肾型鸡传染性支气管炎病毒dq 株s 基因结构分析

图 2 重组质粒 BamHI，HindIII 双酶切和 PCR 鉴定 Fig. 2 Identification of recombinant plasmid by digestion （BamHI + HindIII）and PCR
1：重组质粒 pBSIBVS1-DQ1 / BamHI + HindIII；2：质粒载体 pBlue HindIII；3：PCR 扩增产物；4：Marker （Lambda DNA / EcoRI + HindIII）。
用 Sepharose 2B 层析法纯化重组质粒，作 测序 的 模 板，采 用 渐 进 法（prime walking）测 序。即 5’端和 3’端分别用通用引物进行反 应，根据两端测出的序列，再设计合成中间部 分的测序引物，继续进行测序反应，将 4 段测 序结果拼接即为 S1 基因全长序列，全部测序 反应重复 2 次。 S1 基因序列的比较是通过 PCGENE 软件进行分析。
jing，ZJ971，Beaudette，H120，M41 毒株的同源性为 78.4% ～ 82.73%，氨基酸同源性为 74. 41% ～ 78. 96%。 DQ 株不同于其它血清型 IBV 的主要特征为：在 S1 基因核苷酸序列上，第 278 - 299 位之间插入了 一段新的序列，第 423 - 431 位碱基缺失，有许多点突变；二级结构上表现为第 2 - 22 位氨基酸区
摘 要：选用 Trizol 试剂抽提肾型鸡传染性支气管炎病毒（IBV）DQ 株基因组 RNA，采用特异性引物
通过 RT - PCR 扩增其 S1 基因 cDNA，克隆入 pBluescript 质粒载体中，作测序分析。结果表明，DQ 株 S1 基因全长为 1 731 nt ，编码一条 576 个氨基酸组成的多肽，其核苷酸与 IBV - 4 / 91，Gray，D41，Bei-
按文献［7］进行。 1 . 5 PCR 产物的克隆及鉴定
将 DQ 株 RT-PCR 产物和质粒 pBluescript 分别用 BamHI，HindIII 双酶切，经 DNA gel ex-
traction kit 纯化酶切产物，在 T4 DNA 连接酶 的作用下，16 ℃ 连接过夜，再转化感受态细胞 E . coli . DH5α，在 含 氨 苄 青 霉 素，X-gal，IPTG 的 LB 培养基中 37℃培养 18 ～ 20 h，挑选白色 菌落，碱裂解法抽提质粒，经 1% 琼脂糖凝胶 电泳，并进一步用 BamHI，HindIII 酶切鉴定和 PCR 扩增鉴定。 1 . 6 DQ 株 S1 基因测序及比较分析
2 .3 DQ 株 S1 基因的核苷酸序列测定和比 较分析
经鉴定的重组质粒 pBSIBVS1-DQ1 采用 渐进测序法，测定 DQ 株 S1 基因的全序列为 1 731 个核苷酸，编码 S1 蛋白 576 个氨基酸 （图 3），DQ 株 S1 基因核苷酸与收录于 Genbank 的 4 / 91，Gray，D41，Beijing，ZJ971， Beaudette，H120，M41 株 的 同 源 性 分 别 为 78. 42% ，79 . 32% ，81 . 38% ，81 . 74% ，82 . 18% ， 82 . 44% ，82 . 50% ，82 . 73% 。其推导的氨基 酸同源性分别为 74 . 58% ，74 . 41% ，78 . 58% ，
1 材料与方法
1. 1 病毒 IBV-DQ 株系以肾脏病变为主要特征的
鸡传染性支气管炎病毒浙江分离株，由本实 验室分离保存［6］。病毒繁殖和纯化，按文献
［7］进行。 1. 2 酶与试剂
Taq PlusI DNA 聚 合 酶，First Strand DNA Synthesis Kit，鼠 源 Molony 反 转 录 酶（ MLVRTase），T4 DNA 连 接 酶，限 制 性 内 切 酶 BamHI，HindIII 均为 MBI 公司产品；Trizol 试 剂为 GIBCO 公 司 产 品；质 粒 pBluescript SK， RNasin，dNTP，E . coli . DH5α 等 均 购 自 上 海 sangon 生物工程有限公司；其它生化试剂均 为进口分析纯。
1：IBV-DQ；2：Marker
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浙江农业学报 第 13 卷（2001）
2 . 2 RT-PCR 产物的克隆及其鉴定 PCR 产 物 克 隆 后，经 含 氨 苄 青 霉 素，X-
gal，IPTG 的 LB 培养基培养和电泳初选，获得 三 个 重 组 质 粒 pBSIBVS1-DQ1，pBSIBVS1DQ2，pBSIBVS1-DQ3。 选 pBSIBVS1-DQ1 经 BamHI，HindIII 双酶切，结 果 出 现 二 个 片 段， 小片段与 PCR 产物（1 . 73 kb）大小一样，大片 段与 载 体 pBluescript 的 双 酶 切 片 段 大 小 一 样，再以重组质粒 pBSIBVS1-DQ1 为模板进行 PCR 扩增，得到一条约 1 . 73 kb 条带（图 2）， 证明被克隆到载体 pBluescript SK 中的外源 DNA 片段正确。
Structural analysis of the S1 gene of nephropathogenic isolate DQ of avian infectious bronchitis virus：HE Yong-qiang1，WU Jian-xiang（2 1 Laboratory of Virology，Zhejiang Academy of Agricultural Sciences，Hangzhou ;<==><，?hina；>@nstitute of biotechnology，Zhejiang AniBersity，Hangzhou ;<==>C，?hina） Abstract：The genome RNA of nephropathogenic isolate DQ of avian infectious bronchitis virus was extracted by means of Trizol reagent ，cDNA of S1 gene of isolate DQ was amplified by reverse transcription-polymerase chain reation with special primer and was cloned into plasmid pBluescript SK. The cloned S1 gene was sequenced and was analysed. Results showed that cDNA of S1 gene of isolate DQ was composed of 1 731 nucleotides encoding for a polypedptide of 576 amino acids. Nucleotide homogeneity of S1 gene between isolate DQ and other IBV isolates of different serotypes 4 / 91，Gray，D41，Beijing，ZJ971，Beaudette，H120，M41 ranged from 78.4% to 80.73% . Amino acid homogeneity was 74 . 41% to 78 . 96% . Major specialities of isolate DQ differing from other isolates were base insertion at the site 278 - 299 bp and base deletion at the site 423 - 431 bp ，as well as much point mutation. These mutations caused conformational changes in the secondary structure of S1 glycoprotein of isolate DQ with increased hydrophilicity at the both sites of 2 - 22AA and 92 - 98AA，and increased hydrophobicity at the site 74 - 76AA.Evolution analysis indicated that isolate DQ was in far relation to the other strains of IBV. Key words：nephropathogenic avian infectious bronchitis virus；S1gene
收稿日期：2001 - 08 - 08 基金项目：国家自然科学基金项目（39970030） 作者简介：何永强（1966 - ），男，浙江东阳人，副研究员，硕 士，主要从事动物病毒的诊断、防制及生物技术研究工作。
鸡传染性支气管炎病毒（IBV）粒子 S1 糖 蛋白亚单位是主要宿主保护性抗原，在传染 性支 气 管 炎 的 免 疫 学 防 制 中 起 着 重 要 作 用［1 ～ 3］。由于免疫压力作 用，IBV 易 发 生 变
2 结果
2 . 1 DQ 株 S1 基因的扩增 采用本试验设计的特异性引物，以 IBV-
DQ 株 RNA 为模板进行 RT-PCR 扩增，结果得 到一条 1 . 731 kb 大小的 S1 糖蛋白基因条带 （图 1）。
图 1 IBV-DQ 株 S1 基因 RT-PCR 扩增产物电泳 Fig. 1 Electrophoresis of RT-PCR product of S1 gene of IBV-DQ
域、第 92 - 98 位氨基酸区域亲水性增强，第 74 - 76 位氨基酸区域疏水性增强，最大亲水峰改变。
S1 分子进化系统分析显示，DQ 株与其它各毒株的亲缘关系较远。