2株高产蛋白微藻细胞代谢物的比较
索罗金小球藻异养转自养过程中基因表达的全局调控
doi: 10.7541/2021.2020.066索罗金小球藻异养转自养过程中基因表达的全局调控祝棉棉1, 2赵 亮1张 虎1, 2王红霞1胡 强1韩丹翔1(1. 中国科学院水生生物研究所微藻生物能源与生物技术研发中心, 武汉 430072; 2. 中国科学院大学, 北京 100049)摘要: 为提高异养条件下索罗金小球藻(Chlorella sorokiniana )蛋白质含量, 扩大该藻株在食品和饲料领域的应用, 研究发现当异养条件下培养的C. sorokiniana GT-1细胞转入光自养培养条件后, 蛋白质含量显著提高。
通过转录组学分析揭示了C. sorokiniana GT-1在异养转自养过程中基因表达发生全局变化, 其中糖酵解途径与磷酸戊糖途径上调, 氮转运和同化途径中的关键酶的编码基因明显上调, 且谷氨酸族氨基酸和丙酮酸族氨基酸的生物合成途径的多个酶在转录水平上显著增强。
研究还发现在异养条件下藻细胞仍然可以表达部分光合作用蛋白的编码基因, 当转入光自养条件后24h 内绝大多数光合作用相关蛋白编码基因的转录被激活。
结果表明在异养转自养条件过程中蛋白质含量的升高与氮的吸收及利用增加、还原能合成的增强、部分氨基酸的合成上调及光合作用蛋白质的大量合成有关。
研究为后续如何通过培养条件优化或代谢工程改造提高C. sorokiniana GT-1产蛋白质的能力提出了新的思路。
关键词: 小球藻; 蛋白质; 营养转换; 代谢调控; 转录组中图分类号: Q344+.1 文献标识码: A 文章编号: 1000-3207(2021)03-0473-14近年来, 富含蛋白质的微藻作为可持续供应的食品和饲料原料引起全球的广泛关注[1]。
小球藻(Chlorella spp.)是一类单细胞真核绿藻, 普遍生长快, 蛋白质含量高, 同时含有多糖和维生素等多种营养活性成分[2, 3], 在人类健康和动物营养领域具有广泛的应用前景[4, 5]。
微藻制油
微藻制油一、目前的能源现状1. 石油、煤炭等目前大量使用的传统化石能源接近枯竭，而且这些传统能源造成大量的环境污染如2.新能源太阳能、风能、地热能、生物质能等应用极具有局限性不能大规模的应用，不足以满足人们的需要。
3.生物能源不仅具有资源再生、技术可靠的特点，而且还具有对环境无害、经济可行、利国利农的发展优势。
总而言之，未来将是生物能源的天下。
生物能源将会是人类不二的选择，未来生源的前景将不可估量。
二、微藻概述1.海洋单细胞藻类，即微藻，是地球上最早的生物物种，它们中的某些物种已经在地球上生存了35亿年之久。
它们能十分有效地利用太阳能将H2O、CO2和无机盐类转化为有机资源，是地球有机资源的最初级生产力，有了它们才有了大气中的氧气，才有了海洋和陆地的其他生物，也才有了人类。
2．微藻的特点(1)微藻具有叶绿素等光合器官，是非常有效的生物系统，能有效地利用太阳能通过光合作用将H2O、CO2和无机盐转化为有机化合物,因其固定和利用CO2可以减少温室效应。
(2) 微藻一般是以简单的分裂式繁殖，细胞周期较短，易于进行大规模培养，由于微藻通常无复杂的生殖器官，使整体生物量容易采收和利用。
(3)可以用海水、咸水或半咸水培养微藻，因此是淡水短缺、土地贫瘠地区获得有效生物资源的重要途径。
(4) 微藻富含蛋白质、脂肪和碳水化合物，某些种类还富含油料、微量元素和矿物质，是人类未来重要的食品及油料的来源。
(5)微藻，尤其是海洋微藻，因其独特的生存环境使其能合成许多结构和生理功能独特的生物活性物质。
特别是经过一定的诱导手段微藻可以高浓度地合成这些具有商业化生产价值的化合物，是人类未来医药品、保健品和化工原料的重要资源。
3.微藻的种类微藻的国内外研究发展概况,重点探讨了4种主要的可利用微藻螺旋藻、小球藻、杜氏藻和红球藻三微藻制油的优势1.含油量高，易于培养，生长周期短单位面积产量大；2.充分利用太阳能，将水、二氧化碳等无机物质合成有机物质；3.能用海水培养，能耐受沙漠干旱半干旱地等极端环境，不占用耕地；4.能生产出高附加值的副产品，如生物高聚物、蛋白质、色素、动物饲料、酒精、氢气等；5.高效环保；生产出的生物柴油不含硫，燃烧产物不污染环境；排入环境可被微生物降解；6.生物柴油无毒, 有较大的环境价值和社会价值. 是典型的“绿色能源”。
单细胞蛋白的前世今生
饲料与添加剂6我国饲料蛋白严重不足，每年需进口大量的鱼粉以满足需要。
随着世界鱼类资源的减少，国际鱼粉市场供应也日趋紧张，我国不可能长期依靠进口鱼粉来弥补饲料蛋白的不足。
因此，根据我国国情，加强单细胞蛋白的研究与开发，利用现代微生物技术开发无粮型高效能蛋白营养饲料，争取早日实现工业化，其市场前景将十分广阔。
一、什么是单细胞蛋白单细胞蛋白亦称微生物蛋白、菌体蛋白，是指细菌、真菌和微藻等在其生长过程中利用各种基质，在适宜的培养条件下，培养细胞或丝状微生物的个体而获得的菌体蛋白。
随着畜牧业的发展，传统饲料已不能满足饲料市场需求。
单细胞蛋白营养物质丰富，菌体中蛋白质含量高达40％～80％，其中氨基酸组分齐全，赖氨酸等必需氨基酸含量较高，同时富含维生素。
与豆粉相比，用于生产单细胞蛋白的微生物蛋白质含量高出10%～20%，可利用的氮比大豆高20％，在有蛋氨酸添加时可利用氮甚至能超过95％。
因此，利用非食用资源和废弃资源(如农副产品下脚料和工业废液等)，生产单细胞蛋白，已成为补充饲料蛋白质来源不足的重要途径。
二、单细胞蛋白的来源目前用于生产单细胞蛋白的微生物主要包括4大类群，即非致病和非产毒的酵母菌、细菌、真菌和微藻。
1.酵母菌酵母菌应用最为广泛，其蛋白含量高达60％，几乎含所有的氨基酸，尤其是赖氨酸、苏氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸等必需氨基酸的含量高。
维生素含量也比较丰富。
常用的酵母菌有啤酒酵母和假丝酵母。
其中假丝酵母能够同化六碳糖和五碳糖，能忍抚顺市农业特产学校刘海杰毛治安耐高浓度的二氧化硫，菌体中蛋白质含量高，并含有大量的赖氨酸和较多的维生素及许多微量元素。
2.细菌用于生产单细胞蛋白的细菌包括光合细菌和氢细菌。
其原料主要为植物性纤维及石油衍生物，如甲醇和乙醇等。
与其他菌株相比，由病原菌生产的菌体蛋白，含有毒物质的可能性较大，因此在加工过程中必须经过处理，确保食用动物安全。
目前研究较多的细菌为红色光合细菌和自养产碱杆菌。
微藻特点与分类
微藻特点与分类微藻特点与分类⼀、微藻藻类分为原核藻类和真核藻类，含有叶绿体，可以进⾏光合作⽤。
藻类种类繁多，截⾄21世纪初已发现的藻类有三万余种，其中微⼩类群就占了70%，即两万余种。
微藻是⼀类古⽼的低等植物，⼴泛地分布在海洋、淡⽔湖泊等⽔域。
微藻（microalgae）⼀般是指那些在显微镜下才能辨别形态的微⼩藻类。
微藻细胞微⼩，形态多样，适应强，分布⼴泛。
根据微藻⽣物环境可分为⽔⽣微藻、陆⽣微藻和⽓⽣微藻3种⽣态类群。
⽔⽣微藻⼜有淡⽔⽣和海⽔声之分，根据分布⼜可分为浮游微藻和底栖微藻。
⼆、微藻特点与其他⽣物相⽐，微藻具有如下特点：1、利⽤太阳能和CO2通过光合作⽤⽣产有机物，⽣长迅速，效率⾼，低能耗;2、微藻提取有效成分不需要复杂的前处理；3、种类多、许多微藻可产⽣有⽣物活性的化合物；4、可以利⽤贫瘠⼟地、盐碱地等极端环境;5、微藻培养简单，容易产业化;微藻细胞中含有多种⾼价值的营养成分和化⼯原料，细胞代谢产⽣的多糖、蛋⽩质、⾊素等，在医药⼯业、⾷品⼯业、动物饲料、环境检测及净化、⽣物技术以及可再⽣能源制造等⽅⾯有⼴泛应⽤。
三、微藻的分类限于不同藻类对⽣存环境的需求，并不是所有的微藻都能⽤于⼈⼯培养，⽬前有⼤量培养或⽣产的微藻分属于4个藻门：蓝藻门、绿藻门、⾦藻门和红藻门。
蓝藻门(cyanophyta)属于原核植物，没有典型的可区分的核，且没有⾊素体和线粒体。
同化作⽤的⾊素（如果有的话）分散在原⽣质的表层。
原⽣质构造⽆性的蓝藻细胞的原⽣质可分为结构上和作⽤上不同的两部分。
在周围包含有同化⾊素的为⾊素质；由⾊素质向⾥进为⽆⾊的中央质，也称为中央体。
此两种原⽣质部分之间，并没有定型的膜。
⾊素质完全起⾊素体的作⽤，其中有亚显微的⽚层，呈规则排列，群聚成类囊体；中央质内⼀致认为包含有核质，并⾏使与核类似的功能。
蓝藻细胞和藻体的形态学蓝藻细胞的形态是简单的，多圆球形、柱形、椭圆形、桶形、卵形、镰⼑形、棒形等。
小球藻
小球藻)是一种普生性单细胞绿藻，属于绿藻门绿藻纲卵囊藻科，是第一种被人工培养的微藻。
目前世界上已知的小球藻有十几种，变种多达数百个。
小球藻富含多种有效成分，不仅是生物学研究中优良的实验材料，也是很有应用价值的开发对象。
l小球藻细胞中有价值的化合物生长在良好环境中的小球藻藻粉蛋白质含量可达63.60%，18种氨基酸总量为55.95%，其中8种必需氨基酸含量为23.35%，接近优质鱼粉、啤酒酵母，高于绝大多数植物性蛋白，是优良的单细胞蛋白源川。
小球藻碳水化合物含量为5.7%一38%，一般不少于20%，脂类含量为4.5%一86%，不饱和脂肪酸含量明显高于许多植物，且含有二十二碳六烯酸(DHA)。
小球藻的叶绿素含量为4吸一6%，是自然界中最高的，高于已商业化的脱水紫首楷叶绿素含量(0.2%)[2〕。
采用优化的KMI 培养基诱导培养小球藻，小球藻的虾青素含量可高达2.24mg•g一1，具有用来大规模生产虾青素的潜力，是继雨生红球藻、红发夫酵母之后又一备受关注的天然虾青素资源藻类口〕。
小球藻富含绿藻特有的活性物质—绿藻生长因子(CGF)，被称为“类荷尔蒙”。
小球藻细胞还含有丰富的维生素A、B、K(vA、vB、vK)和叶酸，各自的含量与培养时间及环境因子密切相关。
2小球藻在农业上的应用小球藻提取物稀释500一10(X)倍，喷施于蔬菜、果树叶面，具有增强植物光合作用和促进根部生长、提高根部养分吸收能力和抗菌力的效果。
用不同浓度小球藻提取物处理大白莱、芥菜和萝卜的种子可提高发芽率、发芽势和发芽指数，还可促进种子萌发过程中胚根生长，缩短种子萌发的周期。
小球藻的提取物没有毒性〔4J，因此在农业及相关领域方面具有应用价值。
3小球藻在工业上的应用3.1、食品与饲料生产20世纪60年代，小球藻主要作为单细胞蛋白资源而加以开发利用，以后又在此基础上转向开发生产价值更高的保健品、美容食品和食品添加剂。
我国台湾地区和日本成功地建立了小球藻产业，培养获得的藻细胞制成的小球藻片、小球藻提取物和保健品，被联合国粮食及农业组织(FAO)列为21世纪人类的绿色营养源健康食品。
食品生物技术题库(超全手打版)
食品生物技术题库河南工业大学国食科0906班梁言一、填充题：1、食品生物技术的包括食品与基因工程、食品与酶工程、食品与发酵工程、食品与细胞工程、食品与蛋白质工程。
2、基因的本质是具有遗传效应的DNA片段。
3、核酸的基本组成单位是核苷酸。
4、核苷酸的组成一分子（脱氧）核糖、1个磷酸基和1个含氮碱基。
5、三种限制性内切酶Ⅰ型酶、Ⅱ型酶和Ⅲ型酶。
6、核酸酶可分为两类核酸外切酶、核酸内切酶。
7、PCR全称Polymerase Chain Reaction（聚合酶链反应）。
8、按照与酶蛋白结合的紧密程度，可以把辅助因子分为辅酶和辅基。
（补充：作为辅助因子的物质：金属离子和有机小分子）。
9、酶的固定化方法有吸附法、包埋法、共价键结合法、交联法。
10、酶的活性中心以内的必需基团包括结合基团、催化基团。
11、按微生物对氧的需求发酵分为厌氧发酵和通风发酵。
（微生物发酵类型：好氧、厌氧和兼性厌氧）12、按培养基的物理性状发酵分为固态发酵和液体深层发酵。
13、根据操作方式发酵可分为分批发酵、连续发酵和流加发酵。
14、根据细胞是否贴附于支持培养的细胞类型物上生长的特性，体外分为两大类贴附型细胞和悬浮型细胞。
15、动物细胞培养方法分为分批式培养、流加式培养、半连续培养、连续培养。
16、依据培养方式不同植物单细胞培养的方法分为看护培养、平板培养、微室培养。
二、概念题：食品生物技术(food biotechnology)食品生物技术是指以现代生命科学的研究成果为基础，结合现代工程技术手段和其他学科的研究成果，用全新的方法和手段设计新型的食品和食品原料的技术。
食品生物技术主要研究内容包括：一、食品与基因工程；二、食品与酶工程；三、食品与发酵工程；四、食品与细胞工程；五、食品与蛋白质工程；基因工程：又称遗传工程，它是在体外将异源DNA（目的基因）与基因载体（质粒、病毒等）重组成复制子并转移至宿主细胞的过程。
（在各部门广泛应用，食品领域已实现食品原料或食品微生物的改良。
海藻的综合利用
海藻的综合利用魏文杰学号201106021077食工学院济南大学科技园250353摘要：海藻生产过程在肥料、人工、机械等方面的成本也较陆地能源作物所需的成本要低。
在当前能源危机频现，环境问题突出，土地储备剧减，农作物增产乏力，加大对海洋生物资源的利用尤其是对海藻的综合利用有重要的意义。
关键词：海藻综合利用农业能源生化引言在占地球百分之七十的海洋中，海藻是当今世界上生物量最大、最古老的植物之一。
海藻是制造氧气与食物的重要基础生产者，某些海藻还具有耐盐碱、耐pH、温度和压力等极端环境的卓越生存能力。
通常只需日光、空气和海水，人们便可以周而复始地从浩翰的海洋中索取它。
海藻可以净化水质，同时也是海洋生物栖息、产卵、觅食的地方，其对海洋生态之平衡与稳定，及资源之保育有不可抹灭的影响力。
海藻生产过程在肥料、人工、机械等方面的成本也较陆地能源作物所需的成本要低。
在当前能源危机频现，土地储备剧减，农作物增产乏力，加大对海洋生物资源的利用尤其是对海藻的综合利用有重要的意义。
1 海藻的生活特性1.1 概述海藻通常固著于海底或某种固体结构上，是基础细胞所构成的单株或一长串的简单植物。
大量出现时分不出茎或叶的水生植物。
以海藻为名的生物囊括了很多种，这些形体差异巨大、横跨了多种生命体，共同点主要是生活在海水中，可以通过自身体内的色素体以及光合作用来合成有机物。
最常见的大型海藻是海草，如︰绿藻、红藻和褐藻。
1.2海藻的分类：常见的褐藻包括大型褐藻、马尾藻和墨角藻属。
太平洋及南极地区的巨藻属和海囊藻属的某些种长度超过33公尺，是最大的藻。
海带属在太平洋沿岸及不列颠群岛都很丰富。
常见的红藻包括掌状红皮藻、紫菜、石花菜属、角叉菜属。
北大西洋的掌状红皮藻淡紫红色，由扁平的单生或丛生的叶状体所构成，外表扇状，分成多数二叉型裂片。
低潮时，大西洋岩石海岸潮间带的下半部，丛生著角叉菜属的各个种。
春夏两季，不列颠群岛、日本及其他地方潮间带的高潮线下紫菜很多。
藻中提取生物柴油
生物柴油
生物柴油(Biodiesel)是指以油料作物、野生油料植物和工程微藻 等水生植物油脂以及动物油脂、餐饮垃圾油等为原料油通过酯交 换工艺制成的可代替石化柴油的再生性柴油燃料。生物柴油是生 物质能的一种，它是生物质利用热裂解等技术得到的一种长链脂 肪酸的单烷基酯。生物柴油是含氧量极高的复杂有机成分的混合 物，这些混合物主要是一些分子量大的有机物，几乎包括所有种 类的含氧有机物，如：醚、酯、醛、酮、酚、有机酸、醇等。
国内外研究现状
2、澳大利亚现状 2009年底，笔者有幸从澳大利亚墨尔本获得澳大利亚的 “富基绿色 新能源生物柴油(Fulifuelblodiese1)”项 目的资料，从中得知，该项目进 行了大量的藻类优良品种筛选工作，在5×10多种海藻中，最终精选出脂 质含量高的3个优秀品种，a)微拟球藻(Nannochloropsissp)，其脂质含量 为净重的31％～68％；b)裂殖壶菌(Schizochytriumsp)，其硅藻脂含量为 净重的50％～77％；C)布朗葡萄藻(Botryococcusbraunii)，其硅藻脂质含 量为净重的25％～75％。这3种微藻中，以微拟球藻最优，因为其抗菌力 强，生命力顽强；易于生养，培育简单，处理方便；咸水物种；高脂质含 量(脂质达净重的70％)。
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海藻生产和海藻油提取
• 藻类的厚壁孢子具有坚韧的细胞壁，会阻碍对细胞内生物质的提取。 因此在提取海藻油前，必须对海藻细胞进行破壁处理。超声波法或超 微加超声法是目前实验室对藻细胞进行破壁的常用方式，且破壁效率 高，一般细胞破壁率都可以达到95% ~ 98%。在海藻生物柴油工厂采用 这类破壁方法存在两个主要问题，一是设备昂贵，二是能耗高。 • 采用机械破壁法、物理法和酶解法对螺旋藻进行破壁试验证实，机构 法的破壁效果较好且易操作，而研磨法是螺旋藻细胞的最佳破壁方法 ，在胶体磨和匀质机上进行螺旋藻细胞的破壁试验效果更理想。
微藻的筛选与培养
按培养密闭程度分
开放式培养：指藻液直接与外界空气相通的一种培养 方式，如敞开式大池培养，是生产性培养的主要方式。
优点：建池简单，投资少，运行费用低，可利用光温适宜但不宜种植传统 农作物的地区或产量低的荒漠、盐碱沙地等。生产操作简单，容易清洗。 缺点：CO2供应不足，温度不易控制，水分蒸发严重，光能利用率低，占 地广大。易污染，生产不稳定，藻体不易于收获，产量和质量难以保证。
4、比表面积更大
等量
树叶 比表面积:10-3 m2
1 g干 物质
微藻 比表面积:1.3×103 m2
相同质量的微藻比表面积是树叶的1.3×106倍，比表 面积越大，受光面积越大，越有利于光合作用。
5、更高含量的光合作用单位
植物光合色素含量占 其干重约0.05%,分布 于树叶、树干等组织 中细胞的特定部位， 不有利于光合产物的 合成与转运。
摘取少许苔藓新鲜茎叶，流水冲洗15 min后用蒸馏水洗涤3次， 在超净工作台上用软毛刷反复清理苔藓植物表面，然后用 Tween20进行清洗，再用蒸馏水冲洗5次，将第5次冲洗完的 无菌水收集。在无菌条件下，用研钵将清洗过的苔藓材料研 磨制成匀浆液，接入BG-11液体培养基中，放于光照培养箱 中培养，培养条件是温度25 ℃，光照周期为12h：12h。光照 强度是25 μmol· m-2·s-1。第五次冲洗用的无菌水也接入BG-11 液体培养基，在相同的条件下培养。20天后，每五天对培养 的第五次清洗的无菌水进行镜检。作为检验苔藓植物表面是 否清洗干净的对照。
1、反应物浓度更高
近3000倍
1 L空气中含有约5.9×10-4 g CO2
2、产物浓度更低
1 L水中含有约1.7 g CO2
1/40
1 L空气中含有约0.3 g O2
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热带作物学报2019, 40(4): 781786 Chinese Journal of Tropical Crops
收稿日期 2018-11-13；修回日期 2019-01-28 基金项目 中国热带农业科学院基本科研业务费专项资金项目（No. 1630122017015）；“一带一路”热带国家农业资源联合调查与开发评价项目（No. ZYLH2018010412）。 作者简介 李贵丽（1994—），女，硕士，研究方向：食品工程。*通信作者（Corresponding author）：韩志萍（HAN Zhiping），E-mail：erping-80@163.com。
2株高产蛋白微藻细胞代谢物的比较 李贵丽1,2，魏晓奕2，周 伟2，李积华2，韩志萍2* 1. 华中农业大学食品科学技术学院，湖北武汉 430000；2. 中国热带农业科学院农产品加工研究所/农业农村部热带作物产品加工重点实验室 广东湛江 524001
摘 要 以2株新近分离出来的链带藻（Desmodesmus sp. QL96和Desmodesmus sp. QJ74）为研究对象，检测胞内主要细胞代谢产物组成及含量变化，找出优势细胞代谢产物。收集相同时间间隔下培养的2株微藻，经过冻干、研磨、复溶，制备成细胞溶解液，再进行逐级萃取，分级检测每个萃取步骤中所得细胞代谢产物的含量。结果表明：在BG11培养基中生长30 d，链带藻Desmodesmus sp. QL96和Desmodesmus sp. QJ74的最高蛋白含量分别达到细胞干重的71.68%和62.14%，其他代谢产物，如碳水化合物、脂质和色素，在2株微藻中的含量都没有超过20%。对比其他微藻的文献报道，链带藻Desmodesmus sp. QL96是目前发现的蛋白含量最高的藻株，其蛋白的表达模式和蛋白相关产品的开发具有研究价值。 关键词 链带藻；代谢产物；蛋白；脂质 中图分类号 Q949.2 文献标识码 A
Comparative on the Metabolites of Two High Protein-producing Microalgae
LI Guili1,2, WEI Xiaoyi2, ZHOU Wei2, LI Jihua2, HAN Zhiping2* 1. College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan, Hubei 430000, China; 2. Agricultural Pro ducts Processing Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory of Tropical Crop Products Processing, Ministry of Agriculture & Rural Affairs, Zhanjiang, Guangdong 524001, China
Abstract To reveal the dominant cell metabolites, as well as their contents, including carbohydrates, lipids, proteins, chlorophyll and carotenoid of two newly isolated microalgae (Desmodesmus sp. QL96 and Desmodesmus sp. QJ74). Two microalgae were collected at the dedicated culture time, the cells were lyophilized, ground and resuspended to prepare a cell lysate, and then subjected to stepwise extraction and fractionation to detect the content of the cell me-tabolite obtained in each extraction step. The results showed that the protein content of Desmodesmus sp. QL96 and Desmodesmus sp. QJ74 reached up to 71.68% and 62.14% of the cell dry weight which were grown in the BG11 medium for 30 days, respectively. The contents of other cell metabolites were much lower, none exceeding 20% of the cell dry weight. Compared to other microalgae in literatures, Desmodesmus sp. QL96 is the most protein abundant microalgae and deserves further study, including protein expression patterns and protein-sourced product development. Keywords Desmodesmus sp.; metabolites; protein; lipid DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2019.04.024
微藻是单细胞微生物，和其他微生物一样，只有利用显微镜才能分辨其形态特征[1]。微藻种类多样，已经分离鉴定的微藻种属有螺旋藻、小球藻、杜氏藻、红球藻等几万种[1-2]。微藻繁殖速度快、和植物一样可以进行光合作用，是自然界中光合效率最高、生长最为迅速的原始生物种类782 热带作物学报 第40卷 之一[3]。其细胞代谢产物包括多糖、蛋白质、脂肪酸、色素等多种生物质成分[3]，这些成分的开发利用研究近年来已逐渐成为热点，例如以微藻脂质为原料的生物柴油[4]、以微藻蛋白为主要原料[5]、微藻多糖为主要功效成分的保健品等产品[6-7]的开发研究。然而这些开发项目大多停留在初级阶段，在产业中的应用十分有限，其原因主要是经济成本较高，而经济成本和微藻代谢产物含量的高低直接相关。获得高产生物成分微藻的途径一般有两个，一是筛选天然高产微藻，二是通过基因工程技术提高微藻细胞中部分生物成分的产量。一些通过基因技术建立的工程藻，在实验室生长状态良好，在开放池塘却显示了诸多不适[8]，因而筛选天然高产微藻更加具有可行性。 相关研究发现一些链带藻具有较好的环境适应性，如在新疆沙漠地区分离得到耐干旱的富油链带藻Desmodesmus sp. XJ842[9]，台湾高湿热地区分离得到的高产油能力的链带藻Desmodesmus sp. F2等，这些链带藻对恶劣环境的适应力近年来吸引了广泛的关注。本文以新近从我国西藏高原和云贵高原地区分离出来的2株链带藻为研究对象，以盐水BG11为培养基，利用各种方法检测了藻株细胞中的主要组分，以挖掘其潜在的开发前景和应用领域。 1 材料与方法 1.1 材料 链带藻Desmodesmus sp. QL96和Desmodes-mus sp. QJ74均由中国科学院水生生物研究所提供。Desmodesmus sp. QL96是从海拔4500 m左右的西藏那曲青龙乡巴木错湖分离得到，该湖所在区域属高原亚寒带半干旱气候区，Desmodesmus sp. QJ74从云贵高原中部曲靖面店水库分离得到，该地区气候温和，属亚热带季风性气候。 1.2 方法 1.2.1 微藻培养 微藻培养基选用BG11基础培养基[10]。无菌操作条件下，在250 mL的三角瓶中装入100 mL培养基，接入5×107个微藻细胞，在温度(25±1) ℃、光照强度8000 lx、光暗周期12 h∶12 h的培养条件下培养30 d。在设置的时间点上，将微藻通过抽滤的方法收集后再真空冷冻干燥[11]，获得干藻粉，于−20 ℃储存直至测定分析[12]。 1.2.2 生物量的测定 微藻接种后每隔3 d，从每个培养液中抽取10 μL，用血球计数板计数测定Desmodesmus sp. QL96和Desmodesmus sp. QJ74的细胞数变化情况，剩余的培养液经抽滤和冻干后测细胞干重，绘制2株链带藻的生长曲线。 1.2.3 主要细胞代谢产物的测定 接种后每隔6 d收集一次微藻，冻干后于研钵中磨碎，复悬于25%的甲醇氢氧化钠溶液和pH 7.4的磷酸盐缓冲液混合液（74∶1，V/V）[12-13]，制备细胞溶解液，
用以测定其中的总糖、蛋白、脂质、叶绿素和类胡萝卜素的含量。 总糖含量测定：参照Chen等[12]的方法，取
上述溶解液0.6 mL，加入1.2 mL经过4 ℃预冷的75% H2SO4，涡旋混合2 min，继续加入2.4 mL
蒽酮试剂，于沸水浴下15 min后，迅速冷却至室温，于578 nm下测定吸光度。空白对照取0.6 mL溶解液加入3.6 mL经过4 ℃预冷的75% H2SO4，
不加蒽酮试剂测定吸光度。以D-葡萄糖为标品绘制标准曲线。 总蛋白含量测定：蛋白含量以考马斯亮蓝法进行测定[14]。即取500 μL溶解液，于沸水浴25~30
min后，迅速冷却至室温，加入5 mL考马斯亮蓝染液，震荡2 min，混匀后于595 nm下测定吸光度。以BSA为标品绘制标准曲线。 色素含量测定：按Chen等[12]的方法并进行
了适当修改，即取溶解液8 mL于沸水浴25~30 min后迅速冷却至室温，与12 mL氯仿甲醇溶液（2∶1，V/V）混合，涡旋混合2 min，离心，取上层水相于416和453 nm测定吸光度，按照公式（1）和（2）分别计算叶绿素a和叶绿素b的含量。取下层有机相于480和430 nm测定吸光度，根据公式（3）计算类胡萝卜素含量。
Ca＝6.40×A416－0.79×A453 （1）
Cb＝5.87×A453－0.24×A416 （2） Cc＝(A480－A430)／0.0295 （3）
脂质含量的测定：参照Chen 等[12]的方法，取色素含量测定步骤中分离得到的有机相2 mL，加入1 mol/L三乙醇胺∶1 mol/L乙酸∶6.45%硝酸铜混合液（9∶1∶10，V/V/V）2 mL，涡旋混合2 min，于10000 r/min离心2 min，取下层有机相于260 nm下测定吸光度。对照样本中加入1 mol/L三乙醇胺∶1 mol/L乙酸（9∶1，V/V）