实验 电泳分离蛋白质实验
实验二聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE鉴定免疫球蛋白
将制备好的凝胶放入电泳槽，加入电泳缓冲液， 拨除梳子。用微量移液器点样。 5、电泳
样品在浓缩胶时，低电压（60~80V，起始电流不超过10~15mA）， 进入分离胶后，提高电压（100~200V，电流不超过30mA），当 指示剂溴酚蓝前沿距离胶1~2mm，终止电泳。最好在低温下进行。
6、染色与脱色
2、在一塑料盒里加入少量转膜液，将滤纸与胶浸泡 于其中5-10min；PVDF膜浸入甲醇中2min
3、制备“夹心饼”：（膜可比滤纸稍大，防止短路） 提起滤纸平放在盒盖上，用洁净15ml离心管压走多 余的buffer，以不滴水为宜，平铺在半干转印槽上， 再将湿润的膜（实验室统一剪角标记）放在该层滤纸 上；接下来将已切角的胶平铺在膜上，在最上层再铺 上滤纸并压走多余液体。
四肽链结构
所有Ig的基本单位都是四条肽链的对称结构。两条重 链（H）和两条轻链（L）。
三、试剂与器材
1、30%的丙烯酰胺
2、10%SDS 3、TEMED 4、10%过硫酸铵
5、5xSDS-PAGE电泳缓冲液
6、浓缩胶缓冲液（PH6.8）
6.0 g Tris , 48mL 1mol/L HCl,加水至100ml.
4、转膜：（半干转）（PVDF膜0.22UM） 半干转移中，一般恒流（1-1.5mA/cm2，60-90min），
恒压的话15v 60分钟就可以了。 5、关闭电源，用镊子夹取PVDF膜，转移到塑料盒中，加入
5%脱脂奶粉4℃封闭过夜。 6、弃去封闭液，用TBST洗膜3次，每次5min 7、加入一抗，室温平缓摇动2h； 8、废弃液体用TBST洗膜3次，每次5min； 9、加入二抗，室温下孵育1h； 10、废弃液体用TBST洗膜3次，每次5min； 11、显色 在DAB中显色约10-30min，待蛋白质带的颜色
蛋白滴定电泳实验报告
一、实验目的1. 掌握蛋白滴定电泳的基本原理和操作方法；2. 学习通过蛋白滴定电泳对蛋白质进行分离和鉴定；3. 熟悉实验数据的处理和分析方法。
二、实验原理蛋白滴定电泳是一种基于蛋白质在特定pH值下的等电点（pI）和电荷性质差异的分离技术。
当蛋白质溶液的pH值等于其等电点时，蛋白质不带净电荷，因此在电场中不发生移动。
当溶液pH值低于或高于蛋白质的等电点时，蛋白质分别带正电荷或负电荷，在电场中发生向相应电极方向的移动。
通过调节溶液pH值，可以使蛋白质在电场中分离。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 蛋白质样品（如血清蛋白、细胞提取物等）- 标准蛋白质溶液（如牛血清白蛋白、肌红蛋白等）- 氨水、盐酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠等试剂- 水浴锅、电泳仪、紫外可见分光光度计、凝胶成像系统等仪器2. 实验试剂：- 氨水（25%）- 盐酸（1.0mol/L）- 磷酸二氢钠（0.1mol/L）- 磷酸氢二钠（0.1mol/L）- 碳酸钠（0.1mol/L）- 硫酸铵（饱和溶液）四、实验步骤1. 准备蛋白质样品：取一定量的蛋白质样品，加入适量的磷酸缓冲溶液，混匀后，用紫外可见分光光度计测定蛋白质浓度。
2. 准备电泳凝胶：按照实验要求配置凝胶，加入适量的氨水和盐酸，混匀后，倒入凝胶模具中，静置固化。
3. 加样：将蛋白质样品和标准蛋白质溶液分别加入电泳凝胶的孔中。
4. 滴定：用磷酸缓冲溶液滴定蛋白质样品和标准蛋白质溶液，调节溶液pH值至蛋白质的等电点。
5. 电泳：将电泳凝胶放入电泳仪中，设定电压和时间，进行电泳分离。
6. 成像与分析：电泳结束后，用凝胶成像系统对凝胶进行成像，分析蛋白质分离结果。
五、实验结果与分析1. 蛋白质分离：通过蛋白滴定电泳，可以将蛋白质样品中的不同组分分离出来，形成不同的区带。
2. 定性鉴定：根据标准蛋白质溶液的迁移距离和蛋白质样品的迁移距离，可以初步判断蛋白质样品中的组分。
3. 定量分析：通过比较蛋白质样品和标准蛋白质溶液的吸收峰面积，可以计算出蛋白质样品中各组分的相对含量。
实验十一 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质
实验十一聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质一、目的1、掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳技术；2、掌握同工酶遗传标记的分析方法。
二、原理聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE(Polyacrylamide gel electrophoresis)，是以聚丙烯酰胺凝胶为作为支持介质的一种常见电泳技术。
聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺（Acr）和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。
催化聚合的常用方法有两种：化学聚合法和光聚合法。
化学聚合法以过硫酸铵（AP）为催化剂，以四甲基乙二胺（TEMED）为加速器。
在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。
由于同工酶的酶蛋白分子的大小和结构不同，携带的电荷种类和数量不同，所以可用凝胶电泳将它们一一分开。
在适宜酶催化反映的条件下提供酶作用的底物，再利用特殊的显色反应以显示产物的形成或底物的消失，就可以看到经电泳分离后的同工酶谱带。
同工酶的鉴定过程通常如下：1、从植物样品中提取粗酶液；2、聚丙烯酰胺凝胶电泳把样品中酶带分开；用专一作用底物和特殊染料把需要分析的酶染色，显示同工酶谱。
同工酶技术是通过电泳和组织化学方法进行特异性染色而把酶蛋白分子分离，并将其位置和活性直接在染色区带以酶谱的形式标记出来。
分离同工酶的方法有：电泳法、层析法、酶学法和免疫学其中以电泳法最为普遍，电泳法中又以垂直平板聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨率为最好。
聚丙烯酰胺凝胶电泳有三种物理效应：1、样品的浓缩效应；2、凝胶的分子筛效应；3、一般的电泳分离的电荷效应。
三、仪器、设备、药品及材料仪器、设备：电泳仪、电泳槽、离心机、移液管、装凝胶用的玻璃管（内径为5mm、长度为90mm）。
垂直板电泳装置图药品：三羟甲基氨基甲烷（Tris）、四甲基乙二胺（TEMED）、丙烯酰胺（Acr）、价差双丙烯酰胺（Bir）、甘氨酸、过硫酸铵（AP）、蔗糖、溴酚蓝、联苯胺、过氧化氢。
蛋白质sdspage电泳实验报告
蛋白质sdspage电泳实验报告蛋白质SDS-PAGE电泳实验报告引言：蛋白质是生命体中最基本的分子之一，它们在细胞的结构和功能中起着重要的作用。
为了研究蛋白质的性质和功能，科学家们开发了许多技术和方法。
其中，SDS-PAGE电泳是一种常用的蛋白质分析方法，它通过电泳的方式将蛋白质按照其分子量大小进行分离和定量。
实验目的：本实验旨在通过SDS-PAGE电泳技术对不同来源的蛋白质进行分析，了解其分子量和纯度，并探讨其应用于蛋白质研究中的意义。
实验步骤：1. 样品制备：收集不同来源的蛋白质样品，如乳清蛋白、鸡蛋清蛋白等。
将样品加入SDS-PAGE样品缓冲液中，加热至100摄氏度，使蛋白质完全变性。
2. 准备电泳胶：根据实验需要，配制相应浓度的聚丙烯酰胺凝胶，加入TEMED和过硫酸铵使其聚合。
3. 装载样品：将变性后的蛋白质样品注入电泳胶槽中，注意不要产生气泡。
4. 电泳：将电泳胶槽连接至电源，设置合适的电压和时间，进行电泳分离。
5. 凝胶染色：将电泳胶取出，用凝胶染色剂染色，使蛋白质带可见。
6. 图像分析：使用分子量标准品作为参照，通过图像分析软件测量蛋白质带的迁移距离，计算其分子量。
实验结果：通过SDS-PAGE电泳实验，我们成功地将不同来源的蛋白质样品分离出来，并得到了清晰的蛋白质带。
根据分子量标准品的迁移距离，我们计算出了各个蛋白质样品的分子量。
讨论：1. 分子量测定：通过SDS-PAGE电泳实验，我们可以准确地测定蛋白质的分子量。
这对于研究蛋白质的结构和功能非常重要，因为不同分子量的蛋白质可能具有不同的生物活性和相互作用方式。
2. 纯度分析：通过观察电泳胶上的蛋白质带的清晰度和数量，我们可以初步评估样品的纯度。
纯度高的样品通常只有一个清晰的蛋白质带，而纯度低的样品则可能有多个模糊的带。
因此，SDS-PAGE电泳可以帮助我们选择纯度较高的蛋白质样品进行后续实验。
3. 应用前景：SDS-PAGE电泳技术在生物医学研究中有着广泛的应用前景。
SDS-PAGE电泳实验步骤
垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质一、实验目得学习ＳDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳法(ＳDS—ＰAGＥ)测定蛋白质得分子量得原理与基本操作技术、二、实验原理蛋白质就是两性电解质,在一定得ｐH条件下解离而带电荷。
当溶液得pH大于蛋白质得等电点(pＩ)时,蛋白质本身带负电,在电场中将向正极移动;当溶液得pH小于蛋白质得等电点时,蛋白质带正电,在电场中将向负极移动;蛋白质在特定电场中移动得速度取决于其本身所带得净电荷得多少、蛋白质颗粒得大小与分子形状、电场强度等。
聚丙烯酰胺凝胶就是由一定量得丙烯酰胺与双丙烯酰胺聚合而成得三维网状孔结构、本实验采用不连续凝胶系统,调整双丙烯酰胺用量得多少,可制成不同孔径得两层凝胶;这样,当含有不同分子量得蛋白质溶液通过这两层凝胶时,受阻滞得程度不同而表现出不同得迁移率。
由于上层胶得孔径较大,不同大小得蛋白质分子在通过大孔胶时,受到得阻滞基本相同,因此以相同得速率移动;当进入小孔胶时,分子量大得蛋白质移动速度减慢,因而在两层凝胶得界面处,样品被压缩成很窄得区带。
这就就是常说得浓缩效应与分子筛效应。
同时,在制备上层胶(浓缩胶)与下层胶(分离胶)时,采用两种缓冲体系;上层胶ｐＨ=6、7—6。
8,下层胶pH=8.9;Tris—HCＩ缓冲液中得Triｓ用于维持溶液得电中性及pＨ,就是缓冲配对离子;ＣI－就是前导离子。
在pH6.８时,缓冲液中得Gly—为尾随离子,而在pH＝8、９时,Gly得解离度增加;这样浓缩胶与分离胶之间ｐH得不连续性,控制了慢离子得解离度,进而达到控制其有效迁移率之目得。
不同蛋白质具有不同得等电点,在进入分离胶后,各种蛋白质由于所带得静电荷不同,而有不同得迁移率、由于在聚丙烯酰胺凝胶电泳中存在得浓缩效应,分子筛效应及电荷效应,使不同得蛋白质在同一电场中达到有效得分离。
如果在聚丙烯酰胺凝胶中加入一定浓度得十二烷基硫酸钠(SDS),由于SDＳ带有大量得负电荷,且这种阴离子表面活性剂能使蛋白质变性,特别就是在强还原剂如巯基乙醇存在下,蛋白质分子内得二硫键被还原,肽链完全伸展,使蛋白质分子与SDS充分结合,形成带负电性得蛋白质—SDS复合物;此时,蛋白质分子上所带得负电荷量远远超过蛋白质分子原有得电荷量,掩盖了不同蛋白质间所带电荷上得差异、蛋白质分子量愈小,在电场中移动得愈快;反之,愈慢。
实验报告蛋白质电泳分析
实验报告蛋白质电泳分析实验报告：蛋白质电泳分析一、实验目的本次实验旨在通过蛋白质电泳技术，对不同样品中的蛋白质进行分离和分析，以了解蛋白质的分子量、纯度和组成等特性，为进一步的研究和应用提供基础数据。
二、实验原理蛋白质电泳是根据蛋白质在电场中的迁移率差异来分离蛋白质的一种技术。
在电场的作用下，带电荷的蛋白质分子会向与其电荷相反的电极方向移动。
迁移率的大小取决于蛋白质的分子量、电荷数量和形状等因素。
常用的蛋白质电泳方法有 SDSPAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）和 NativePAGE（非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳）。
SDSPAGE 中，蛋白质与 SDS（十二烷基硫酸钠）结合形成带负电荷的复合物，消除了蛋白质分子原有的电荷和形状差异，仅根据分子量的大小进行分离。
NativePAGE 则在非变性条件下进行，保持了蛋白质的天然构象和电荷状态，可用于研究蛋白质的活性和相互作用。
三、实验材料与设备（一）材料1、样品：待分析的蛋白质样品，如血清、细胞裂解液等。
2、标准蛋白：已知分子量的蛋白质标准品。
3、丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺：用于制备凝胶。
4、 SDS（十二烷基硫酸钠）。
5、 Tris（三羟甲基氨基甲烷）。
6、过硫酸铵和 TEMED（四甲基乙二胺）：引发丙烯酰胺聚合。
7、电泳缓冲液：Tris甘氨酸缓冲液。
8、染色液：考马斯亮蓝 R-250 染色液。
9、脱色液：甲醇乙酸溶液。
（二）设备1、电泳仪：提供稳定的电场。
2、垂直电泳槽：用于容纳凝胶和进行电泳。
3、移液器和吸头。
4、离心管和离心机。
5、恒温水浴锅。
6、微波炉。
7、凝胶成像系统：用于观察和记录电泳结果。
四、实验步骤（一）制胶1、装配电泳槽：将玻璃板洗净、晾干，安装在电泳槽中，并确保密封良好，无渗漏。
2、制备分离胶：根据所需的浓度，将丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、TrisHCl 缓冲液、过硫酸铵和 TEMED 按比例混合，迅速摇匀后注入玻璃板之间，留出灌注浓缩胶的空间，然后用蒸馏水覆盖。
电泳分离血清蛋白实验报告
竭诚为您提供优质文档/双击可除电泳分离血清蛋白实验报告篇一：醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白实验报告前言血清蛋白：血清蛋白是血液中脂肪酸的携带者。
当身体需要能量或者需要建造材料时，脂肪细胞就把脂肪酸释放到血液中，脂肪酸被血清蛋白获取，并被运送到需要的部位。
牛血清白蛋白的相对分子质量为10的4次方这个级别，它不是一定的，是多聚物，有的地方测的70000，这就是一个数据了。
在做pcR的时候会用到它。
牛血清蛋白是血液的主要成分，分子量68kD。
等电点4.8。
含氮量16%，含糖量0.08%。
仅含已糖和已糖胺，含脂量只有0.2%。
白蛋白由581个氨基酸残基组成，其中35个半胱氨酸组成17个二硫键，在肽链的第34位有一自由巯基。
白蛋白可与多种阳离子、阴离子和其他小分子物质结合。
血液中的白蛋白主要起维持渗透压作用、ph缓冲作用、载体作用和营养作用。
在动物细胞无血清培养中，添加白蛋白可起到生理和机械保护作用和载体作用。
醋酸纤维薄膜电泳：醋酸纤维薄膜电泳以醋酸纤维薄膜为支持物。
它是纤维素的醋酸酯，由纤维素的羟基经乙酰化而制成。
它溶于丙酮等有机溶液中，即可涂布成均一细密的微孔薄膜，厚度以0.1mm—0.15mm为宜。
太厚吸水性差，分离效果不好；太薄则膜片缺少应有的机械强度则易碎。
应用醋酸纤维薄膜电泳操作简单、快速、廉价。
已经广泛用于血清蛋白，血红蛋白，球蛋白，脂蛋白，糖蛋白，甲胎蛋白，类固醇激素及同工酶等的分离分析中，尽管它的分辨力比聚丙酰胺凝胶电泳低，但它具有简单，快速等优点。
特点：1.（1）醋酸纤维薄膜对蛋白质样品吸附极少，无“拖尾”现象，染色后背景能完全脱色，各种蛋白质染色带分离清晰，因而提高了测定的精确性。
（2）快速省时。
由于醋酸纤维薄膜亲水性较滤纸小，薄膜中所容纳的缓冲液也较少，电渗作用小，电泳时大部分电流是由样品传导的，所以分离速度快，电泳时间短，一般电泳45—60min即可，加上染色，脱色，整个电泳完成仅需90min左右。
SDS-PAGE电泳实验步骤
垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质一、实验目的学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS—PAGE)测定蛋白质的分子量的原理和基本操作技术。
二、实验原理蛋白质是两性电解质，在一定的pH条件下解离而带电荷。
当溶液的pH大于蛋白质的等电点(pI)时，蛋白质本身带负电，在电场中将向正极移动；当溶液的pH小于蛋白质的等电点时，蛋白质带正电，在电场中将向负极移动；蛋白质在特定电场中移动的速度取决于其本身所带的净电荷的多少、蛋白质颗粒的大小和分子形状、电场强度等。
聚丙烯酰胺凝胶是由一定量的丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合而成的三维网状孔结构。
本实验采用不连续凝胶系统，调整双丙烯酰胺用量的多少，可制成不同孔径的两层凝胶；这样，当含有不同分子量的蛋白质溶液通过这两层凝胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。
由于上层胶的孔径较大，不同大小的蛋白质分子在通过大孔胶时，受到的阻滞基本相同，因此以相同的速率移动；当进入小孔胶时，分子量大的蛋白质移动速度减慢，因而在两层凝胶的界面处，样品被压缩成很窄的区带。
这就是常说的浓缩效应和分子筛效应。
同时，在制备上层胶(浓缩胶)和下层胶(分离胶)时，采用两种缓冲体系；上层胶pH=6.7—6.8，下层胶pH＝8.9；Tris —HCI缓冲液中的Tris用于维持溶液的电中性及pH，是缓冲配对离子；CI-是前导离子。
在pH6.8时，缓冲液中的Gly-为尾随离子，而在pH＝8.9时，Gly的解离度增加；这样浓缩胶和分离胶之间pH的不连续性，控制了慢离子的解离度，进而达到控制其有效迁移率之目的。
不同蛋白质具有不同的等电点，在进入分离胶后，各种蛋白质由于所带的静电荷不同，而有不同的迁移率。
由于在聚丙烯酰胺凝胶电泳中存在的浓缩效应，分子筛效应及电荷效应，使不同的蛋白质在同一电场中达到有效的分离。
如果在聚丙烯酰胺凝胶中加入一定浓度的十二烷基硫酸钠(SDS)，由于SDS带有大量的负电荷，且这种阴离子表面活性剂能使蛋白质变性，特别是在强还原剂如巯基乙醇存在下，蛋白质分子内的二硫键被还原，肽链完全伸展，使蛋白质分子与SDS充分结合，形成带负电性的蛋白质—SDS复合物；此时，蛋白质分子上所带的负电荷量远远超过蛋白质分子原有的电荷量，掩盖了不同蛋白质间所带电荷上的差异。
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实验电泳分离蛋白质实验
1、实验目的
（1）学习SDS-PAGE分离检测蛋白质的原理；
（2）掌握SDS-PAGE不连续凝胶电泳分离检测蛋白质的操作方法。
2、实验原理
聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和交联试剂N，N′-甲叉双丙烯酰胺在有引发剂和增速剂的情况下聚合而成的一种三维立体网状结构的凝胶物质，是目前生化和分子生物学实验中常用的电泳支持介质。
聚合反应时常用的催化剂或者引发剂有过硫酸铵、过硫酸钾及核黄素等物质。
N，N，N′，N′-四甲基乙二胺（TEMED）、3-二甲胺丙腈等物质可作为聚合过程的增速剂。
以聚丙烯酰胺凝胶为支持介质的电泳是依据蛋白质的分子量和带电性的差异而使不同分子量的蛋白质得到分离。
通过不同的电泳方法，即可探求蛋白质分子的各种特性，如分子量、等电点、电荷分布、免疫行为、生化特性等。
SDS（十二烷基硫酸钠）是一种阴离子去污剂，在电泳实验中作为变性剂和助溶剂，它能断裂蛋白质分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质的二级和三级结构。
在电泳样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，蛋白质分子被解聚成多肽链。
强还原剂如β-巯基乙醇则能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。
解聚后的氨基酸侧链与SDS充分结合成带负电荷的蛋白质-SDS复合物，由于SDS带有大量的负电荷，当其与蛋白质结合时，所带的负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷，因而掩盖了不同种类蛋白质分子间原有电荷的差异，使蛋白质分子均带有相同密度的负电荷。
蛋白质-SDS复合物在水溶液中的形状像一个长椭圆棒。
不同的蛋白质的SDS复合物的短轴长度基本上是相同的，约为1.8nm。
但长轴的长度则与亚基分子量的大小成正比。
因此这种复合物在SDS-聚丙烯酰胺凝胶系统中的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而主要取决于椭圆棒的长轴的长度，即蛋白质或亚基分子量的大小。
由于SDS电泳分离蛋白质分子时，电泳迁移率只取决与分子解聚后SDS-蛋白质复合物的大小，即蛋白质分子量的大小，因此凝胶浓度的选择尤为重要。
交联度为2.6%的条件下，在10%的凝胶中，蛋白质的分子量在25KD到200KD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。
在15%的凝胶中，蛋白质的分子量在10KD至50KD之时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。
因此，可以根据所测的分子量的范围选择合适的凝胶浓度以及相应的已知分子量的标准蛋白。
3、实验试剂及仪器
（1）实验试剂
丙烯酰胺（Acr），N，N′-甲叉双丙烯酰胺（Bis），N，N，N′，N′-四甲基乙二胺（TEMED），十二烷基硫酸钠（SDS），甘氨酸，过硫酸铵（AP）（以上试剂均为电泳纯），β-巯基乙醇，Tris，丙三醇，三氯乙酸，冰醋酸，甲醇，考马斯亮蓝，盐酸（HCl），溴酚蓝，冰醋酸，标准分子量蛋白，未知分子量蛋白样品。
（2）实验仪器
垂直板电泳槽一套，直流稳压电源（500伏、100毫安），抽气装置，凝胶成像系统，1mL、10~200µL移液枪各一支，滤纸，胶皮手套，细长针头（15cm）。
4、电泳工作液的配制
（1）10%SDS溶液，250mL
取25g电泳级SDS，用双蒸水溶解后定容至250ml，室温下可长期保存。
（2）丙烯酰胺单体贮液，50mL
精确称取14.55g丙烯酰胺，0.45g N，N'-甲叉双丙烯酰胺，首先用40mL双蒸水溶解搅拌，直到溶液变成透明，再用双蒸水稀释定容到50mL，过滤，丙烯酰胺和双丙烯酰胺在贮存过程中缓慢转变为丙烯酸和双丙烯酸，这一脱氨基反应是光催化或碱催化的，故应核实溶液的pH值不超过7.0。
置棕色瓶中在4℃可保存一个月。
注意：丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性并容易吸附于皮肤，配制时一定要做好防护措施。
（3）分离胶缓冲液贮液(1.5mol/L Tris-HCl，pH8.8)，50mL
称取9.08gTris溶解在40mL双蒸水中，加2mL10%SDS，用4 mol/L HCl调pH至8.8,再用双蒸水定容至50mL，4℃保存。
（4）浓缩胶缓冲液贮液(1 mol/L Tris-HCl，pH6.8)，50mL
称取6.06gTris碱溶解在40mL双蒸水中，加2mL10%SDS，再用双蒸水定容至50mL，4℃保存。
（5）10%过硫酸铵溶液，1mL
称取0.1g过硫酸铵（AP），加1mL双蒸水溶解。
使用前配制。
（6）电极缓冲液，1000mL
精确称取3g Tris碱，14.4g甘氨酸和1g SDS 加双蒸水溶解，用4 mol/L HCl调pH至8.3左右，定容到1000mL。
也可以制成10×的储存液，在室温下长期保存。
（7）2倍样品缓冲液，10mL
2.0mL0.5 mol/L Tris-HCl（pH6.8）；2.0mL甘油（丙三醇）；4.0mL 10%SDS；0.5mL0.1%溴酚兰；1.0mLβ-巯基乙醇；0.5mL双蒸水。
（8）浓缩胶（T=5%）
单体贮液0.65mL；浓缩胶缓冲液贮液 1.25mL；10%SDS0.11mL；双蒸水 2.95mL；TEMED10µL；10%过硫酸铵40µL。
（9）分离胶（T=12%）
单体贮液4mL；分离胶缓冲液贮液2.5mL；10%SDS0.22mL；双蒸水3.2mL；TEMED20µL；10%过硫酸铵60µL。
（10）考马斯亮蓝染色液的配制
①固定液，1000mL
称取125g三氯乙酸，用500mL双蒸水溶解，再加300mL甲醇，最后用双蒸水定容至1000mL，室温保存。
②考马斯亮蓝染色液，1000mL
称取1.0g考马斯亮蓝R-250，用双蒸水800mL溶解，再加入100mL冰醋酸，100mL甲醇，定容后用滤纸过滤，除去溶液中的不溶物。
③考马斯亮蓝脱色液，1000mL
将100mL冰醋酸，100mL甲醇和800mL蒸馏水混合即可。
5、实验操作
（1）凝胶的灌制
①玻璃板先用清洁剂洗干净，然后清水冲洗几遍，再用双蒸水冲洗几遍，置于烘干箱内烘干，凉凉后根据厂家说明书安装。
②确定所需凝胶溶液体积，配制一定体积的分离胶溶液。
一旦加入TEMED，丙烯酰胺会马上开始聚合，故应立即快速旋动混合物并进入下步操作。
③用1mL移液枪迅速在两玻璃板的间隙中灌注丙烯酰胺溶液，留出灌注浓缩胶所需空间(梳子的齿长再加0.5cm)。
再在胶液面上小心注入一层水（约2~3mm高），以阻止空气进入凝胶溶液。
④分离胶聚合完全后（约30分钟），倾出覆盖水层，再用滤纸吸净残留水。
⑤制备浓缩胶。
制备一定体积及一定浓度的丙烯酰胺溶液，操作同步骤②。
⑥聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶，立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。
小心避免混入气泡，再加入浓缩胶溶液以充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下。
（2）样品处理
将待测的未知分子量蛋白样品用双蒸水配置溶液（2mg/mL），加入等体积的2倍样品缓冲液，于沸水浴加热5分钟后，置于-20℃保存，使用前置于室温融化后，沸水浴加热3~5分钟后上样。
低分子量蛋白标准蛋白质也同样处理。
（3）电泳过程
①浓缩胶聚合完全后（30分钟），小心倾斜移出梳子。
把凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加入Tris-甘氨酸电极缓冲液。
必须设法排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡。
②按给定顺序加样，加样量通常为20~45μL（1.0mm厚的胶）。
③将电泳装置与电源相接，凝胶上所加电流为10mA。
当染料前沿进入分离胶后，把电流提高到20mA，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约1cm，然后关闭电源。
④从电泳装置上卸下玻璃板，用刮勺撬开玻璃板。
紧靠最左边一孔（第一槽）凝胶下部切去一角以标注凝胶的方位。
（4）染色和脱色
经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质样品在电泳完毕，用固定液固定12小时，用考马斯亮蓝R-250染色2~4小时。
换脱色液脱色，需3~10小时，其间更换多次脱色液至背景清楚。
此方法检测灵敏度为0.2~1.0 μg。
脱色后，可将凝胶浸于水中，长期封装在塑料袋内而不降低染色强度。
为永久性记录，可对凝胶进行拍照，或将凝胶干燥成胶片。
6、实验数据处理
以标准分子量蛋白的相对迁移率（mR）为横坐标，相对分子量（Mr）的对数值为纵坐标。
在半对数坐标纸上作图，可得到一条直线，然后根据未知蛋白的迁移率，在半对数坐标上查出其对应的分子量。
7、思考题
（1）影响凝胶性质的因素有哪些？制得优良的凝胶需要注意哪些问题？
（2）影响蛋白分子分离效果的因素有哪些？在操作时应该注意哪些因素？。