧杯、培养皿、解剖刀、 长镊子、滤纸、pH试纸、标签纸、封口薄膜、牛皮纸、牛皮 筋、离心管、移液枪、细菌过滤器、0.22-0.45 um的虑膜等。
• 实验材料：胡萝卜的愈伤组织 • 细菌菌株：农杆菌菌株EHA105，表达载PCAMBIA1301。
对硝基苯酚
测415nm的 吸收值，呈 黄色
二、器材和药品
• • • • 仪器设备：恒温箱、超净工作台。 器具：1.5ml的离心管、镊子、解剖刀等。 材料：共培养三天的愈伤组织。 试剂及其配制 50mM 磷酸钠缓冲液（pH 7.0） 50mM 铁氰化钾 50mM 亚铁氰化钾
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报告基因GUS的表达的检测
➢ 材料：拟南芥AK12-pro ➢ 试剂：
GUS工作液：在450mlddH2O中加入82mg铁氰化钾，105.6mg亚 铁氰化钾，50ml 1mol/L磷酸钾缓冲液（pH7.0），加水至500ml， 4℃储存备用。1mol/LGUS染色液：用DMSO溶解100mg X-Gluc， 再加入GUS工作液，定容至100ml，分装成小管，置于-20℃储存备 用。
蓝白斑筛选的原理（ α-互补）
蓝白斑筛选的原理（ α-互补）
现在使用的许多载体都带有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列 和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（ MCS），它并不破坏读框；宿主细胞编码β-半乳糖苷酶C端部分序列。 这样，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶（ β-半乳糖苷酶）活性，但它 们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这种现象称为α-互补。
• 37度培养12-14h，会长出如上图所示的单 菌落（乳白色、浑圆、饱满、菌落高度明 显突出培养基表面）。
• 培养时间过长，比如超过16小时，在这些 单菌落周围会出现一小密集的像针尖一样 大小的菌落，称为卫星菌落。这说明，培 养的时间太长了。
卫星菌落
• 有些载体带有β-内酰胺酶的基因，表达出β-内酰胺酶，它 可以破坏氨卞青霉素。当细菌培养时间过长，β-内酰胺酶 积累过多，就会使周围的氨卞青霉素失效，导致不含质粒 的空菌落大量生长，这就是卫星菌落。
➢ 由于绝大多数植物没有检测到葡萄糖苷酸酶的背 景活性，因此这个基因被广泛应用于基因调控的 研究中（作为报告基因）。根据gus基因检测所用 的底物不同，可以选择三种检测方法：组织化学 法、分光光度法和荧光法（灵感度为分光光度检 测法最高），其中最为常用的是组织化学法。
• 组织化学法检测：以5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷 酸酯（X-Gluc）作为反应底物。将被检材料用含有 底物的缓冲液浸泡，若组织细胞被转入了GUS基 因，并表达出Gus，在适宜的条件下，该酶就可将 X-Gluc水解生成蓝色产物，这是由其初始产物经氧 化二聚作用于形成的靛蓝染料，它使具Gus活性的 部位或位点呈现蓝色，用肉眼或在显微镜下可看到 ，且在一定程度下根据染色深浅可反映出Gus活性 。因此利用该方法可观察到外源基因在特定器官、 组织，甚至单个细胞内的表达情况。
考核
成绩计算方法（百分制）： 期末考试: 40分，40%*100 （与分子生物学理论课一起考试，两份卷子;考试内
容包括平时操作和涉及实验的理论基础） 平时成绩: 60分，60%*100
➢ 组织化学染色检测 -- GUS染色 1. 取2支1.5ml离心管，各加入0.3ml 1mol/L GUS染色液； 2. 用镊子夹取 转基因和野生型拟南芥幼苗各1根，分别放入上述离心
管中； 3. 37℃浸泡过夜（5h）；（下午或晚上继续下面的脱色和照相步骤） 4. 倒掉染色液，加入75%乙醇脱色；30min后换一次75%乙醇脱色；
AK12- pro RB 35S-pro NPT П NOS-ter
GUS
NOS-ter LB
pBI101
花椰菜花叶病毒( CaM V)启动子 nopaline synthase(NOS)gene 终止子 胭脂碱合成酶
本实验基本流程
拟南芥AK12-pro 种子萌发，长成幼苗
取幼苗 组织化学检测 -- GUS检测
本实验材料中使用的转基因载体的部分图谱
克隆拟南芥中的AK12基因的启动子，插入到 PBI101载体GUS基因上游的克隆位点（具体图 示如下）
农杆菌转化
转化拟南芥
AK12- pro RB 35S-pro NPT П NOS-ter
GUS
NOS-te酸转移酶II(nptⅡ )基因（卡那霉素抗性）
肉眼下观察染色情况；拍照。如果有GUS基因表达产物，则出现蓝 色。
实验报告
转基因作物的检测
新霉素磷酸转移酶II(nptⅡ )基因（卡那霉素抗性）
AK12- pro RB 35S-pro NPT П NOS-ter
GUS
NOS-ter LB
pBI101
花椰菜花叶病毒( CaM V)启动子 nopaline synthase(NOS)gene 终止子 胭脂碱合成酶
完成实验报告
• 以分析失败的可能原因为主！
实验七、转基因植物中报告基因 GUS组织化学定位检测
如何检测基因的组织特异性表达？
• 基因的组织特异性表达主要是由该基因特异 性启动子决定的。即，某些启动子有组织特 异性，它会启动该基因的特异性表达。
• 启动子没有基因特异性，它会启动任何下 游基因的表达。
完成实验报告
第2周：移液器的使用及聚合酶链式反应（PCR) （实验报告1） 第3周:质粒DNA的提取（实验报告2） 第4周: PCR产物与质粒DNA的检测 第5周: 质粒DNA的酶切及凝胶电泳检测（实验报告3） 第6周：质粒DNA的连接及凝胶电泳检测（实验报告4） 第7周：大肠杆菌感受态细胞的制备与转化（实验报告5） 第8周：GUS组织化学定位（实验报告6）
• 只要知道启动子在什么部位表达，就可以推 测出该启动子所启动的基因的表达部位。
• 启动子的表达如何才能肉眼可见呢？——连 接报告基因（GUS,分解底物呈蓝色）。
• 基因的组织特异性表达
原理
➢ GUS基因就是转β-葡糖醛酸酶基因 ，它存在于 E.coli等一些细菌基因组内，编码β-葡萄糖苷酸酶。 β-葡萄糖苷酸酶是一个水解酶，以β-葡萄糖苷酸酯 类物质为底物，其分解产物呈蓝色。
由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物 X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质 粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段， 使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，称为蓝白 斑筛选。如用蓝白斑筛选则经连接产物转化的平板37℃温箱倒置培养1216hr后，有重组质粒的细菌形成白色菌落。
转基因作物的检测方法
（一）以载体为检测对象：PCR扩增载体序列，根据扩 增产物的大小或有无来判断是否为转基因植物。 目前, 瑞典等欧洲国家普遍以35S 的检测结果作为转基因 食品标签的重要依据。 （二）以插入的外源基因为检测对象：PCR扩增插入的 外源基因；或者利用抗体与抗原的反应来检测（Western blotting，ELASA等）。 （三）以插入的报告基因为检测对象：GUS染色法。