表阿霉素脂质体的制备与质量评价

[收稿日期] 2007-11-23

[作者简介] 吴 燕(1979-),女,湖北省红安县人,在读博士生,E mai:l w uyan2001@163.co m ,Te:l 010 ********。

*通讯联系人,梅兴国,男,博士生导师,研究员,T el/Fax :010

66932644

表阿霉素脂质体的制备与质量评价

吴 燕1

,吴 诚2

,康艳敏3

,梅兴国

1*

(1.军事医学科学院毒物药物研究所,北京 100850;2.第二炮兵总医院药剂科,北京 100088;

3.延边大学药学院,吉林延吉 133000)

[摘要] 目的:制备盐酸表阿霉素脂质体,建立H PLC 含量测定方法并优选包封率测定方法。方法:采用薄膜分散 p H 梯度法制备盐酸表阿霉素脂质体;采用HPLC 测定药物含量;采用葡聚糖凝胶色谱、超滤及透析3种分离方法测定脂质体的包封率。结果:制备的表阿霉素脂质体粒径较小、分布较窄;3种方法测得盐酸表阿霉素脂质体的包封率分别为96.1%,98.4%,92.9%;结论:薄膜分散 p H 梯度法适于制备盐酸表阿霉素脂质体,含量测定方法可靠。超滤法可以准确、快速地测定脂质体包封率。[关键词] p H 梯度法;盐酸表阿霉素;脂质体;包封率[中图分类号] R 979.1

[文献标识码] A

[文章编号] 1000 5501(2008)02 0165 03

P reparation and quality control of epirubicin hydrochloride liposo m es

WU Yan 1

,WU Cheng 2

,KANG Yan M in 3

,MEI X ing Guo

1*

(1.Instit ute o f Phar m aco l ogy and T ox i co l ogy ,A cade m y ofM ilitary M edical Sciences ,B eiji ng 100850,Ch i na ;2.T he Sec ond A rtillery G enera lH osp ita,l Be iji ng 100088,Ch i na ;3.Co lleg e of Phar m acy ,Y anbian U n i versity ,Y anj,i J ilin 133000,Ch i na)

[Abstract] O b jectives :T o prepa re epirubic i n hydroch l o ri de liposom es (Epi li p),estab lish an HPLC me t hod for the deter m i nation o f EP I and to opti m i ze the m ethod fo r determ i nation o f entrap m ent effic i ency (EE %).M ethod s :Epi lip w as prepared by thin fil m p H g rad i ent m ethod .Sephadex G 50chro m atog raphy ,the u ltrafiltra tion m et hod and dialysis m et hod w ere used to deter m i ne EE %o f li posomes .R esu lts :T he EP I li p had a s m a ll particle size and narro w size distributi on .T he EE %of li poso m es was 96.1%,98.4%and 92.9%de ter m i ned by Sephadex G50chrom atog raphy ,ultra filtrati on and dia l ys i s respectively .Conc l u sion :The t h i n fil m p H g rad i entm ethod i s suitable for prepa ration of Ep i li p .T he H PLC m ethod i s sensitive and accurate .T he u ltrafiltra tion m ethod can deter m i ne EE%of li poso m es accura tely and qu i ckly .[K ey words] p H g radien tm ethod ;ep irub i c i n hydroch l o ri de ;li po so m e ;entrap m ent effic i ency 表阿霉素(表柔比星,ep irub i c i n ,EP I)是一种新型蒽环类抗肿瘤药,为阿霉素的同分异构体。其骨髓抑制和心脏毒性比阿霉素低25%,主要应用于肝癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌和白血病的化疗[1]。EPI 是一种高效、广谱的抗肿瘤药,为同类药物的首选,单一用药对多种肿瘤有广谱的抑制作用,但临床使用的注射用盐酸表阿霉素容易发生脉管疼痛和脉管炎,长期应用有骨髓抑制,对肝功能不全者易产生蓄积中毒,特别是对心脏的毒性限制了其广泛应用[2]。脂质体作为抗肿瘤药物载体具有改变药物在组织中的分布,提高靶向性,减小毒副作用的特点。本研究制备了表阿霉素脂质体,并对制剂进行了初步的评价,旨在为临床提供一种新的高效低毒制剂。

1 仪器与试药

1.1 仪器

L 2130型HPLC(日本日立公司);RE5299型旋转蒸发

仪(巩义市英峪予华仪器厂);A vesti n C 3型高压均质机(加拿大);激光粒度分析仪(德国Sympatec Gm b H 公司);J E M 1230型透射电子显微镜(日本电子公司);C intra 10e 紫外 可见分光光度计(澳大利亚GBC 公司);2132电子蠕动泵(瑞典LKB B romm a 公司);Z 160M 台式微量离心机(德国H er m l ego 公司);W a terP ro PS 纯水系统(德国L abconco 公司);M D34透析袋(截留相对分子质量为14 103,美国So larb i o 公司);超滤管(截留相对分子质量30 103,美国M i n i pore 公司);

1.2 试药与试剂

表阿霉素及其对照品(浙江海正药业);蛋黄卵磷脂(纯

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军事医学科学院院刊 2008年4月第32卷第2期Bu llAcad M ilM ed S c,i Apr 2008; Vol 32 No 2

度>98%,德国L i poid 公司);胆固醇(北京化学试剂公司);mPEG 2000 DSPE(美国G enzy m e 公司);DSPG (德国L i po i d 公司);葡聚糖凝胶G 50(100~300 m ,瑞士B i oche m i ka 公司);其他试剂均为分析纯,水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 脂质体的制备

称取处方量的磷脂,用氯仿/甲醇混合溶剂溶解于茄形瓶中,50 旋转蒸发至磷脂成半透明膜或白色蜂巢状,真空干燥过夜。用p H 4.0柠檬酸盐缓冲液水化薄膜。待磷脂水化完全后,15000psi 高压均质循环3~5次使粒径减小到150n m 左右,即得空白脂质体。调节空白脂质体外相的p H 为7.8左右,40 左右预热后,缓慢加入表阿霉素水溶液,混合并轻摇均匀,继续温育20m in ,即得表阿霉素脂质体。2.2 含量测定方法的建立

2.2.1 色谱条件及色谱行为 色谱柱:V enusilM P C18(4.6mm 250mm ,5 m );流动相为乙腈!甲醇!磷酸盐缓冲液(36!32!32,磷酸盐p H 2.5);UV 检测吸收波长为227nm ;流速为1.0m l/m i n 。室温检测;进样量为20 l 。保留时间4.3m i n ,表阿霉素脂质体经甲醇破膜后进样,其色谱图见图1

。

图1 表阿霉素H PLC 色谱图

1.磷脂;

2.表阿霉素

2.2.2 系统适用性考察 采用酸、碱、热、光照等条件对60 g /m l 的药物溶液进行破坏性实验,以考察方法的专属性。结果表明,酸、碱、高温、光照等剧烈条件下产生的降解产物均对主药峰不产生干扰,本方法专属性较好。

2.2.2.1 酸破坏 取1m l EP I 母液加1m l 1m ol/L HC,l 50 加热30m i n ,定容至5m ,l 进样测定。EP I 酸破坏的色谱图见图2

。

图2 表阿霉素酸破坏色谱图

2.2.2.2 碱破坏 取EPI 母液1m ,l 加0.05mo l/L N aOH 混匀5m in ,定容至5m ,l 进样测定。EP I 碱破坏的色谱图见图3。

2.2.2.3 高温破坏 取EP I 母液1m ,l 在75 加热2h ,定

容至5m ,l 进样测定。EP I 高温破坏的色谱图见图4。

2.2.2.4 光照破坏 取EP I 母液1m ,l 在4500l x 强光下照射24h ,定容至5m ,l 进样测定。EP I 光破坏的色谱图见图5。

图5 表阿霉素光照破坏色谱图

2.2.3 标准曲线的建立 分别精密量取对照品储备液(100 g /m l)2.5,2.0,1.0,0.5,0.25,0.05,0.01m l 置10m l 容量瓶中,加甲醇溶解,定容。分别进样测定,记录色谱图,以峰面积A 对浓度C 作线性回归,得回归方程为A =216300C -34525,r 2=0.9996;表明表阿霉素在0.1~25 g /m l 范围内线性良好。2.2.4 方法学考察

2.2.4.1 精密度考察 分别取20.0,5.0,0.5 g /m l(高、中、低浓度)的表阿霉素供试品溶液,于一日内不同时间共进样5次,计算日内精密度;连续进样5d 测定,计算日间RSD 。结果日内日间精密度均<2%,表明供试品溶液4 放置5d 比较稳定。2.2.4.2 回收率试验

精密量取空白脂质体溶液0.2m ,l

置10m l 量瓶中,分别精密加入对照品储备溶液6.0,1.5,0.15m ,l 甲醇破膜定容后分别进样测定,计算回收率分别为99.1%,100.9%,100.5%,RSD 均<2%(n =3),表明供试品溶液回收率试验符合要求。2.3 脂质体理化性质考察

2.3.1 形态观察 将脂质体稀释50倍,用少量2%磷钨酸负染后滴加到专用铜网上,自然挥干,使粒子浓缩沉积,在透射电子显微镜下观察可见圆形或类圆形粒子(图6)。2.3.2 脂质体粒径和粒度分布 粒度仪测定结果如图7,平均粒径X 50为149.87n m,

X 10=111.18n m,X 90=

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图6 表阿霉素脂质体的透射电镜照片( 200000) 190.00nm,跨距0.53。

跨距计算公式:(X

90-X

10

)/X

50

图7 表阿霉素脂质体粒径分布

2.3.3 脂质体相变温度的测定 脂质体的相变温度影响脂

质体的稳定性和体内药代学行为,测定脂质体的相变温度是

脂质体制剂评价的较重要的指标。

测定脂质体制剂相变温度的经典方法为差示扫描量热

法(diff e renti a l scann i ng ca l o ri m etry,D SC)。其原理是在程序

控温条件下,直接测定样品在升温、降温或恒温过程中吸收

或释放的能量。Epi li p脂质体的典型DSC图如图8

所示。

图8 表阿霉素脂质体DSC图谱

2.3.4 包封率 采用凝胶柱色谱法、超滤法、透析法等3种

方法除去水溶性药物脂质体外部未包封的游离药物,按照下

式计算表阿霉素脂质体的包封率。

包封率=系统中包封的药量/系统中包封与未包封的总

药量 100%[3]

2.3.4.1 葡聚糖凝胶柱色谱法 色谱条件:Sephadex G50

柱(20c m 1.5c m);洗脱液为蒸馏水;流速为1.0m l/m i n。

每流分收集1m l。将收集的流分测定紫外吸光度。合并4~

8m l的红色乳液,用甲醇破膜并定容至25m l容量瓶,用

H PLC法测定含量,计算EE%为96.1%(n=3)。

2.3.4.2 超滤法 取制备好的脂质体0.2m l分别于超滤

管中13000r/m i n离心5m i n,取超滤管下的滤液用HPLC测

定游离表阿霉素的含量,计算得包封率为98.4%(n=3)。

2.3.4.3 透析法[4] 将2.0m l脂质体置于透析袋中,两头

用透析夹夹紧。透析介质为50m l去离子水,37水浴振

荡,室温下透析6h,取透析外液进H PLC测定,测定游离表

阿霉素的含量,计算EE%为92.9%(n=3)。

3讨论

对水溶性药物采用被动载药法制备脂质体,包封率一般

很难超过40%。本研究中采用的薄膜分散 p H梯度法,是在

制备空白脂质体后,弱碱性药物能与脂质体内水相缓冲盐形

成稳定的胶态酸 碱复合物,表阿霉素虽包载进入内水相,但

内相游离的药物浓度却很低,促使外水相的药物进一步进入

脂质体内部[4]。该主动载药法可将水溶性弱碱药物包封率

提高到90%以上。

流动相的p H对Epi的出峰时间影响较大,p H越低出峰

时间越前移。因为EP I为弱碱性药物(p K a为8.3)[5],在低

p H环境中,EP I分子中柔毛霉糖环上的氨基带正电荷,分子

极性增大[6],因而在C18柱上的保留时间越短。

从几种方法测定包封率的结果看,该制剂包封率较高。

凝胶柱层析法经济、适合实验室使用;超滤法快捷准确,5

m i n内可将脂质体与游离药物分离,且重现性好;透析法时

间较长,对于有些低相变温度磷脂制备的脂质体有可能发生

漏药的可能。

[参考文献]

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(本文编辑 杨兆弘)

167 第2期 吴 燕,等 表阿霉素脂质体的制备与质量评价