层析分离技术与设备
层析技术及原理
思考题 1. 血清r-球蛋白分离与纯度鉴定的原理?
层析可分哪几类？
3．简述离子交换层析和凝胶层析的原理? 4．主要有哪几个操作步骤?
图3-2 Rs计算示意图
图3-3 垂直线法计算Rs示意图
若Rs=1，则组分定会分离；Rs<1，则组分部分分离；Rs=0，组分不能分离或分离极差。
四.分配系数
在层析分离过程中，物质既进入固定相，又进入流 动相，此过程称分配过程。无论哪一种层析法，在一定条 件下，物质在固定相和流动相达到平衡时，它在两相中平 均浓度的比值称分配系数(K)。 分配系数是由溶质的性质(分子大小、电荷、分子量等) 所决定的。不同的层析机制，其K值涵义不同。吸附层析 中，K值表示吸附平衡常数；分配层析中，表示分配系数； 离子交换层析中，表示交换常数；亲和层析中，表示亲和 常数。K值大表示其溶质在固定相中浓度大，在洗脱过程 中，溶质出现较晚。K值小表示其溶质在流动相中浓度大， 故在洗脱液中出现较早。 若两组分在同一条件下具有相似的K值，则表明两组 分层析峰重叠大，分离效果差。为达到分离目的，需重新 选择实验条件，包括层析方式和流动相的改变。
ห้องสมุดไป่ตู้
实际计算理论塔板数时，只要在层析图谱 上测出某组分的保留值和在一定纸速下相应的 峰宽，就可计算出在某一实验条件下的理论塔 板数的近似值，以衡量柱效。若要得到真正的 塔板数时，必需扣除未被固定相所占有的空间 死体积(如柱的接口、连接柱接口的管路体积) 和流动相为充满死体积时所需的时间，此时得 到的塔板数称为有效塔板数(neff)。故上述公 式可转化为：
层析中的常用术语
一、保留值(Retention Value)
保留值表示样品中各组分 在层析柱中停留时间的长短或 组分流出时所需流动相体积的 多少。它用来描述层析峰在层 析图上的位置(图3-1)
第六章 层析技术
常用术语
固定相：是由层析基质组成的，其基质包括固体
物质（如吸附剂、离子交换剂）和液体物质（如固 定在纤维素或硅胶上的溶液），这些物质能与相关 的化合物进行可逆的吸附、溶解和交换作用。
流动相：在层析过程中推动固定相上的物质向 一定方向移动的液体或气体称为流动相。在柱层 析时，流动相又称洗脱液或洗涤剂。在薄层层析 时流动相又称展层剂。
几个概念
吸附剂 吸附剂的选择主要依据吸附剂本身和被吸附物
质的极性，为活性多孔固体，表面积大、颗粒均 匀、吸附选择性好、稳定性强和成本低廉等性能。
常用的吸附剂有活性炭、硅石、氧化铝、羟基 磷灰石等。
• 羟基磷灰石（HA）[Ca10(PO4)6.(OH)2]
表面有Ca2+和PO43-两种带电基团。酸性和中性蛋 白质可与Ca2+结合，碱性蛋白质可与PO43-结合。
*气体作为流动相
*吸附在固体上的液体为固定相
按两相所处的状态分为： 液相色谱 液-固层析 液-液层析 气相色谱 气-固层析 气-液层析
（2）按层析原理分类
吸附层析 分配层析 离子交换层析 凝胶排阻层析
（3）按操作形式不同分类：
柱层析
纸层析
薄层层析
Liquid Chromatography
突出贡献: 预测气相色谱(1952年应用);提出用细小颗粒 作填料,而两端可以加压(HPLC).
1952年：马丁，辛格对分配层析的研究和发现， 诺贝尔化学奖
1952年，马丁同詹姆斯(James)一起，把分配层析应 用在分离气体上。各种气体或蒸汽的混合物可以利用氮 或氦一类情性载气的气流通过吸收性固体的表面。混合 的气体通过后，在另一端实现分离。
洗脱体积（Ve）：
是指某一成分从柱顶部到底部的洗脱液中出现浓度 达到最大值时的流动相体积。
层析分离技术
层析分离的基本概念
洗脱体积 色谱柱中，使溶质从柱中流出所需流动相体积，为洗脱 体积
Ve Vm K dV s
不同的பைடு நூலகம்质，由于和固定相的亲和力的不同，洗脱体积 也有所差异
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层析分离的基本概念
Rs = 0.6
分辨率（Resolution, Rs） Peak separation Peak width at ½ height
柱层析 检测器、记录仪和积分仪处理
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4、层析装臵的仪器化
HPLC
与微机、质谱等连用
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四、层析前蛋白质处理
主要是利用盐析法、等电点沉淀、有机溶 剂沉淀等方法，使目的蛋白与其它较大量的 杂蛋白分开，这些方法的特点是简便、处理 量大、既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白质， 但分辨率低。
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1、盐析法 盐离子与水分子作用，原来溶液中大部分的自 由水转变为盐离子的水化水，从而降低蛋白质极性 基团与水分子之间的作用，破坏蛋白质分子表面的 水化层，暴露出来的蛋白质表面疏水性区域相互结 合，形成沉淀。
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层析法也称色谱法(chromatography)，是1906年 俄国植物学家Michael Tswett发现并命名的。他 将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各 种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被 分开，由此得名为“色谱法”。 1941年，英国生物学家Martin和Synge首先提出 了色谱塔板理论，为后来各种色谱技术的发展奠 定了基础。
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2、等电点沉淀
在溶液pH值等于蛋白质等电点时，蛋白质的溶 解度最小，容易互相吸引，聚合成沉淀；加入盐离 子会破坏这些吸引力，使分子散开，溶入水中。
凝胶层析技术(凝胶过滤)
四、凝胶层析的特点
1、凝胶是一种不带电荷的惰性物质，本身不 会与被分离物质相互作用，分离效果好，重 复性高。 2、设备简单，操作简便。
五、影响凝胶层析的因素
（一）凝胶的选择： （二）凝胶粒度对分离效果的影响 40-60目为粗粒。 100-200目为细粒（应用较多）能使洗脱曲线的峰区变得对 称和狭窄。 250-400目为最细粒。 （三）洗脱流速对分离效果的影响： 一般采用流速在30-200ml/小时，过快会使色层谱变形。 （四）离子强度和附值 （五）样品液体积对分离效果的影响 通常样品液体积约为凝胶床总体积的5-10%。 （六）凝胶柱的长度，直径和分离效果的关系 （七）Vo和Vi
其结构如图：
由右旋葡萄糖单位通过1.6-糖苷键连结成链状结构，再由 3-氯-1,2-环氧丙烷（Cl-CH2-CH-CH2）作交联剂而形成 的多孔网状结构的高分子 、 （1）凝胶在使用前必须在过量的溶剂中充分地 膨胀，否则影响层析的均一性，甚至使柱破裂， 自然溶解需24小时以上，加热至沸需2小时即可。 （2）用倾斜法除去混杂的小颗粒，重复2-3次。 2、凝胶的装填 、 装柱是凝胶层析中最重要的一步操作。 a.将柱垂直安装好 b.在柱内先装入1/5的水，用玻棒搅拌凝胶沿玻 棒倒下待凝胶开始沉降时，打开出口。凝胶床 必须装得均匀，尽量一次装完，以免出现不均 匀的凝胶带，因此，在装柱时需打开下口，并 调节适当的流速。 c.连接恒压洗脱瓶，平衡流速，开始流速不能 太大，应低于层析时所需的流速。 d.经平衡后的凝胶床顶部留下1ml左右的液体。 关闭出口管上的螺旋夹。
小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外还可进入凝胶颗粒的微孔之中因此在向下移动的过程中它们先从凝胶内扩散至颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒这样不断进入和扩散必然使小分子物质的下移速度落后于大分子物质从而使样品中分子大小不同的物质流出柱外而得到分离
凝胶层析_实验报告
一、实验目的1. 了解凝胶层析的原理和操作方法。
2. 掌握凝胶层析分离混合物中不同组分的基本技能。
3. 分析实验结果，验证实验原理。
二、实验原理凝胶层析是一种基于分子筛效应的分离技术。
该技术利用凝胶的孔隙结构，使不同分子量的物质在凝胶柱中受到不同的阻滞作用，从而实现分离。
凝胶是一种具有多孔、网状结构的分子筛，分子量不同的物质通过凝胶柱的速度也不同。
在凝胶层析实验中，样品被注入凝胶柱，随着洗脱液的流动，不同分子量的物质会以不同的速度通过凝胶柱，从而实现分离。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：混合样品、葡聚糖凝胶、洗脱液（如蒸馏水、乙醇等）。
2. 实验仪器：凝胶层析柱、注射器、恒流泵、收集器、滤纸、烧杯等。
四、实验步骤1. 准备凝胶层析柱：将葡聚糖凝胶倒入层析柱，轻轻敲打柱底，使凝胶均匀分布。
2. 洗脱液平衡：将凝胶层析柱放入盛有洗脱液的烧杯中，使凝胶充分浸泡。
3. 样品制备：将混合样品与洗脱液按一定比例混合，制成样品溶液。
4. 注射样品：将样品溶液注入凝胶层析柱。
5. 收集分离组分：随着洗脱液的流动，不同分子量的物质会以不同的速度通过凝胶柱。
将收集器放置在凝胶柱下方，收集分离组分。
6. 分析实验结果：观察收集到的组分，分析实验结果。
五、实验结果与分析1. 分离效果：通过凝胶层析实验，成功分离出混合样品中的不同组分。
2. 分组情况：根据收集到的组分，分析其分子量大小，确定分离效果。
3. 实验原理验证：实验结果表明，凝胶层析能够有效分离混合物中的不同组分，验证了实验原理。
六、实验讨论1. 凝胶层析的原理：凝胶层析的原理是基于分子筛效应，通过凝胶的孔隙结构，使不同分子量的物质在凝胶柱中受到不同的阻滞作用，从而实现分离。
2. 影响分离效果的因素：实验过程中，洗脱液的种类、流速、凝胶的孔径等因素会影响分离效果。
在实验中，应严格控制这些因素，以确保分离效果。
3. 实验结果分析：通过分析实验结果，可以了解不同组分在混合样品中的含量和分子量大小，为后续研究提供数据支持。
凝胶层析分离的优缺点
凝胶层析分离的优缺点
凝胶层析是一种从混合物中分离纯化大分子的技术。
这种技术是将试样加入到一个固定相填充的管中，其中固定相是由物理或化学交联的高分子凝胶所组成。
凝胶层析可以将大分子分离成不同的组分，这些组分的大小和形状决定了它们在凝胶中的迁移速度。
1. 可以分离多种大分子：凝胶层析可以用于分离许多不同种类的大分子，包括蛋白质、核酸和碳水化合物。
2. 纯度高：凝胶层析能够分离几乎相同的分子量，从而可以得到高纯度的样品。
3. 易于操作：凝胶层析是一种简单易行且容易掌握的技术。
4. 不需要昂贵的设备：与其他分离技术相比，凝胶层析不需要高成本的设备和重要的溶剂。
因此，它被广泛用于实验室环境。
1. 选择性差：凝胶层析的分离程度取决于大分子与凝胶中填充物之间的相互作用。
因此，如果这些相互作用相似，则难以区分大分子之间的差异。
2. 操作时间长：凝胶层析通常需要数小时或数天才能完成某种程度的分离。
3. 凝胶的处理：凝胶需要固定和交联，这需要额外的步骤，增加了操作的时间和成本。
此外，为了防止凝胶中的污染物影响试样的分离，需要进行特殊的清洁和处理。
4. 不能处理大分子：凝胶层析不适用于高分子的纯化，因为它们会卡住在凝胶的孔隙中或者过度被扭曲，导致分离效果不佳。
综上所述，凝胶层析分离的优缺点都十分明显。
凝胶层析分离是一种广泛应用于分离大分子的技术，但它的选择性和分离速度有限，需要经常考虑其他分离方法的使用。
层析柱原理和使用方法
层析柱原理和使用方法层析柱是一种常用的色谱分离技术，它通过不同物质在固定相和移动相之间的分配系数差异来实现物质的分离和纯化。
在实际应用中，层析柱广泛应用于生物制药、化工、环境监测等领域。
本文将介绍层析柱的原理和使用方法，希望能为相关领域的研究人员提供一些参考和帮助。
层析柱的原理。
层析柱分离的原理主要是基于物质在固定相和移动相之间的分配系数不同而实现的。
固定相是填充在柱子内部的吸附剂，而移动相则是通过柱子内部的物质分离。
当样品混合物通过固定相时，不同成分会因为其与固定相的亲和力不同而在柱子内部发生分离。
这种分离过程可以通过控制移动相的流速和组成来实现，从而达到对混合物中不同成分的分离和纯化。
层析柱的使用方法。
1. 样品预处理，在进行层析柱分离之前，需要对样品进行预处理，包括溶解、过滤、稀释等步骤。
这些步骤能够保证样品的纯度和稳定性，有利于后续的分离过程。
2. 选择固定相，根据待分离物质的特性和分离要求，选择合适的固定相。
固定相的选择对于分离效果至关重要，不同的固定相对于不同的物质具有不同的亲和力，因此需要根据具体情况进行选择。
3. 封闭层析柱，在将固定相填充到柱子内部之后，需要进行封闭处理，以保证固定相的稳定性和均匀性。
这一步骤能够提高分离效果和保证实验的准确性。
4. 选择移动相，根据待分离物质的特性和固定相的选择，确定合适的移动相。
移动相的选择直接影响到分离的效果，因此需要进行仔细的考虑和实验验证。
5. 层析柱分离，将经过预处理的样品混合物通过封闭的层析柱，通过控制移动相的流速和组成，实现待分离物质的分离和纯化。
在分离过程中，需要密切关注柱子内部的情况，及时调整操作参数以保证分离效果。
6. 收集纯化物质，经过层析柱分离后，可以根据需要收集不同成分的纯化物质。
这些物质可以用于后续的实验研究或者工业生产中。
总结。
层析柱作为一种常用的色谱分离技术，具有分离效果好、操作简便等优点，在生物制药、化工、环境监测等领域有着广泛的应用。
层析技术
（一）凝胶层析法凝胶层析又称分子筛过滤、排阻层析等。
它的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。
对于高分子物质有很好的分离效果。
⒈凝胶的选择根据实验目的不同选择不同型号的凝胶。
如果实验目的是将样品中的大分子物质和小分子物质分开，由于它们在分配系数上有显著差异，这种分离又称组别分离，一般可选用SephadexG-25和G-50，对于小肽和低分子量的物质（1000-5000）的脱盐可使用SephadexG-10，G-15及Bio-Gel-p-2或4.如果实验目的是将样品中一些分子量比较近似的物质进行分离，这种分离又叫分级分离。
一般选用排阻限度略大于样品中最高分子量物质的凝胶，层析过程中这些物质都能不同程度地深入到凝胶内部，由于Kd不同，最后得到分离。
⒉柱的直径与长度根据经验，组别分离时，大多采用2-30cm长的层析柱，分级分离时，一般需要100cm左右长的层析柱，其直径在1-5cm范围内，小于1cm产生管壁效应，大于5cm则稀释现象严重。
长度L与直径D的比值L/D一般宜在7-10之间，但对移动慢的物质宜在30-40之间。
⒊凝胶柱的制备：凝胶型号选定后，将干胶颗粒悬浮于5-10倍量的蒸馏水或洗脱液中充分溶胀，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去。
自然溶胀费时较长，加热可使溶胀加速，即在沸水浴中将湿凝胶浆逐渐升温至近沸，1-2小时即可达到凝胶的充分胀溶。
加热法既可节省时间又可消毒。
凝胶的装填：将层析柱与地面垂直固定在架子上，下端流出口用夹子夹紧，柱顶可安装一个带有搅拌装置的较大容器，柱内充满洗脱液，将凝胶调成较稀薄的浆头液盛于柱顶的容器中，然后在微微地搅拌下使凝胶下沉于柱内，这样凝胶粒水平上升，直到所需高度为止，拆除柱顶装置，用相应的滤纸片轻轻盖在凝胶床表面。
稍放置一段时间，再开始流动平衡，流速应低于层析时所需的流速。