【述评】严重脓毒症免疫调节治疗：从免疫抑制走向 免疫增强

【述评】严重脓毒症免疫调节治疗：从免疫抑制走向 免疫增强 脓毒症（sepsis） 是危重病患者死亡的首要原因，在所有引起居民死亡的病因中脓毒症排在第10位［1］。早期对脓毒症发病机制的研究认为，失控的、持续放大的全身性炎症反应（SIRS） 是引起脓毒症患者死亡的主要原因［2］。但随着支持治疗手段的提高，绝大部分患者能够度过严重的全身炎症反应阶段即免疫亢进期，进入更加复杂的免疫抑制（麻痹）期。近年来对死亡的脓毒症患者进行尸检发现，脓毒症后期表现为严重的免疫麻痹，且持续数天甚至数周。免疫麻痹导致后期出现继发性感染，大部分感染的病原体是多种耐药的细菌或真菌，无法控制的感染最终导致患者死亡。尽管早期液体复苏、感染灶的及时清除、抗生素的早期使用及器官功能支持的“集束化治疗” 是脓毒症治疗的基石，但脓毒症的病死率仍居高不下。因此，不断探讨和研究新的治疗方法和理念迫在眉睫。近年来已经认识到免疫麻痹是严重脓毒症患者死亡的主要原因，近期有多项研究证实免疫增强（刺激）治疗能够改善脓毒症患者的病情和提高生存率。本文将总结脓毒症免疫功能紊乱研究的最新认识，探讨脓毒症免疫增强治疗的可能性。 １ 脓毒症免疫功能紊乱的传统认识 当病原微生物突破皮肤、黏膜等入侵到人体后，机体快速启动非特异性（固有） 免疫系统识别和清除致病微生物。固有免疫反应不仅是机体抵御外界微生物感染的第一道防线，其在诱导和激活获得性免疫中也发挥着重要作用。宿主细胞通过表达几类病原模式识别受体（PRRs） 来识别病原体的保守结构即病原相关分子模式（PAMPs）。常见的PAMPs包括脂多糖、肽聚糖、鞭毛蛋白及微生物的核酸分子等。PRRs主要包括定位于炎症细胞膜和内体膜上的ToII样受体（TLRs） 和Ｃ型凝集素受体（CLRs）、胞浆内的NOD样受体（NLRs）、视黄酸诱导基因Ｉ解旋酶（RIG-I）样受体（RLRs）和HIN200蛋白等。除识别PAMPs外，这些受体同时也可以识别由于组织损伤和细胞死亡而释放的内源性物质如热休克蛋白、DNA和RNA片段等内源性的危险信号。PAMPs被PRRs识别后启动下游的NF-KB信号通路，引起炎症介质的生成并介导炎症反应。适度的炎症反应有利于病原体的清除；但如果NF-KB信号通路持续激活，则引起炎症介质“瀑布样”的释放，过度的炎症反应对机体造成不利的影响，导致组织和器官功能的损伤。 过去的研究认为炎症介质的过量生成是脓毒症发病的主要病理过程［3］。动物实验和临床研究均证实炎症介质TNF-α和IL-1β等在脓毒症的发病过程中发挥了重要的作用。而且有较多的动物实验也证实抗炎症治疗、拮抗内毒素的治疗能够改善脓毒症小鼠的预后。但随后以“免疫亢进” 为理论基础的，一系列（约25项） 炎症介质（TNF-α和IL-1β等）单克隆抗体的临床实验，均发现“免疫抑制” 治疗不能改善脓毒症患者的预后［4］。近期被寄予厚望的阻断LPS与MD2-TLR4受体结合的拮抗剂（Eritoran，NCT00334828）治疗脓毒症的临床研究也以失败而告终［5］。所有这些临床研究的失败促使我们要重新认识免疫亢进对脓毒症患者死亡的影响以及脓毒症患者的免疫状态。 ２ 脓毒症免疫功能紊乱的再认识 近年来临床研究和脓毒症患者的尸检发现免疫麻痹是脓毒症患者死亡的主要原因。随着支持治疗手段的提高，绝大部分患者能够度过免疫亢进期，进入更加复杂的免疫麻痹期［6-7］。Ertel等［8］发现用LPS刺激脓毒症和非脓毒症患者的静脉血后，与非脓毒症患者相比脓毒症患者分泌的炎症介质TNF-α、IL-1β和IL-6量减少10％ ～20％。Sinistro等也发现与其他患者相比，脓毒症患者外周血仅有5％的单核细胞功能正常［9］。这些研究结果告诉我们机体在受到严重的感染后炎症反应和抗炎症反应均参与了脓毒症的发病，脓毒症后期抗炎症反应占明显的优势、炎症细胞功能失调，机体处于免疫麻痹状态。另外，有研究发现自身免疫性疾病的患者使用TNF-α拮抗剂治疗后脓毒症的发病率和病死率明显增加［10］。 2011年Boomer等［11］在Lancet杂志发表了脓毒症患者的尸检报告，发现脓毒症死亡的患者均表现为严重的免疫抑制。与ICU非脓毒症患者相比，严重脓毒症死亡患者的脾细胞在受到抗CD3和CD28刺激5h后，炎症因子TNF-α（5361pg／mL vs．41pg／mL）、INF-γ （1374 pg／mL vs．37.5pg／mL）、IL-6（3691pg／mL vs．365pg／mL）和IL-10（633pg／mL vs.58pg／mL）的分泌量明显减少，不到对照组的10％。与非脓毒症死亡组相比，脓毒症死亡组的患者脾细胞和肺上皮细胞表面CD4、CD8、协同刺激分子受体CD28和HLA-DR的表达明显减少甚至缺乏，而CD28超家族成员中免疫共抑制分子细胞程序性死亡受体-1（programmed celldeath-1，PD-1）和细胞毒性Ｔ淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4）的表达明显增加。新生儿和儿童脓毒症患者的尸检也发现淋巴细胞凋亡、数量减少和功能失调介导的免疫麻痹是引起患者死亡的主要原因［12］。持续的免疫麻痹导致患者对原发性致病微生物不能有效的清除，而且随着住院时间的延长和各种有创操作的增多，患者合并院内机会性病原菌的感染。2009年Torgersen等对235例死亡的脓毒症患者进行了尸检，发现尽管所有的患者均使用了广谱的抗生素和进行了感染灶的清除，但仍有76.6％的患者在死亡时感染没有得到有效的控制、感染灶仍存在；且大部分患者出现了新发部位和致病菌的院内感染，42.5％的患者出现2个以上的部位感染；其主要原因是患者的免疫功能受到了严重的抑制［13］。另外，多项临床研究发现大部分脓毒症患者后期出现了院内获得性的二重感染，金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌和白色念珠菌等条件致病菌是引起患者死亡的主要致病病原体［14］。Luyt等和Limaye等发现部分脓毒症患者后期出现了单纯疱疹病毒和巨细胞病毒等潜伏病毒的感染［15-16］。这些临床研究告诉我们脓毒症患者随着病程的延长而出现了免疫麻痹，从而继发了机会性致病菌的感染，最终导致了患者死亡。 ３ 免疫增强治疗脓毒症的基础和临床研究 随着对脓毒症尤其是病程后期免疫麻痹认识的深入，近年来对脓毒症免疫调节的治疗也发生了变化，动物试验和临床研究均显示免疫增强治疗能够改善患者的免疫状态，清除致病微生物，减少获得性感染的发生率，降低病死率。目前研究较多的免疫增强药物有：粒-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、干扰素-γ（IFN-γ）、胸腺肽（Tα1）、白介素-17（IL-17）和PD-1拮抗剂等。 GM-CSF是一种多效性细胞因子，它与GM-CSF受体结合后促进多种造血细胞的存活、增殖和分化，并通过提高中性粒细胞／单核细胞、树突状细胞等的数量而发挥免疫调节作用。动物研究证实GM-CSF能够增加脓毒症大鼠循环中免疫细胞mHLA-DR的表达和炎症介质的生成［17］。近年来临床研究发现GM-CSF对脓毒症患者具有一定的治疗作用。2011年Bo等利用Meta分析对12项RCT研究、共纳入2380例脓毒症患者进行了系统的分析，发现GM-CSF明显增加了脓毒症患者感染灶的清除，但对28d的存活率无明显的改善，这可能与入组患者脓毒症发病时间不一、免疫状态不同相关［18］。有研究发现如果选择免疫麻痹的患者进行GM-CSF刺激治疗，则能取得较好的疗效。Hall等［19］利用LPS刺激脓毒症患者外周血提取的单核细胞，对刺激后TNF-α分泌少于200pg／mL的患者，诊断为免疫抑制；给予这部分患者GM-CSF治疗后TNF-α的分泌增加，院内获得性继发感染的可能性明显减少。2009年，Meisel等［20］采用以mHLA-DR标志物为指导，对严重脓毒症患者进行GM-CSF免疫增强治疗取得了成功。研究者对严重脓毒症合并免疫麻痹状态的患者（mHLA-DR＜8000mAb／细胞，连续2d）分别用GM-CSF和生理盐水作为对照治疗。发现两组患者在治疗前mHLA-DR水平差异无统计学意义SF治疗组24h后所有的患mHLA-DR水平均明显上升，而对照组仅有15.8％的患者上升；治疗组免疫反应增强，呼吸机使用时间减少，APACHEⅡ评分显著下降，住院时间和ICU入住时间明显缩短。 IFN-γ由活化的Th细胞和NK细胞产生，其主要的生物学功能是通过诱导多种抗原提呈细胞表达MHC-Ⅰ／Ⅱ分子，活化单核和巨噬细胞并增强其溶菌活性、分泌IL-1、IL-6、IL-8和TNF-α等炎症介质发挥免疫增强作用。IFN-γ还能活化中性粒细胞、NK细胞，刺激血管内皮细胞和白细胞合成黏附分子，促进Th1细胞发育和抑制Th2细胞活化与增殖，刺激B细胞产生的抗体类型向调理素方向转变。目前小样本的临床研究发现IFN-γ治疗脓毒症是有效的。Docke等［21］发现IFN-γ治疗单核细胞表达HLA-DR和TNF-α分泌减少的脓毒症患者，增加单核细胞HLA-DR的表达、CD4T细胞生成IL-17增加， 脓毒症患者的存活率提高。Nalos等［22］发现IFN-γ能够有效的治疗持续性金黄色葡萄球菌感染的患者，IFN-γ治疗后患者的免疫抑制等到有效的改善，致病病原体被清除。另外有研究发现，给予健康成年人，反复多次注射内毒素模拟脓毒症诱导的免疫麻痹的模型。研究发现在第2次注射内毒素前给予IFN-γ注射不但能够增加mHLA-DR的表达，而且也能够恢复炎症介质TNF-α的泌，抗炎症介质IL-10的分泌也明显减少［23］。 Tα1是正常人体内分泌和合成的物质，能够刺激淋巴细胞的增殖、分化，激活树突状细胞，从而具有增强人体细胞免疫功能的作用。管向东教授课题组通过多中心、随机对照研究发现Tα1能够降低严重脓毒症患者的病死率，治疗组和对照组患者的病死率分别为26.0％和35.0％ （P＝0.049）。Tα1治疗能够改善患者的免疫抑制状态，治疗组患者第3天和第7天外周血单核细胞mHLA-DR的表达明显高于对照组［24］。 IL-7是一种多效应的细胞因子，能够诱导幼稚的记忆性Ｔ细胞增殖。美国肿瘤研究所的临床研究发现IL-7治疗后循环中CD4和CD8T细胞的数量增加2倍，脾脏和外周的淋巴结中的Ｔ细胞增加了50％。HIV感染、CD4T细胞持续低下的患者，IL-7治疗后CD4和CD8T细胞生成细胞因子的能力增加了2～3倍。脓毒症时IL-7通过各种途径发挥作用，使Ｔ细胞激活、恢复低反应性或者耗竭的Ｔ细胞的功能，增加细胞黏附分子的表达，这些黏附分子能够增强Ｔ细胞到感染灶的聚集和黏附，增加Ｔ细胞受体的分化，导致免疫功能的增强，抵抗入侵的病原微生物［25-26］。 负性共刺激因子PD-1存在于T细胞上，通过PD-1通路能够抑制细胞的增殖、细胞因子的生成、细胞毒性功能。慢性持续性的感染如HIV和肝炎病毒的感染等PD-1的过量生成和T细胞耗尽。目前已有3项研究证实阻断PD-1通路能够提高慢性细菌和病毒感染的存活率。有研究发现脓毒症患者循环中T细胞表面的PD-1明显增加，动物研究发现阻断PD-1的信号传导能够提高脓毒症的存活率，提高脓毒症大鼠对致病微生物的清除率［27－28］。