拓扑异构酶的功能
医学分子生物学名词解释-1
1.启动子：启动子是基因转录起始所必须的一段DNA序列，是基因表达调控的上游顺式作用元件之一2.增强子：能强化转录起始的序列为增强子或强化子，与启动子一起都可视为基因表达调控中的顺式作用元件。
无论位于靶基因的上游、下游或内部都可以发挥作用。
3.抗终止因子：抗终止因子是指能在特定位点阻止转录终止的一类蛋白。
这些蛋白与RNA聚合酶的核心酶结合，使RNA能越过终止子，继续转录DNA。
4.上游启动子元件：TATA区上游的保守序列称为上游启动子元件，它们决定转录产物产率高低。
5.帽子结构：通过倒扣GTP和特殊的甲基化修饰而加在真核mRNA5′端的特殊结构，可保护mRNA的稳定，形似帽子而得名。
6.顺式作用元件：是指对基因表达有调节作用的DNA序列，如启动子、增强子等。
其活性只影响与其自身同处在一个DNA分子上的基因。
7.反式作用因子：是指远离受影响的基因之外的基因所编码的产物，又称为转录因子（本质是蛋白质）。
有特异性和非特异性之分。
8.结构基因和调节基因结构基因：编码功能各异的蛋白质或RNA的特异DNA序列。
调节基因：编码那些参与基因表达调控的RNA和蛋白质(即调控RNA和调控蛋白)的特异DNA序列。
9.组成蛋白和调节蛋白组成蛋白：细胞内有许多种蛋白质的含量几乎不受外界环境的影响，这些蛋白质称为组成蛋白。
调节蛋白:是一类特殊的蛋白质，是调节基因的产物，它们可以影响一种或多种基因的表达。
有两种类型的调节蛋白，即起正调节作用的激活蛋白和起负调节作用的阻遏蛋白。
10.异染色质：细胞间期核内染色质压缩程度较高，碱性染料着色较深的区域。
着丝粒、端粒、次缢痕， DNA主要是高度重复序列，没有基因活性。
11.核小体：核小体是染色体的基本组成单位，它是由DNA和组蛋白构成的，组蛋白H3、H4、H2B、H2A各两份，组成了蛋白质八聚体的核心结构，大约200bp的DNA盘绕在蛋白质八聚体的外面，相邻两个核小体之间结合了1分子的H1组蛋白。
抗癌药物和拓扑异构酶作用实验具体步骤及详细方法
抗癌药物和拓扑异构酶作用实验具体步骤及详细方法1.实验前准备：-准备所需的实验器材，包括显微镜、离心机、PCR仪等。
-准备所需的试剂和溶液，包括抗癌药物、拓扑异构酶底物、酶解缓冲液等。
-调制实验所需的实验用细胞系，如人类癌细胞系。
-准备实验动物（如果需要）。
2.细胞培养：-用适当的培养基培养癌细胞系，维持细胞的正常生长。
-保持细胞的温度、湿度和二氧化碳含量等环境条件。
3.制备药物样品：-在适当的溶剂中配置抗癌药物的工作浓度。
根据不同的实验目的，可以选择单剂量或多剂量的实验设计。
-制备药物的雏形溶液。
-通过稀释等方法制备出不同浓度的药物样品。
4.拓扑异构酶底物添加实验：-将细胞分为不同的组，每组包含实验组和对照组。
对于实验组，将不同浓度的抗癌药物添加到细胞培养基中。
-取适量的细胞悬浮液，连同抗癌药物一起添加到细胞培养板中。
同时，在对照组中只加入细胞悬浮液而不加入抗癌药物。
-在培养时间的不同时间点观察细胞的形态变化和生长情况。
5.细胞生存率测定：-使用显微镜观察细胞的形态和数量。
-使用MTT或二乙基亚砜（DMSO）等荧光染料对细胞的存活情况进行检测。
-使用细胞计数仪等设备对细胞的生存率进行定量测量。
6.拓扑异构酶活性测定：-使用PCR技术对拓扑异构酶的底物进行扩增，并观察扩增产物的形成情况。
-通过电泳或其他方法对扩增产物进行分离和检测。
-根据扩增产物的形成情况评估拓扑异构酶的活性。
7.数据分析：-根据实验结果分析抗癌药物对拓扑异构酶的影响。
-使用合适的统计学方法对数据进行分析和处理。
总结：抗癌药物和拓扑异构酶作用实验是一种用于研究抗癌药物与拓扑异构酶之间相互作用的方法。
实验主要包括细胞培养、制备药物样品、添加拓扑异构酶底物、测定细胞生存率和拓扑异构酶活性等步骤。
通过这些实验，可以评估抗癌药物对拓扑异构酶的作用机制和抗癌活性。
DNA拓扑异构酶的研究进展
均位于 Ｔ ｐ 的核心结构域 ，Ｔｒ ２ ｏ ｏＩ ｙ ７ ３位 于羧基端结构域 。核 心 结构域和 羧基端结构域重组后可 以得到接近全酶 的活性。 Ｔｐ ｏ ｏＩ的结构域还有连接子区域和 Ｎ端域， 前者与催化活性无
结构动态变化， 是控制核酸生理功能 的关键酶。 扑酶 的生物 拓 学作用可通过两种方式实现 ，一是调节控制 Ｄ Ａ 的超螺旋状 Ｎ 态及打结或解结 Ｄ Ａ 的环连体状态，从而间接地影响细胞 内 Ｎ 核酸代谢过程：二是直接参与那些需打断并重新连接 Ｄ Ａ分 Ｎ
３０ ０ ３０ ６）
文 章编 号 ：１７ — ０ ５ （０ ８ ． ２ ７０ ２ ５ ８ ２ ０ ）３０ ５ ． ３ ６
Ｄ Ａ 拓 扑 酶 广 泛存 在于 生物 体 细 胞核 内 ， 调 节 核酸 空 间 Ｎ 能 结 构 动 态变 化 ， 是控 制 核 酸 生 理 功 能 的关 键 酶 。 参与 Ｄ Ａ 的 其 Ｎ
为 ３ｋ ， 通 常 Ｉ Ｂ型 酶相 对 分 子 量在 ８ ～ １ Ｏｕ之 间 。因 ６ｕ 而 Ｏ ｌｋ 此它 已成 为 研 究 该类 酶 的结 构 功 能 的重 要 模 型分 子 。
构 ：双螺旋结构构成其二级结构；真核生物 Ｄ Ａ 分子很大 ， Ｎ
Ｄ Ａ 很 长 ，但 却要 存 在 于 小 小 的细 胞 核 内 ，因 此 Ｄ Ａ必 须 在 Ｎ链 Ｎ 二 级 结 构 的基 础 上 紧密 折 叠 ，这 就形 成 了三 级 结 构 ：ＤＡ分 子 Ｎ
人 Ｔ ｐ Ｉ为单体酶，相对分子量为 ９ ｕ ｏｏ １ｋ ，共含 ７ ５个 ６ 氨基酸 ，由位于染色体 ２ １￣１．２上 的单拷贝基 因编码 。 ０ｑ ２ ３ 最早 发现 的 Ｔ ｐ 个关 键功 能活 性位 点为 ： ｈ ｇ８ ， ｏ ｏＩ ４ ｒ ４ ８
关于TOPO和GATEWAY
Gateway®克隆的强大性和灵活性
在目的基因（go或者开放阅读框(ORF)克隆进Gateway®入门载体后，可以很容易将它转移到任何目的载体，创建各种各种各样的表达克隆。当每一个基因具有进行Gateway®重组的att序列时它们就可能在载体间穿梭。
Gateway技术原理
Gateway克隆技术是利用λ噬菌体与大肠杆菌的染色体之间发生的λ嗜菌体位点特异重组系统的重组整合与切出反应（attB x attP →attL x attR）BP和LR两个反应构成的（表2和图4）。BP反应利用一个attB DNA片段或表达克隆和一个attP供体载体之间的重组反应，创建一个入门克隆。LR反应是一个attL入门克隆和一个attR目的载体之间的重组反应。LR反应用来在在平行的反应中转移目的序列到一个或更多个目的载体。
6）用10-50μl，涂于平板上，正放5min后，37摄氏度倒置培养过夜
7）直接进行PCR检测，或挑取菌落在50μl含有50μg/ml氨苄或25μg/ml Zeocin™的LB培养基（置于200μl微量离心管中）培养4h
或者：
Fresh PCR product1.33 µl(from Step 1)
Salt Solution0.33µl(in kit（试剂盒）in-20°Cfreezer)
TOPO Vector（载体）0.33 µl(in kit（试剂盒）in-20°Cfreezer)
FINAL VOLUME2.00µl
1)连接：按上表进行配制溶液后，轻轻混匀，室温静置5min
2）转化：将试管置于冰盒中进行冰浴5-30min
（图2）
TOPO克隆高效性原理
Topo连接反应有两个分子参与，而传统的连接反应有三个分子参与，其热力学上的优势导致5分钟的快速连接。
现代分子生物学整理的名词解释及问答
名词解释：DNA聚合酶：指以脱氧核苷三磷酸为底物，按5’→3’方向合成DNA的一类酶，反应条件：4种脱氧核苷三磷酸、Mg+、模板、引物。
DNA聚合酶是多功能酶，除具有聚合作用外，还具有其它功能，不同DNA聚合酶所具有的功能不同。
解旋酶：是一类通过水解ATP 提供能量，使DNA双螺旋两条链分开的酶，每解开一对碱基，水解2分子ATP。
拓扑异构酶：是一类引起DNA 拓扑异构反应的酶，分为两类：类型I的酶能使DNA的一条链发生断裂和再连接，反应无需供给能量，类型Ⅱ的酶能使DNA的两条链同时发生断裂和再连接，当它引入超螺旋时，需要由ATP供给能量。
单链DNA结合蛋白：是一类特异性和单链区DNA结合的蛋白质。
它的功能在于稳定DNA解开的单链，阻止复性和保护单链部分不被核酸酶降解。
DNA连接酶(DNAligase)：是专门催化双链DNA中缺口共价连接的酶，不能催化两条游离的单链DNA链间形成磷酸二酯键。
反应需要能量。
前导链：在DNA复制过程中，以亲代链(3’→5’为模板时，子代链的合成(5’→3’)是连续的．这条能连续合成的链称前导链。
冈崎片段、后随链：在DNA复制过程中，以亲代链(5’→3’)为模板时，子代链的合成不能以3’→5’方向进行，而是按5’→3’方向合成出许多小片段，因为是冈崎等人研究发现，因此称冈崎片段。
由许多冈崎片段连接而成的子代链称为后随链。
半不连续复制：在DNA复制过程中，一条链的合成是连续的，另一条链的合成是不连续的，所以叫做半不连续复制。
修复：除去DNA上的损伤，恢复DNA的正常结构和功能是生物机体的一种保护功能。
切除修复：在一系列酶的作用下，将DNA分子中受损伤部分切除，以互补链为模板，合成出空缺的部分，使DNA恢复正常结构的过程。
重组修复：DNA在有损伤的情况下也可以复制，复制时子代链跃过损伤部位并留下缺口，通过分子间重组，从完整的另一条母链上将相应的核苷酸序列片段移至子链缺口处，然后用再合成的多核苷酸的序列补上母链的空缺，此过程称重组修复。
原核生物dna复制酶的作用
原核生物dna复制酶的作用
原核生物的DNA复制涉及到多种酶的作用，这些酶包括DNA聚合酶、解
螺旋酶、拓扑异构酶和引物酶。
1. DNA聚合酶：在DNA复制过程中，DNA聚合酶负责合成新的DNA链。
它能够识别DNA模板链上的碱基，并在合成链上以互补碱基的顺序将新的
核苷酸添加进去，从而形成新的DNA链。
原核生物有至少三种DNA聚合酶：DNA聚合酶I、II和III。
2. 解螺旋酶：也被称为DnaB，它的功能是解开DNA双链，帮助复制过程
中的DNA链的展开。
3. 拓扑异构酶：这种酶可以切断DNA链，防止在解链过程中DNA链打结
或缠绕在一起。
拓扑酶分为I型和II型两种。
4. 引物酶：也被称为DnaG，它在复制起始时催化生成RNA引物。
引物是DNA合成的起点，帮助DNA聚合酶找到正确的复制起点。
5. DNA连接酶：这是一种能够催化两条DNA链连接的酶，将DNA片段连接起来形成完整的DNA分子。
在原核生物中，DNA连接酶利用NAD+作
为供能物质，将DNA链的3'-OH末端和另一DNA链的5'-P末端连接起来，形成磷酸二酯键，从而完成相邻DNA链的连接。
这些酶协同作用，确保了原核生物DNA复制的准确性和高效性。
生化—复制第十章
在复制中维持模板处于单链状态并保护 单链的完整性。
单链DNA结合蛋白
解旋酶
随
从
链
（二）DNA拓扑异构酶改变DNA超螺旋状态、 理顺DNA链
复制过程正超螺旋的形成
10
局部解链后
8
58
解链过程中，DNA分子会出现过度拧紧、 打结、缠绕、连环等现象。
59
拓扑异构酶 (topoisomerase)
模板: 解开成单链的DNA母链
引物: 提供3-OH末端的寡核苷酸
其他酶和蛋白质因子: 拓扑异构酶、解旋酶、
引物酶、连接酶、单链DNA结合蛋白
28
一、复制的基本化学反应
(dNMP)n + dNTP → (dNMP)n+1 + PPi
29
聚合反应的特点:
DNA新链生成需引物和模板
新链的延长只可沿5→3方 向进行
复制方向
3'
原核生物
基因组是环状DNA 只有一个复制起始点
双向复制中，DNA被 描述为眼睛状。为说明 方便而做的图为形。
E.coli DNA双向复制放射自显影
18
ori
ter
A
B
C
A. 环状双链DNA及复制起始点 B. 复制中的两个复制叉
C. 复制接近终止点(termination, ter)
3´
?
5´
T C G AA G T C C T A G C G A C
3 5外切酶活性 辨认错配的碱基对，并将其水解 5 3外切酶活性 切除引物、损伤的 DNA片段
33
34
塞韦罗· 奥乔亚 Severo Ochoa （1905~1993）
DNA的拓扑结构与调控
DNA的拓扑结构与调控DNA是生命体中一个重要的分子，在维持生命的过程中扮演着重要的角色。
DNA分子不仅拥有特定的序列，还具有特定的构象，其拓扑结构对于DNA的结构和功能是至关重要的。
DNA的拓扑结构是指DNA双链的旋转、弯曲和缠绕等状态，这些状态是由DNA分子内部的运动状态所引起的。
DNA分子的拓扑结构可以影响其在DNA合成、DNA修复和基因转录等生理过程中的功能。
DNA的拓扑结构和DNA的结构有很大的联系。
DNA分子通常是以螺旋的方式组成的，这是由于DNA两股链之间的氢键强力作用所导致的。
因此，DNA分子通常是呈现出左右交替排列的结构。
当DNA分子在生理过程中发生加工和复制时，其拓扑结构就会发生变化。
例如，在DNA复制的过程中，DNA双链会被解开，不同的相互作用会发生变化，这些都会对DNA的拓扑结构产生影响。
DNA形成的环状结构和化学修饰对DNA拓扑结构的影响也非常重要。
例如，DNA环状分子的拓扑结构通常会影响DNA合成过程中的催化反应，这会影响DNA分子的构象和合成速率。
此外，DNA化学修饰通常会改变DNA的拓扑结构，影响DNA分子的生物活性和功能。
例如，在人类细胞中，DNA的化学修饰通常由DNA修复酶和特定酶完成，这些酶通常能够识别和修复DNA中的复杂损伤，对于维护基因组的稳定性起到了重要的作用。
解决DNA拓扑问题的方法主要是拓扑异构酶。
在细胞中，拓扑异构酶通常起到解决DNA拓扑障碍的作用。
例如，当DNA分子在生物过程中出现超拧缠绕时，拓扑异构酶会使DNA分子断裂并重新连接，修复并调整DNA分子的拓扑结构。
此外，拓扑异构酶还可以对DNA分子进行改变拓扑的操作，例如将DNA分子断为单股链或做一个大规模的自酶化。
在生物学中，DNA的拓扑结构是非常重要的，因为它会影响DNA的结构和功能。
同时，在生物学研究中，DNA的拓扑结构也是一个热门的研究方向。
对DNA拓扑结构的研究有助于理解DNA分子在生理过程中的生物学机制。