几种蛋白原料的体外消化率的测定方法的比较
几种蛋白原料的体外消化率的测定方法的比较
摘要：试验分别采用胃蛋白酶-胰蛋白酶两步法、肉食性鱼类（如鲈鱼）消化道粗酶提取液消化法和草食性鱼类（如草鱼）消化道粗酶提取液消化法测定了酪蛋白、鱼粉、豆粕、菜籽粕、棉籽粕、酵母粉和玉米蛋白粉等7种蛋白质原料的体外消化率。3种测定方法中，鱼粉的消化率差异不显著（P>0.05）；豆粕、菜籽粕、酵母粉和玉米蛋白粉用两步法和草鱼消化酶法测定的消化率无显著差异（P>0.05）；棉籽粕消化率用两步法测定值高于用消化酶法的测定值，差异极显著（P<0.01）；豆粕、菜籽粕、酵母粉和玉米蛋白粉的消化率用两步法比用鲈鱼消化酶测定的值高，差异极显著（P<0.01）；草鱼消化酶法和鲈鱼消化酶法对酪蛋白的消化率无显著差异（P>0.05），而对于豆粕、菜籽粕、棉籽粕、酵母粉和玉米蛋白粉草鱼消化酶法测定值高于鲈鱼消化酶法的测定值，差异极显著（P<0.01）。结果表明，胃蛋白酶-胰蛋白酶两步体外消化法在测定鱼粉蛋白质消化率时可替代鱼类消化液粗酶消化法，对其它蛋白质原料使用该方法应慎重。
关键词：蛋白质饲料；体外消化率；测定方法
消化率是动物从食物中所消化吸收的部分占总摄入量的百分比，是评价饲料营养价值的重要指标之一。测定饲料消化率主要有两种方法：体外法和体内法。体内法测定的消化率能够比较真实的反映鱼类对饲料的消化情况。但体内法测定方法复杂、时间长、费用高，而且对外界环境的要求较高，季节、温度、光照等都会影响消化率测定值。体外消化法是利用精制的消化酶或研究对象的消化道酶提取液在试管内进行的消化试验，其测定值可近似反映鱼对饲料的消化率。此法能快速测定原料的相对利用率，为营养师制作配方提供参考[1]。然而，体外消化法无法反映体内消化的真实情况。Boisen和Eggum（1991）在胃蛋白酶-胰蛋白酶两步法中利用标准过滤装置测得饲料蛋白质消化率与鼠和猪的真消化率十分接近，他们认为这种方法测得的蛋白质体外消化率经内源氮校正与回肠末端蛋白质表观消化率高度相关。我国饲料原料品种多，营养成分含量差异大，加工方式各异，饲料原料对不同鱼类的营养价值差异更大。由于鱼类生活在水中，测定鱼类饲料真消化率比测定畜禽的更加困难。所以寻找一种准确、简便、实用的消化率测定方法对评价鱼类饲料的消化率有着十分重要的意义。本试验采用胃蛋白酶-胰蛋白酶两步体外消化法以及从肉食性和草食性鱼类的消化道提取消化酶在体外消化饲料的方法，测定了7种常用蛋白质饲料原料的消化率，为饲料生产者配制鱼用饲料提供基础数据，同时为体外测定鱼用蛋白质原料消化率提供参照。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 饲料原料
酪蛋白、鱼粉、豆粕、菜籽粕、棉籽粕、酵母粉和玉米蛋白粉，均为经105℃烘干处理的样品，粉碎过60目筛后保存备用。
1.1.2 主要试剂
硫酸（GB 625—77）、硫酸铜（GB 665—78）、硫酸钾（HG 3—920—76）和氢氧化钠（GB 629—77），均为分析纯。
硼酸（GB 628-78）（分析纯）：2g溶于100ml水配成2%溶液（W/V）。
混合指示剂：甲基红（HG 3—958—76）0.1%乙醇溶液，溴甲酚绿（HG 3—1220—79）0.5%乙醇溶液，两溶液等体积混合，阴凉处保存期三个月以内。0.05mol/l HCl溶液：取4.2ml浓盐酸，用蒸馏水定容至1L。
标定甲基红-溴甲酚绿混合指示剂：取20 ml 0.1%甲基红酒精溶液，与20ml 0.5%溴甲酚绿酒精溶液，混匀。
胃蛋白酶活性为1：10 000；胰蛋白复合酶活性为2 500IU/mg；鲈鱼消化道混合液；草鱼消化道混合液；双抗为青霉素G钾盐（150 IU/ml）和硫酸链霉素（150IU/ml）；14%磺基水杨酸钠。
1.1.3 主要仪器
实验用样品粉碎机、分析筛（孔径0.60mm）、分析天平（感量0.001g）、滴定管（酸式，100ml）、电炉、消化炉、电热式恒温烘箱、干燥器、凯氏蒸馏装置、过滤装置、磁力搅拌器、离心机、恒温水浴振荡器等。
1.2 试验方法
1.2.1 原料蛋白质测定
1.2.1.1 消化
称取0.6～0.7g（准确至0.001g）试样，无损失地放入消化瓶中，加入无水硫酸钠和硫酸铜的混合物[m（CuSO4·5H2O)：m(Na2SO4)=1：9]6g，与试样混合均匀，再加浓硫酸20ml，在消化炉上小心加热，起初电压调大，冒烟时调小电压，大量冒烟后再调大电压，加热至样品呈透明的浅蓝色或白色为止，关上电源，使消化瓶自然冷却。而后，用蒸馏水冲洗消化瓶，洗液注入100ml容量瓶内，定容。同时做一个空白对照试验。
1.2.1.2 蒸馏
连接好凯氏蒸馏装置，加热使之产生蒸汽。取20%硼酸溶液20ml置于150ml三角瓶内，并加混合指示剂1滴，然后将其置于冷凝管下。吸取消化稀释液10ml，由漏斗处加入反应室内，再加40% NaOH溶液10ml。使蒸汽进入反应室，加热蒸馏，直至三角瓶内硼酸溶液增加1倍体积，移开三角瓶，停止加热。将空白对照的消化液做同样处理。
1.2.1.3 滴定
用0.05 mol/l盐酸标准溶液滴定，到接收液由绿色变为灰红色即是终点。同样滴定空白实验的接收液。
1.2.1.4 计算
式中：CB——含氮量；NHCl——滴定所用盐酸的浓度；V1——试样滴定时所需酸标准溶液的体积（ml）；V2——空白滴定时所需酸标准溶液的体积（ml）；m——试样的质量（g）。1.2.2 消化液测定法
1.2.2.1 胃蛋白酶最适量的选择
分别取0.5g豆粕置于3个三角瓶中，各加入含不同胃蛋白酶活性单位（100IU、160IU、200IU）的pH值为1.4的0.05mol/l HCl-KCl缓冲液30ml，在40℃台式恒温摇床上保温3h后过滤，多次冲洗残留物，用凯氏定氮法测定残留物的蛋白质含量。计算饲料蛋白质消化率，确定出胃蛋白酶的最适用量为160 IU（表1）。
1.2.2.2 胰蛋白酶最适用量的选择
分别取0.5g豆粕置于3个三角瓶中，用含有胃蛋白酶浓度为0.05mol/l的HCl-KCl缓冲液做前处理，之后加0.2mol/l的氢氧化钠溶液处理消化液使之pH值等于6.8。再分别加入含不同胰蛋白酶活性（100IU、150IU、200IU）的0.05mol/l的KH2PO4-NaOH缓冲液。继续培养3h，测定饲料的蛋白质消化率，确定出胰蛋白酶的最适用量为150IU（表2
1.2.2.3 离体消化程序
①胃蛋白酶处理
a.称取0.5g饲料样品2份，分别置于250 ml带盖三角瓶中（每个样品测2个平行样）。
b.准确称取1.777g胃蛋白酶（准确到0.001g），置于体积100ml、pH值1.4的HCl-KCl缓冲液中。
c.用移液管移取30ml上述混合液置于三角瓶中。
d.将三角瓶置于（40±0.1）℃台式恒温摇床中，以其温度达到40℃时开始计时，震荡3h，
频率为80次/min。
②胰蛋白酶处理
a.准确称取4mg胰蛋白酶（准确到0.001g），置于体积1 000ml、pH值6.8的KH2PO4-NaOH 缓冲液中，放入冰箱中备用（温度为4～6℃）。
b.从摇床中按顺序取下三角瓶，用0.2mol/ml NaOH溶液滴定消化液，使其pH值6.8，各量取15ml KH2PO4-NaOH缓冲液置于三角瓶中，然后再分别用移液管吸取15ml KH2PO4-NaOH-胰蛋白酶混合液置于另一个三角瓶中。
c.继续在（40±0.1）℃下震荡培养3h。
d.用320目尼龙滤布和抽滤装置过滤消化液，并用温水反复冲洗培养用的三角瓶（3～4次），将洗液加入消化液中过滤，用洗瓶多次冲洗滤渣。
e.将滤渣放入65℃恒温烘箱中烘干1h。
f.用凯氏定氮法测定滤渣的含氮量，计算消化率。
③空白试验
按上述各步骤进行，但不加入样品，测定胃蛋白酶-胰蛋白酶复合处理空白试验的含氮量。
1.2.2.4 体外消化率计算方法
粗蛋白消化率（%）= 100×（饲料样品粗蛋白含量-消化后滤渣粗蛋白含量）/饲料样品粗蛋白含量
1.2.3 消化酶提取法
1.2.3.1 粗酶液的提取
按照常规方法解剖取出鱼的肠道和肝胰脏，去除脂肪和肠道内容物后，用0.2M、pH值7.4的磷酸缓冲液按W/V为1：20稀释，并用玻璃匀浆器匀浆后，在3 500r/min下离心20min，取上清液作为粗酶提取液，冷冻保存于冰箱中备用。
1.2.3.2 离体消化率的测定
准确称量过80目的样品各0.400g，放入100ml带塞三角瓶中，加0.02M、pH值7.4的磷酸缓冲液40ml，粗酶液10ml，加入双抗（青霉素150IU/ml、硫酸链霉素150IU/ml）。每隔4h 加双抗一次，置于（28±1）℃的恒温生化培养箱中，在以50次/min震荡的摇床上进行离体消化12h。每个样品分别作2个平行样。
1.2.3.3 离体消化率的计算
鱼类消化道的粗酶液离体消化12h后终止反应，用定量滤纸过滤，并用温水冲洗3～4次，取滤渣（含滤纸）在105℃下烘干至恒重并准确称重。凯氏定氮法测定饲料原料及其消化后相应滤渣的粗蛋白含量。
粗蛋白消化率（%）= 100×（饲料样品粗蛋白含量-消化后滤渣粗蛋白含量）/饲料样品粗蛋白含量
2 结果
2.1 饲料的粗蛋白含量
试验所用的饲料原料采用凯氏定氮法测得其粗蛋白含量（见表3）。
2.2 饲料粗蛋白的体外消化率
消化液测定法（即胃蛋白酶-胰酶两步消化法）、消化液提取法（提取鲈鱼和草鱼两种消化液）测得的蛋白质饲料消化率见表4。
3 分析与讨论
3.1 蛋白质饲料原料
由表4可知，两步法中酪蛋白的消化率最高，为96.9%；其次为棉籽粕和豆粕，其消化率分别为90.2%、89.9%；玉米蛋白粉、鱼粉的消化率分别为83.4%和80.7%；酵母粉、菜籽粕的蛋白质消化率均低于80%。试验测得的常用蛋白质消化率，与其他学者报道的有关体外消化
率结果十分接近。酪蛋白、豆粕的消化率略低于pH值恒定法和体外消化法的测定值[4，5]。从鲈鱼消化酶对蛋白质饲料的消化率来看，酪蛋白最高为86.2%，其次为鱼粉83.8%；在植物蛋白饲料中豆粕较高，接近于鱼粉的消化率，为81.8%，而菜籽粕和棉籽粕的消化率较低，均小于50%；酵母粉和玉米蛋白粉的消化率最低，分别只有38.4%、36.3%。草鱼消化酶对蛋白质饲料的消化率数据显示，酪蛋白仍然是最高的，为90.4%；其次为豆粕、菜籽粕和鱼粉，分别为87.5%、86.2%、84.0%；玉米蛋白粉和棉籽粕的消化率为77.1%和75.2%；酵母粉的消化率最低，只有68.5%。值得注意的是，豆粕、菜籽粕的消化率均高于鱼粉，这主要是由其草食性鱼类的特点决定的，本试验与罗莉等（1997）测定的结果相一致[6]。饲料及其蛋白质在鱼体消化道中被消化的程度取决于消化酶（消化蛋白质的主要是蛋白酶）的作用时间，消化速度受消化酶的浓度、温度、底物和作用时间的影响[11]。由鲈鱼消化酶的试验结果可知，其对鱼粉具有很好的消化效果，而在3种植物蛋白饲料中，对豆粕的消化效果最好，其次为菜籽粕，对棉籽粕的消化效果最差。这与原料的种类和性质有关。
3.2 体外消化率测定方法
不同的消化方法测定的粗蛋白消化率存在显著差异（P<0.05）。用两步法测得的消化率普遍高于消化液提取法，前者的消化率在75.4%～96.9%之间变化，而后者用两种消化液测得的消化率分别为36.3%～86.2%（鲈鱼消化液）和68.5%～90.4%（草鱼消化液）。在同一消化方法中，饲料的消化率之间也存在着显著差异（P<0.05）。酪蛋白、鱼粉、豆粕粗蛋白的消化率较高，均大于80%。两步法中粗蛋白消化率的变化辐度为21.5%，鲈鱼和草鱼消化率的变化辐度为49.9%和21.9%。对鲈鱼而言，植物蛋白饲料的消化率要远远小于动物蛋白饲料，这主要是由其肉食性的特点决定的。相反地，两步法和草鱼消化液的数据则比较接近。两步法消化体系得到的消化率值高于使用消化液的消化体系。目前体外消化率测定尚无统一方法，各种消化法中选用的酶的种类及酶活力都存在不同，消化条件（温度、pH值、消化时间）、消化产物的分解以及测定方法也不同，这些因素可能影响消化率的测定结果。本试验中的一些蛋白质消化率高于动物体内测得的结果，相应饲料的消化率高于印遇龙测得的猪回肠末端蛋白质表观消化率。体外消化率是以消化后所有可溶性氮作为可消化的蛋白质来计算的[7]，而表观消化率是以回肠末端食糜中所有氮作为不可消化蛋白质计算得出的，但并非回肠末端的食糜氮都是不可消化的饲料蛋白质[8]，两种消化方法涉及到内源氮的差别，这可能导致本试验测定值略高于印遇龙[7]的结果。Boisen研究认为，对体外消化率进行内源氮校正后，可以准确地预测回肠末端蛋白质表观消化率[2]，若对不同类别的饲料再考虑到灰分、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维等成分，预测结果将会更准确[9]。目前，许多研究表明，两步消化法测得的蛋白质消化率与动物体内消化法测得的蛋白质真消化率高度相关[8-10]。胃蛋白酶-胰酶两步体外消化法可用于蛋白质的测定，测定值不受内源氮的影响。从草鱼消化酶的试验数据可知，作为草食性鱼类，其对豆粕、菜籽粕的消化率要高于对鱼粉的消化率，这主要是由鱼体消化道和消化酶的特性所决定的。因此，在配制草食性鱼类的人工养殖饲料中，可适当地减少鱼粉的用量，增加豆粕等植物蛋白质饲料的用量，不仅节省成本，也符合草食性鱼类的消化规律。肉食性鲈鱼对豆粕有很好的消化作用，从鲈鱼消化酶对蛋白质饲料的体外消化率来看，豆粕的结果与鱼粉的结果较接近。因此，在配制肉食性鱼类的人工养殖饲料中，可以适当地增加豆粕的用量，而尽量减少鱼粉等动物蛋白质原料的用量，既有利于降低饲料成本，又能有效改善鱼体的品质、降低饲料物质对水域环境的污染（鱼粉的总磷很高、但利用率很低）。
4 结论
胃蛋白酶-胰酶两步体外消化法在测定鱼粉蛋白质消化率时可以替代鱼类消化液粗酶消化法，对于其它蛋白质原料使用该方法应慎重。
第三章 鱼类营养学原理蛋白质营养影响蛋白质消化率因素.
第三章鱼类营养学原理 第一节蛋白质的营养 蛋白质是生命的物质基础，没有蛋白质就没有生命。机体中的每一个细胞和所有重要组成部分都有蛋白质参与。那么在鱼类营养中，是不是饲料中的蛋白质水平越高就越好呢？为什么，在众多饲料蛋白源，一般鱼类对鱼粉的消化利用率比其它蛋白源饲料高呢？ （一）：蛋白质营养 1.蛋白质的组成 含C、H、O、N，部分蛋白质含少量Fe、P、S，蛋白质的平均元素含量：C 53%，H 7%，O 23%，N 16%，S+P <1% N平均含量为16%，这是概略养分分析法CP含量计算的理论依据。 CP=蛋白质含N量÷16%=蛋白质含N量×6.25 蛋白质的基本组成单位是氨基酸，主要由20种氨基酸组成。 2.蛋白质的生理功能 机体内蛋白质的种类很多，性质、功能各异，但都是由20种氨基酸按不同比例组成的，并在体内不断代谢与更新。 ①细胞原生质的重要组成成分；是碳水化合物和脂肪不可替代的，是除水外，含量最多的营养物质，占干物质的50%，占无脂固形物的80%。 ②组织生长、更新、修补的物质来源。动物体蛋白质每天约 0.25-0.3%更新，约6-12月全部更新。 ③参与构成酶、激素和部分维生素。酶的本质是蛋白质；含氮激素：生长激素、甲状腺素、肾上腺素、胰岛素、促肠液激素；含氮维生素：尼克酸 ④蛋白质是水生动物主要的能量来源，为鱼类提供能量，转化为脂肪和糖类：蛋白质的燃烧热值为5.654卡/克，生理热价4.4卡/克左右 ⑤参与机体免疫：抗体的成份绝大部分均为蛋白质 ⑥参与遗传信息的控制：DNA、RNA ⑦维持毛细血管的正常渗透压 ⑧运输功能：血红素 ⑨参与血凝和维持血液酸碱平衡。 3.鱼类对饲料蛋白质的利用 ①消化部位：主要在胃和小肠上部, 20%在胃,60-70%在小肠,其余在大肠。 ②吸收：部位在小肠上部，主动吸收 吸收的顺序： L-AA > D-AA Cys>Met>Try>Leu>Phe>Lys≈Ala>Ser>Asp>Glu
几种测蛋白含量方法的比较
蛋白质含量测定方法的比较及肽含量的测定 （一）蛋白质测定方法的比较（原理、优缺点）蛋白质含量测定法，目前包括定氮法、双缩脲法、福林酚法（Lowry 法）和紫 外吸收法、考马斯亮蓝法。其中考马斯亮蓝和福林酚法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10~20 倍，比双缩脲法灵敏100倍以上。定氮法较复杂，但准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。在选择方法时应该考虑：（1）实验测定要求的灵敏度和精确度；（2）蛋白质的性质；（3）溶液中存在的干扰物质；（4）测定花费时间。蛋白质含量测定法，目前包括定氮法、双缩脲法、福林酚法（Lowry 法）和紫外吸收法、考马斯亮蓝法。其中考马斯亮蓝和福林酚法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10~20 倍，比双缩脲法灵敏100倍以上。定氮法较复杂，但准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。在选择方法时应该考虑：（1）实验测定要求的灵敏度和精确度；（2）蛋白质的性质；（3）溶液中存在的干扰物质；（4）测定花费时间。 1 微量凯氏定氮法（GB 5009.5-2010） 1.1原理样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。 1.2操作方法样品经前处理、炭化、消化、蒸馏、滴定等主要步骤 1.3特点准确度较高，适用于0.2~ I.Omg氮，误差为土2%;操作复杂费时，整个过程需要耗时8~10h,试剂消耗量大。，测得结果为总氮含量，包括蛋白氮和非蛋白氮含 量;适用范围广，几乎所有样品均可用此方法。 2双缩脲比色法
消化实验方法总结
《豆粕粉碎粒度与蛋白质体外消化率的关系研究》 采用胃蛋白酶-胰酶两步法，通过体外模拟鸡体消化道内环境来比较不同粉碎力度豆粕的蛋白消化率，从而确定适合肉仔鸡生长的较适宜豆粕粉碎力度。 平均粒径采用GB 6971-86 方法，体外试验采用Boisen和Fernandez等体外模拟消化方法。胃蛋白酶最适浓度的选择 1g豆皮→100ml三角瓶+25ml磷酸缓冲液（pH=6.0 0.01M）+10ml盐酸（0.2M）→温和搅拌+1ml(15mg/ml,30mg/ml,45mg/ml,60mg/ml,75mg/ml,90mg/ml)的新鲜胃蛋白酶溶液（由0.01M HCl 配制），pH=2.0 +0.5ml抑菌剂（青霉素+链霉素）→39℃恒温水浴中震荡6h,消化后+20%黄基水杨酸5ml→室温静置30min→抽滤→干燥后残渣凯式定氮法测蛋白质含量→计算蛋白质和干物质消化率。确定最适胃蛋白酶浓度为75mg/ml. 胰酶最适浓度选择 在最适（75mg/m）胃蛋白酶液消化后的产物中加入10ml磷酸缓冲液（0.2M pH=6.8）+5mlNaoH(0.6M)+1ml(70mg/ml,90mg/ml,110mg/ml,130mg/ml,150mg/ml)的胰酶溶液（由磷酸二氢钾缓冲液配制）pH=6.8→39℃恒温水浴中震荡18h→消化后+20%磺基水杨酸5ml→室温静置30min→抽滤，干燥后残渣按照凯式定氮法测其蛋白质含量，计算粗蛋白和干物质消化率，确定最适胰酶浓度为110mg/ml。 胃蛋白酶一胰酶两步法测定过程[1] 分别称取原样和过筛豆粕于三角瓶中，4个重复，使用最适浓度测定不同粒度豆粕蛋白和干物质含量，并通过氨基酸自动分析仪测其氨基酸含量，计算粗蛋白、干物质和氨基酸消化率。 《燕麦粉添加量对面包营养组分含量和淀粉体外消化性的影响》 淀粉体外水解动力学测定 1g样品+50ml磷酸缓冲液（pH=6.9）→37℃水浴消化5min→取0.2ml消化上清液→1min 后加入1mlα-淀粉酶溶液（40mg/ml 用DNS溶液配制）→37℃水浴继续消化→每隔15min 分别取消化液0.2ml于25ml试管中+0.8ml蒸馏水+1mlDNS→沸水浴中煮沸10min→取出后+15ml蒸馏水，摇匀→空白管调零，采用3,5-二硝基水杨酸比色法测定还原糖的含量。 采用0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75、2.00、2.50 mg/m L的葡萄糖溶液绘制标准曲表2 ，根据还原糖释放量的变化比较淀粉的体外消化性。 《苦荞芽粉馒头品质及体外模拟消化研究》 甲醇提取液的制备 参照Bojana(2011)提取样品的方法并稍作修改。准确称取5g待提取的苦荞馒头样品浸没于50ml甲醇/水（80/20，v/v）溶液中，用均质机搅拌使样品破碎均质。样品液超声波提取15min，将悬浮液转移至离心管中。原样品再加入50ml甲醇/水（80/20，v/v），重复一次，合并提取液。2500r/min离心，取上清液于45℃水浴下蒸发至干，用甲醇重新溶解并定容到100ml，备用。
动物蛋白质的胃蛋白酶消化率 体外消化
动物蛋白质的胃蛋白酶消化率（体外消化） 一、适用范围： 本方法适用于动物性原料品质的判定。 二、原理： 用脱脂的样本在一个热的胃蛋白酶溶液中，稳定地不断搅拌约16小时，予以消化。测定它的蛋白质含量。这种方法不能用于植物蛋白质饲料原料或混合饲料，因为，它们所含复杂的碳水化合物是不能被胃蛋白酶消化的。将溶解了的蛋白质全部作为可消化的，并用其对粗蛋白质的百分率来表示。 三、设备： 1、恒温水浴振荡器：45±2℃。 2、测定粗蛋白质的全套设备。 3、过滤装置。 4、索氏脂肪浸提器。 四、试剂： 除测定粗蛋白质用的试剂外，尚需以下试剂： 1、%胃蛋白酶溶液的配制：先稀释盐酸到1L。在使用前，现配%胃蛋白酶溶液。 2、所有胃蛋白酶应具有1：3000的活性。 3、加热稀盐酸至42—45℃，然后加入胃蛋白酶2g,轻轻地搅动，使其溶解（此时不要加热！）。即得在L盐酸中的%胃蛋白酶溶液。 五、测定步骤： 1、准确称取1g脱脂试样，放入300ml碘量瓶内，加入经过预热（42—45℃）的%胃蛋白酶溶液150ml，盖好塞子，在45℃下边搅拌边消化16小时，消化后用滤纸过滤，然后用温水洗净滤纸上的不消化物。将不消化物连同滤纸转入消化管中，按照测定粗蛋白质含量的方法，测定不消化物中的粗蛋白质含量。 2、另取1份脱脂分析试样，按照测定粗蛋白质含量的方法，测定其粗蛋白质含量。然后，根据消化的和不消化的粗蛋白质含量计算出试样的胃蛋白酶消化率。 六、测定结果计算与分析： 1、计算： 动物蛋白质胃蛋白酶消化率（%）= A-B ×100 A 式中：A—试样中粗蛋白质的含量（%）。 B—试样中的不消化物粗蛋白质的含量（%）。
蛋白质的测定方法比较
蛋白质的测定方法比较 一、分光光度法 1、测定原理： 食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解，分解产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，在pH 4.8 的乙酸钠-乙酸缓冲溶液中与乙酰丙酮和甲醛反应生成黄色的3,5-二乙酰-2,6-二甲基-1,4-二氢化吡啶化合物。在波长400 nm 下测定吸光度值，与标准系列比较定量，结果乘以换算系数，即为蛋白质含量。 2、测定步骤： ①试样消解：称取经粉碎混匀过40目筛的固体试样0.1g～0.5g（精确0.001g）、半固体试样0.2g～1g（精确至0.001g）或液体试样1g～5g（精确0.001g），移入干燥的100 mL 或250 mL 定氮瓶中，加入0.1 g硫酸铜、1 g 硫酸钾及5 mL 硫酸，摇匀后于瓶口放一小漏斗，将定氮瓶以45°角斜支于有小孔的石棉网上。缓慢加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热半小时。取下放冷，慢慢加入20 mL 水，放冷后移入50 mL 或100 mL容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。按同一方法做试剂空白试验。 ②试样溶液的制备：吸取2.00 mL～5.00 mL 试样或试剂空白消化液于50 mL 或100 mL 容量瓶内，加1 滴～2 滴对硝基苯酚指示剂溶液，摇匀后滴加氢氧化钠溶液中和至黄色，再滴加乙酸溶液至溶液无色，用水稀释至刻度，混匀。 ③标准曲线的绘制：吸取0.00 mL、0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL 和1.00 mL 氨氮标准使用溶液（相当于0.00μg、5.00μg、10.0μg 、20.0μg、40.0μg、60.0μg、80.0μg 和100.0μg 氮），分别置于10 mL 比色管中。加4.0 mL 乙酸钠-乙酸缓冲溶液及4.0 mL 显色剂，加水稀释至刻度，混匀。置于100 ℃水浴中加热15 min。取出用水冷却至室温后，移入1 cm 比色杯内，以零管为参比，于波长400 nm 处测量吸光度值，根据标准各点吸光度值绘制标准曲线或计算线性回归方程。 ④试样测定：吸取0.50 mL～2.00 mL（约相当于氮＜100μg）试样溶液和同量的试剂空白溶液，分别于10 mL 比色管中。以下按上述中“加4 mL 乙酸钠-乙酸
蛋白质含量测定方法比较
蛋白质含量测定主要有五种方法，分别是凯式定氮法、双缩脲法、紫外吸收法、酚试剂法和考马斯亮蓝法。这五种方法各有特点，优缺点明确。 凯氏定氮法 蛋白质是含氮的化合物。食品与浓硫酸和催化剂共同加热消化，使蛋白质分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，留在消化液中，然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后，再用盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量来乘以蛋白质换算系数，即得蛋白质含量。因为食品中除蛋白质外，还含有其它含氮物质，所以此蛋白质称为粗蛋白。 优点：重现性好，是目前分析有机化合物含氮量常用的方法,是一种蛋白质测定的经典方法, ,测试结果准确。 缺点：操作比较繁复，费时,试剂消耗量大。且此法测定的蛋白质含量实际上包括了核酸，生物碱，含氮类脂，卟啉，含氮色素等非蛋白质含氮化合物。双缩脲定氮法 双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1~10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。 优点：较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋
白质测定。 缺点：不太灵敏；不同蛋白质显色相似。 紫外吸收定氮法 双缩脲法是传统的分光光度法测定蛋白质的方法,当含有两个或者两个以上肽键的物质和碱性的硫酸铜反应时,形成紫色的络合物,这个颜色产物是肽键中的氮原子和铜离子配价结合的结果。蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。形成颜色产物的量取决于蛋白质的浓度。实际测定时,必须预先用标准蛋白质溶液制作一个标准校正曲线,通常用牛血清白蛋白水溶液做蛋白质标准溶液。不同浓度的标准蛋白质溶液加入双缩脲试剂后,反应生成的颜色产物用紫外-可见分光光度计在540nm 波长下测定吸光度,以双缩脲试剂加缓冲或水作空白对照。然后将测得的值分别对蛋白浓度(mg/ ml) 作图,得标准曲线。未知蛋白样品用双缩脲试剂做同样处理,根据测得吸光度值在标准曲线上直接查得未知蛋白质样品中得蛋白质浓度。 优点：对各种蛋白质呈色基本相同;特异性和准确度好,精密度好;呈色稳定性好,试剂单一,方法简便。快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。 缺点：准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表，再进行计算的方法，加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测定的结果还是存在一定的误差。此外，进行紫外
几种蛋白原料的体外消化率的测定方法的比较
几种蛋白原料的体外消化率的测定方法的比较 摘要：试验分别采用胃蛋白酶-胰蛋白酶两步法、肉食性鱼类（如鲈鱼）消化道粗酶提取液消化法和草食性鱼类（如草鱼）消化道粗酶提取液消化法测定了酪蛋白、鱼粉、豆粕、菜籽粕、棉籽粕、酵母粉和玉米蛋白粉等7种蛋白质原料的体外消化率。3种测定方法中，鱼粉的消化率差异不显著（P>0.05）；豆粕、菜籽粕、酵母粉和玉米蛋白粉用两步法和草鱼消化酶法测定的消化率无显著差异（P>0.05）；棉籽粕消化率用两步法测定值高于用消化酶法的测定值，差异极显著（P<0.01）；豆粕、菜籽粕、酵母粉和玉米蛋白粉的消化率用两步法比用鲈鱼消化酶测定的值高，差异极显著（P<0.01）；草鱼消化酶法和鲈鱼消化酶法对酪蛋白的消化率无显著差异（P>0.05），而对于豆粕、菜籽粕、棉籽粕、酵母粉和玉米蛋白粉草鱼消化酶法测定值高于鲈鱼消化酶法的测定值，差异极显著（P<0.01）。结果表明，胃蛋白酶-胰蛋白酶两步体外消化法在测定鱼粉蛋白质消化率时可替代鱼类消化液粗酶消化法，对其它蛋白质原料使用该方法应慎重。 关键词：蛋白质饲料；体外消化率；测定方法 消化率是动物从食物中所消化吸收的部分占总摄入量的百分比，是评价饲料营养价值的重要指标之一。测定饲料消化率主要有两种方法：体外法和体内法。体内法测定的消化率能够比较真实的反映鱼类对饲料的消化情况。但体内法测定方法复杂、时间长、费用高，而且对外界环境的要求较高，季节、温度、光照等都会影响消化率测定值。体外消化法是利用精制的消化酶或研究对象的消化道酶提取液在试管内进行的消化试验，其测定值可近似反映鱼对饲料的消化率。此法能快速测定原料的相对利用率，为营养师制作配方提供参考[1]。然而，体外消化法无法反映体内消化的真实情况。Boisen和Eggum（1991）在胃蛋白酶-胰蛋白酶两步法中利用标准过滤装置测得饲料蛋白质消化率与鼠和猪的真消化率十分接近，他们认为这种方法测得的蛋白质体外消化率经内源氮校正与回肠末端蛋白质表观消化率高度相关。我国饲料原料品种多，营养成分含量差异大，加工方式各异，饲料原料对不同鱼类的营养价值差异更大。由于鱼类生活在水中，测定鱼类饲料真消化率比测定畜禽的更加困难。所以寻找一种准确、简便、实用的消化率测定方法对评价鱼类饲料的消化率有着十分重要的意义。本试验采用胃蛋白酶-胰蛋白酶两步体外消化法以及从肉食性和草食性鱼类的消化道提取消化酶在体外消化饲料的方法，测定了7种常用蛋白质饲料原料的消化率，为饲料生产者配制鱼用饲料提供基础数据，同时为体外测定鱼用蛋白质原料消化率提供参照。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 饲料原料 酪蛋白、鱼粉、豆粕、菜籽粕、棉籽粕、酵母粉和玉米蛋白粉，均为经105℃烘干处理的样品，粉碎过60目筛后保存备用。 1.1.2 主要试剂 硫酸（GB 625—77）、硫酸铜（GB 665—78）、硫酸钾（HG 3—920—76）和氢氧化钠（GB 629—77），均为分析纯。 硼酸（GB 628-78）（分析纯）：2g溶于100ml水配成2%溶液（W/V）。 混合指示剂：甲基红（HG 3—958—76）0.1%乙醇溶液，溴甲酚绿（HG 3—1220—79）0.5%乙醇溶液，两溶液等体积混合，阴凉处保存期三个月以内。0.05mol/l HCl溶液：取4.2ml浓盐酸，用蒸馏水定容至1L。 标定甲基红-溴甲酚绿混合指示剂：取20 ml 0.1%甲基红酒精溶液，与20ml 0.5%溴甲酚绿酒精溶液，混匀。
利用DAISYII体外模拟培养法测定真消化率
利用DAISY II 体外模拟培养法测定真消化率 A. 试剂 a) 缓冲溶液A：g/L KH2PO4 10.0 MgSO4?7H2O 0.5 NaCl 0.5 CaCl2?2H2O 0.1 尿素(试剂级) 0.5 b) 缓冲溶液B：g/L Na2CO3 15.0 Na2S?9H2O 1.0 c) 瘤胃液接种物。 d) 30 g/L十二烷基硫酸钠（中性洗涤剂）溶液。 称取18.61 g乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA,化学纯)和6.81g四硼酸钠(Na2B4O7·10H2O)同放入1 000 mL烧杯中,加少量水加热溶解后,再加入30 g十二烷基硫酸钠和10 mL乙二醇乙醚。称取4.65 g无水磷酸氢二钠，置于另一烧杯中， 加少量水，微微加热溶解后倾于第一个烧杯中，稀释至1 000 mL。此溶液pＨ在6.9~7.0左右（一般不需调整）。 (c) 无水亚硫酸钠（Na2SO3）。 (d) 丙酮：无色，并且蒸发后无残渣。 B.设备 a) DAISYII 体外模拟培养箱 b) 过滤装置- ANKOM F57滤袋 c) 封口机 d) 量筒– 1 L & 500 mL e) 热水瓶–2个 f) 过滤用奶酪布 g) ANKOM 220 纤维素分析仪
C. 步骤 a) 滤袋和样品准备 1)将F57 滤袋在丙酮中浸泡3-5 min，然后放在通风橱中自然干燥。用丙酮浸泡的目的是除掉表面剂，否则会影响微生物消化。对每个F57 滤袋称重，记录质量(m1)。将天平归零，并向滤袋中直接称取0.25 g 样品 (m) 注：进行48 h消化研究时，样品量也可以为0.5 g。然而，最近研究表明样品量为0.25 g 时测定结果更准确。 2) 将每个滤袋封口，并防入Daisy II体外模拟培养箱消化罐中(每个罐中最多可以放25 样品)。样品应平衡分布在消化罐分隔的两边。同时至少包括一个空白滤袋，用于确定测定结果校正因子(C1)。 b) 混合缓冲溶液准备(每个消化罐) 1) 将缓冲溶液A和B进行预热(39°C)。在容器中先加缓冲溶液A1330 ml，然后向其中加266 ml缓冲溶液B（比例为1:5)。缓冲溶液A和B的用量要准确，以确保39°C混合溶液的pH 为6.8。向每个装有样品滤袋的消化罐中加1600 ml 混合缓冲溶液。 2) 将装有样品和缓冲溶液的消化罐放入Daisy II 体外模拟培养箱，打开加热和搅拌(红色开关为电源)。让消化罐温度平衡至少20-30 min。同时收集准备瘤胃接种物。 c) 接种物准备与培养 所有的玻璃器皿要保持在 39°C。 1) 向2个热水瓶中加入39° C 水对其进行预热。在收集瘤胃液前将热水倒掉。采用适宜的 采集步骤，取至少2000 ml 瘤胃液，放入热水瓶中。 2) 将瘤胃液从热水瓶中倒出，放到混合器中。向混合器的容器中冲入CO2 气体并快速混合30。混合的目的是防止微生物黏附，确保用于体外消化微生物代表性。将混合好的瘤胃液用4层奶酪布过滤到5升容量瓶中(预热39° C)。 用四层新的奶酪布过滤将其他热水瓶中的瘤胃液过滤到同一个5升容量瓶中。容量瓶要持续充CO2。 3) 用量筒量取400 ml 瘤胃培养物。从Daisy II 体外模拟培养箱中取出一个消化罐，向缓冲溶液和样品中加入量取好的400ml 培养物。然后向消化罐中充CO2 气体30秒，然后盖好盖子。 4) 所有用到的消化罐都按照上述步骤重复操作。注意：不要让CO2气体通过缓冲后的
几种蛋白质含量测定方法的比较
几种蛋白质含量测定方法的比较 【摘要】：蛋白质含量测定方法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析之一。目前常 用的方法有凯氏定氮法、双缩脲法(Biuret)、紫外吸收法、考马斯亮蓝法（Bradford），Folin —酚试剂法（Lowry）杜马斯燃烧法。其中Bradford 法灵敏度颇高，比紫外吸收法灵敏10～20 倍,比Biuret法灵敏100 倍以上。凯氏定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。过去Folin—酚试剂法法是应用最广泛的一种方法，由于其试剂乙的配制较为困难（现在已可以在本公司订购），近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。测定农产品中全氮的凯氏定氮法在许多国家已被杜马斯然烧定氮法所代替，杜马斯燃烧法是基于在高温下(大约 900 ℃），通过控制进氧量、氧化消解样品的原理而进行氮测定的。这6种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，每种方法都有其优缺点，在选择方法时应考虑：⑴实验对测定所要求的灵敏度和精确度；⑵蛋白质的性质；⑶溶液中存在的干扰物质；⑷测定所要花费的时间 【关键词】：凯氏定氮法双缩脲法紫外吸收法考马斯亮蓝法 Folin—酚试剂法杜马斯燃烧法 一、凯氏定氮法 1.1原理 凯氏定氮法测定蛋白质分为样品消化、蒸馏、吸收和滴定4 个过程。其原理是样品中含氮有机化合物与浓硫酸在催化剂作用下共热消化，含氮有机物分解产生氨,氨又与硫酸作用,变成硫酸铵。然后加碱蒸馏放出氨, 氨用过量的硼酸溶液吸收,再用盐酸标准溶液滴定求出总氮量换算为蛋白质含量。 1.2特点 凯氏定氮法是目前分析有机化合物含氮量常用的方法，是测定试样中总有机氮最准确和最简单的方法之一，被国际国内作为法定的标准检验方法。凯氏定氮法样品的最佳消化条件为硫酸铜2.50 g, 硫酸钾0.10 g,浓硫酸4.00 mL；硫酸铜的用量为影响消化时间的主要因素,硫酸钾和浓硫酸用量为第二和第三主要因素；用此最佳条件做实验, 消化时间仅为12 min；与其他硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸用量方法对比,该法所需消化时间最短,试剂用量减少,可降低实验成本,也降低了对环境的污染。 凯氏定氮法适用范围广泛，测定结果准确,重现性好，但操作复杂费时,试剂消耗量大。若采用模块式消化炉代替传统的消化装置, 可同时测定几份样品，节省时间,提高了工作效率，适用于批量蛋白质的测定,具有准确、快速、简便、低耗、稳定的优点。 二、双缩脲法(Biuret ) 2.1原理 双缩脲(NH3CONHCONH3)是两个分子脲经180 ℃左右加热,放出1 个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中,双缩脲与CuSO4 形成紫色络合物,称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键,或能够以1 个中间碳原子相连的肽键,这类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关,故可用来测定蛋白质含量。
动物性蛋白质饲料胃蛋白酶消化率的测定
动物性蛋白质饲料胃蛋白酶消化率的测定 Hessen was revised in January 2021
动物性蛋白质饲料 胃蛋白酶消化率的测定过滤法 参考标准：GB/T 17811-2008 一、适用范围 二、实验原理 已脱过脂的试样,用温热的胃蛋白酶溶液(酶液浓度和用量与酶解试样质量恒定),在恒温、持续不断地振摇或搅拌下消化16小时,过滤分离不溶性残渣,洗涤、干燥,测定残渣的粗蛋白质含量。同时测定空白和脱脂未酶解试样的粗蛋白质含量。 三、实验用品
三、实验内容
照上法振摇和倒出。检查瓶子，并用丙酮再次洗涤。当全部液体通过滤纸后,用洗瓶以少量丙酮洗涤漏斗壁上残渣两次,并抽干。从布氏漏斗上小心取下载有残渣的滤纸(用滤纸将残渣包裹好),无损地移入100烧杯中并置于105℃烘箱内烘干。 5 粗蛋白质 的测定将上述已烘干的滤纸包无损地移入 凯氏烧瓶中，按《FOSS 定氮仪测 定饲料中粗蛋白含量的方法》测定 残渣粗蛋白质的质量分数（ω 2 ）。同时，称取脱脂风干的样品 0.3 g（精确至0.0002 g），直接 按《FOSS 定氮仪测定饲料中粗蛋 白含量的方法》测定脱脂未酶解的 样品中粗蛋白质的质量分数（ω 1 ）。 测定残渣粗蛋白质时应从每个 样品残渣粗蛋白质中减去酶液 的空白值。 6 计算X- 试样胃蛋白酶消化率，以质 量分数计（%）； ω 1 - 脱脂未酶解的样品中粗蛋 白质的质量分数（%）； ω 2 - 脱脂酶解后的残渣中粗蛋 白质的质量分数（%）。 重复性：1每个试样脱脂风干后取两份试料进行酶解，平行测定残渣粗蛋白质的质量分数，以其算术平均值为测定结果（保留三位有效数字），测定结果的相对≤6%； 2 每个试样脱脂风干后取两份试料进行平行测定粗蛋白质的质量分数，以其 粗蛋质含量允许相对偏差 >25% 1％ 10% 食物蛋白质消化率 食物蛋白质消化率(digestibility)是反映食物蛋白质在消化道内被分解和吸收的程度的一项指标；是指在消化道内被吸收的蛋白质占摄入蛋白质的百分数；是评价食物蛋白质营养价值的生物学方法之一。一般采用动物或人体实验测定，根据是否考虑内源粪代谢氮因素，可分为表观消化率和真消化率两种方法。(一)蛋白质(N)表观消化率[apparent protein(N)digestibilitvl即不计内源粪氮的蛋白质消化率。通常以动物或人体为实验对象，在实验期内，测定实验对象摄人的食物氮(摄入氮)和从粪便中排出的氮(粪氮)，然后按下式计算： 蛋白质(N)表观消化率(％)=(I-F)／I×100 式中l 代表摄入氮，F 代表粪氮 (二)蛋白质(N)真消化率[true protein(N)digestibility] 考虑粪代谢时的消化率。粪中排出的氮实际上有两个来源。一是来自未被消化吸收的食物蛋白质；二是来自脱落的肠粘膜细胞以及肠道细菌等所含的氮。通常以动物或人体为实验对象，首先设置无氮膳食期，即在实验期内给予无氮膳食，并收集无氮膳食期内的粪便，测定氮含量，无氮膳食期内的粪氮即粪代谢氮。成人24 小时内粪代谢氮一般为0.9～1.2g；然后再设置被测食物蛋白质实验期，实验期内摄取被测食物，再分别测定摄人氮和粪氮。从被测食物蛋白质实验期的粪氮中减去无氮膳食期的粪代谢氮，才是摄人食物蛋白质中真正未被消化吸收的部分，故称蛋白质(N)真消化率。计算公式如下： 蛋白质(N)真消化率(％)=I-(F-Fk)／I×100 式中I 代表摄入氮，F 代表粪氮，Fk 代表粪代谢氮由于粪代谢氮测定十分繁琐，且难以准确测定，故在实际工作中常不考虑粪代谢氮，特别是当膳食中的膳食纤维含量很少时，可不必计算Fk；当膳食中含有多量膳食纤维时，成年男子的Fk 值，可按每天12mgN／kg 体重计算。 食物蛋白质消化率受到蛋白质性质、膳食纤维、多酚类物质和酶反应等因素影响。一般来说，动物性食物的消化率高于植物性食物。如鸡蛋、牛奶蛋白质的消化率分别为97％、95％，而玉米和大米蛋白质的消化率分别为85％和88％。 分析化学 结课作业 常见蛋白质测定方法的总结与比较 材料科学与技术学院 林化13-1班 刘旺衢 130534106 常见蛋白质测定方法的总结与比较 刘旺衢 （北京林业大学材料科学与技术学院林化13-1班 130534106，10083） 蛋白质是构成生物体细胞组织的重要成分。食物中的蛋白质是人体中氮的唯一来源。具有糖类和脂肪不可替代的作用。蛋白质与营养代谢、细胞结构、酶、激素、病毒、免疫、物质运转、遗传等密切相关,是对人类最重要的物质之一。准确精密的测定蛋白质，关乎人类的生产、生活、生存。目前测定蛋白质含量的方法有多种,如凯氏定氮法、紫外吸收法、双缩脲法、考马斯亮蓝染色法、酚试剂法等几种方法,下面本文将总结比较这五种蛋白质的测定方法。 一、凯氏定氮法 凯氏定氮法是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。即在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气馏出并为过量的酸液吸收，再以标准酸滴定，就可计算出样品中的氮量。由于蛋白质含氮量比较恒定，可由其氮量计算蛋白质含量，故此法是经典的蛋白质定量方法。蛋白质是含氮的有机化合物。蛋白质与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数计算蛋白质含量，即含氮量*6.25=蛋白含量。 凯氏定氮法具有灵敏度高, 样品用量少，最低可检出0.05mg氮；精密度、准确度高,平行误差一般小于0.5%；应用范围广,适用于一切形态的食品与生物样品；仪器装置简单,试剂廉价的优点。 但也存在操作比较繁琐费时,特别是蒸馏定氮过程的效率低,不利于大批样品的测定；定氮的结果既包括有机氮,也包括无机氮,有机氮中除蛋白氮外,还包括非蛋白氮,测定的结果只能是粗蛋白质的含量；在蛋白质氨基酸构成有差异的 蛋白质消化率 蛋白质消化率是指一种食物蛋白质可被消化酶分解的程度。蛋白质消化率越高，被人体吸收利用的可能性越大，营养价值也越高。蛋白质消化率的计算方法：蛋白质消化率=蛋白质中被消化吸收的氮的数量/食物中含氮总量*100% 比如，在日常生活中，大豆类产品，如豆腐和豆浆中的蛋白质消化率都很高 2012年营养师报考条件最新更新https://www.360docs.net/doc/955101640.html, 世纪合众营养学院提供营养保健师报考条件点击了解营养保健师报考条件400-66.. 定氮仪/凯氏定氮仪https://www.360docs.net/doc/955101640.html, 上海勇规自主研发生产销售凯氏定氮仪,不外排SO2,为企业量身打造更经济适用! 百度推广食物蛋白质消化率(digestibility)是反映食物蛋白质在消化道内被分解和吸收的程度的一项指标;是指在消化道内被吸收的蛋白质占摄入蛋白质的百分数;是评价食物蛋白质营养价值的生物学方法之一.一般采用动物或人体实验测定,根据是否考虑内源粪代谢氮因素,可分为表观消化率和真消化率两种方法. 1蛋白质表观消化率[apparent protein(N) digestibility] 即不计内源粪的蛋白质消化率,通常以动物或人体为实验对象,在实验期内,测定实验对象摄入的食物氮和从粪便中排出的氮,然后计算:蛋白质表观消化率(%)=(I-F)/I*100 式中I代表摄入氮,F代表粪氮 2蛋白质真消化率[true protein digestibility] 考虑粪代谢时的消化率,粪中排出的氮实际上有两个来源.一是来自未被消化吸收的食物蛋白质;二是来自脱落的肠粘膜细胞以及肠道细菌等所含的氮.通常以动物或人体为实验对象,首先设置无氮膳食期,即在实验期内给予无氮膳食.成人24小时内粪代谢氮一般为0.9-1.2g;然后再设置被测食物蛋白质实验期,实验期内摄取被测食物,再分别测定摄入氮和粪氮.从被测食物蛋白质实验期的粪氮中减去无氮膳食期的粪代谢氮,才是摄入氮和粪氮.从被测食物蛋白质实验期的粪氮中减去无氮膳食期的粪代谢氮,才是摄入食物蛋白质中真正未被消 1．蛋白质的常规检测方法 凯氏（Kjeldahl ）定氮法 一种最经典的蛋白质检测方法。 原理：样品中含氮有机化合物与浓硫酸在催化剂作用下共热消化, 含氮有机物分解产生氨, 氨又与硫酸作用变成硫酸铵。然后加碱蒸馏放出氨, 氨用过量的硼酸溶液吸收, 再用盐酸标准溶液滴定求出总氮量换算为蛋白质含量。 优点：范围广泛、测定结果准确、重现性好 缺点：操作复杂费时、试剂消耗量大 双缩脲法 常用于需要快速但并不需要十分精确的蛋白质检测。 原理：双缩脲（NHCONHCONH是3分子的脲经180C左右加热，放出1分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与硫酸铜形成紫色络合物（肽键中的氮原子和铜离子配价结合），称为双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，因此可用来测定蛋白质含量。 测定范围：1~10mg（有的文献记载为1~20mg） 优点：较快速，干扰物质少，不同蛋白质产生的颜色深浅相近 缺点：①灵敏度差； ② 三羟甲基氨基甲烷、一些氨基酸和EDTA等会干扰该反应。 Folin- 酚试剂法 原理：Folin- 酚法的原理与双缩脲法大体相同，利用蛋白质中的肽键与铜结合产生双缩脲反应。同时也由于Folin- 酚试剂中的磷钼酸- 磷钨酸试剂被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深蓝色的钼蓝和钨蓝的混合物。在一定的条件下, 蓝色深度与蛋白的量成正比，由此可测定蛋白质的含量。 测定范围：20~250ug 优点：灵敏度高，对水溶性蛋白质含量的测定很有效 缺点：①费时，要精确控制操作时间； ②Folin -酚法试剂的配制比较繁琐，且酚类和柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨 酸、糖类、甘油、还原剂（二硫代苏糖醇、巯基乙醇）、EDTA和脲素均会干扰反应。 紫外吸收法 原理：蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基使其在280nm 处具有紫外吸收，其吸光度与蛋白质含量成正比）。此外，蛋白质溶液在280nm的吸光度值与肽键含量成正比，利用一定波长下蛋白质溶液的吸光度值与蛋白质浓度的正比关系可以测定蛋白质含量。 优点：简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后能回收。 缺点：①测定蛋白质含量的准确度较差，专一性差； ②干扰物质多，若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等能吸收紫外光的物质，会出现较 大的干扰。 定氮法、双缩脲法、Filon- 酚试剂法和紫外吸收法为常用的 4 种古老的经典方法。 1.5 考马斯亮蓝法 原理：染料考马斯亮蓝G-250 在酸性溶液中与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）及芳香族氨基酸残基相结合，使染料最大吸收峰的位置由465nm变为595nm,溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色，在595nm下测定的吸光度值与蛋白质浓度呈正比。 优点：灵敏度高，测定快速、简便，干扰物质少，不受酚类、游离氨基酸和缓冲剂、络合剂的影响，适合大量样品的测定。 缺点：由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同有较大的偏 ，因此用于不同蛋白质测定时 差。 蛋白质的生理功能 (1）构成和修复组织 蛋白质是构成机体组织、器官的重要成分，人体各组织、器官无一不含蛋白质。在人体的瘦组织中，如肌肉组织和心、肝、肾等器官均含有大量蛋白质；骨骼、牙齿、乃至指、趾也含有大量蛋白质；细胞中，除水分外，蛋白质约占细胞内物质的80％。因此，构成机体组织、器官的成分是蛋白质最重要的生理功能。身体的生长发育可视为蛋白质的不断积累过程。蛋白质对生长发育期的儿童尤为重要。 人体内各种组织细胞的蛋白质始终在不断更新。例如，人血浆蛋白质的半寿期约为10天，肝中大部分蛋白质的半寿期为1～8 天，某些蛋白质的半寿期很短，只有数秒钟。只有摄入足够的蛋白质方能维持组织的更。身体受伤后也需要蛋白质作为修复材料。 (2) 调节生理功能 机体生命活动之所以能够有条不紊的进行，有赖于多种生理活性物质的调节。而蛋白质在体内是构成多种重要生理活性物质的成分，参与调节生理功能。如核蛋白构成细胞核并影响细胞功能；酶蛋白具有促进食物消化、吸收和利用的作用；免疫蛋白具有维持机体免疫功能的作用；收缩蛋白，如肌球蛋白具有调节肌肉收缩的功能；血液中的脂蛋白、运铁蛋白、视黄醇结合蛋白具有运送营养素的作用；血红蛋白具有携带、运送氧的功能；白蛋白具有调节渗透压、维持体液平衡的功能；由蛋白质或蛋白质衍生物构成的某些激素，如垂体激素、甲状腺素、胰岛素及肾上腺素等等都是机体的重要调节物质。 (3) 供给能量 蛋白质在体内降解成氨基酸后，经脱氨基作用生成的仅一酮酸，可以直接或间接经三羧酸循环氧化分解，同时释放能量，是人体能量来源之一。但是，蛋白质的这种功能可以由碳水化合物、脂肪所代替。因此，供给能量是蛋白质的次要功能。 6、食物蛋白质的营养评价 （1）食物蛋白质含量 食物蛋白质含量是评价食物蛋白质营养价值的一个重要方面。蛋白质含氮量比较恒定，故测定食物中的总氮乘以蛋白质折算系数6.25，即得蛋白质含量。 （2）食物蛋白质消化率 食物蛋白质消化率是反映食物蛋白质在消化道内被分解和吸收的程度的一项指标；是指在消化道内被吸收的蛋白质占摄入蛋白质的百分数；是评价食物蛋白质营养价值的生物学方法之一。一般采用动物或人体实验测定，根据是否考虑内源粪代谢氮因素，可分为表观消化率和真消化率两种方法。 1) 蛋白质表观消化率 即不计内源粪氮的蛋白质消化率。通常以动物或人体为实验对象，在实验期内，测定实验对象摄人的食物氮(摄入氮)和从粪便中排出的氮(粪氮)，然后按下式计算：蛋白质(n)表观消化率(％)=(i-f)／i×100 式中l 代表摄入氮，f 代表粪氮 2) 蛋白质(n)真消化率 考虑粪代谢时的消化率。粪中排出的氮实际上有两个来源。一是来自未被消化吸收的食物蛋白质；二是来自脱落的肠粘膜细胞以及肠道细菌等所含的氮。通常以动物或人体为实验对象，首先设置无氮膳食期，即在实验期内给予无氮膳食，并收集无氮膳食期内的粪便，测定氮含量，无氮膳食期内的粪氮即粪代谢氮。成人24 小时内粪代谢氮一般为0.9～1.2g；然后再设置被测食物蛋白质实验期，实验期内摄取被测食物，再分别测定摄人氮和粪氮。从被测食物蛋白质实验期的粪氮中减去无氮膳食期的粪代谢氮，才是 . 蛋白质含量测定主要有五种方法，分别是凯式定氮法、双缩脲法、紫外吸收法、酚试剂法和考马斯亮蓝法。这五种方法各有特点，优缺点明确。 凯氏定氮法 蛋白质是含氮的化合物。食品与浓硫酸和催化剂共同加热消化，使蛋白质分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，留在消化液中，然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后，再用盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量来乘以蛋白质换算系数，即得蛋白质含量。因为食品中除蛋白质外，还含有其它含氮物质，所以此蛋白质称为粗蛋白。 优点：重现性好，是目前分析有机化合物含氮量常用的方法,是一种蛋白质测定的经典方法, ,测试结果准确。 缺点：操作比较繁复，费时,试剂消耗量大。且此法测定的蛋白质含量实际上包括了核酸，生物碱，含氮类脂，卟啉，含氮色素等非蛋白质含氮化合物。 双缩脲定氮法 双缩脲（NHCONHCONH）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个33分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO形成紫色络合物，称4为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1~10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。 优点：较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的 缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋1 / 5 . 白质测定。 缺点：不太灵敏；不同蛋白质显色相似。 紫外吸收定氮法 双缩脲法是传统的分光光度法测定蛋白质的方法,当含有两个或者两个以上肽键的物质和碱性的硫酸铜反应时,形成紫色的络合物,这个颜色产物是肽键中的氮原子和铜离子配价结合的结果。蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。形成颜色产物的量取决于蛋白质的浓度。实际测定时,必须预先用标准蛋白质溶液制作一个标准校正曲线,通常用牛血清白蛋白水溶液做蛋白质标准溶液。不同浓度的标准蛋白质溶液加入双缩脲试剂后,反应生成的颜色产物用紫外-可见分光光度计在540nm 波长下测定吸光度,以双缩脲试剂加缓冲或水作空白对照。然后将测得的值分别对蛋白浓度(mg/ ml) 作图,得标准曲线。未知蛋白样品用双缩脲试剂做同样处理,根据测得吸光度值在标准曲线上直接查得未知蛋白质样品中得蛋白质浓度。 优点：对各种蛋白质呈色基本相同;特异性和准确度好,精密度好;呈色稳定性好,试剂单一,方法简便。快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。 缺点：准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表，再进行计算的方法，加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测定的结果还是存在一定的误差。此外，进行紫外吸收 蛋白质分子量测定方法的比较 梁永达 （复旦大学药学院，上海） 摘要：分子量是蛋白质主要的特征参数之一，近年来其测试方法发展十分迅速。该文概述了目前蛋白质分子量测定中最常用的几种方法，包括粘度法、凝胶过滤层析法、凝胶渗透色谱法、SDS-凝胶电泳法、渗透压法、电喷雾离子化质谱技术、基质辅助激光解吸电离质谱技术、光散射法、超速离心沉降法，并比较了这几种方法的优缺点。 关键词：蛋白质分子量粘度法凝胶过滤层析法凝胶渗透色谱法SDS-凝胶电泳法渗透压法电喷雾离子化质谱技术基质辅助激光解吸电离质谱技术光散射法超速离心沉降法 Comparison of the methods of molecular weight determination of proteins LiangYongda (School of Pharmacy in Fudan University, Shanghai) Abstract: Molecular weight is one of the most important characteristic parameters of proteins，which leads the methods to determine protein molecular weight to develope rapidly in recent years. In this paper，the mechanism and application are briefly overviewed for the most widely used technologies including viscosity method, gel filtration chromatography, gel permeation chromatography, SDS-gel electrophoresis, osmotic pressure method, electrospray ionization mass spectrometry, matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry, light scattering, ultracentrifugation sedimentation. Plus, we compare these methods’advantages and disadvantages. Key words:molecular weight determination of proteins, viscosity method, gel filtration chromatography, gel permeation chromatography, SDS-gel electrophoresis, osmotic pressure method, electrospray ionization mass spectrometry, matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry, light scattering, ultracentrifugation sedimentation 分子量是蛋白质的主要特征参数之一，当发现一种新的蛋白质时，首先应准确测定其分子量。蛋白质分子量的测定方法有多种，以下将对实验室最常用的几种方法进行介绍： 1.粘度法 一定温度条件下，高聚物稀溶液的粘度与其分子量之间呈正相关性，随着分子量的增大，聚合物溶液的粘度增大。通过测定高聚物稀溶液粘度随浓度的变化，即可计算出其平均分子量(粘均分子量)。 如果高聚物分子的分子量愈大，则它与溶剂间的接触表面也愈大，摩擦就大，表现出的特性粘度也大。特性粘度和分子量之间的经验关系式为： 式中，M 为粘均分子量；K为比例常数；α是与分子形状有关的经验参数。K和α值与温度、食物蛋白质消化率
常见蛋白质测定方法的总结与比较
蛋白质消化率
蛋白质各种定量方法的优缺点的比较
蛋白质及消化率
蛋白质含量测定方法比较
蛋白质分子量测定方法的比较