实验四-玉米种子盐溶蛋白凝胶电泳.
盐溶蛋白电泳法鉴定玉米种子纯度试验中的几个问题
盐溶蛋白电泳法鉴定玉米种子纯度试验中的几个问题
向东山
【期刊名称】《内蒙古农业科技》
【年(卷),期】2006(000)002
【摘要】盐溶蛋白电泳法鉴定玉米种子纯度已经广泛应用于种子鉴定中,但仍然存在一定的技术问题.文章仅就鉴定过程中药品的选择、溶液的配制和电泳成像方面易出现问题的技术环节进行分析.
【总页数】2页(P34,36)
【作者】向东山
【作者单位】湖北省生物资源保护与利用重点试验室、湖北民族学院生物技术研究所,湖北,恩施,445000
【正文语种】中文
【中图分类】S513
【相关文献】
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5.改进的盐溶蛋白电泳法鉴定玉米品种农大108种子纯度及品种真实性 [J], 张文玲
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实验四-玉米种子盐溶蛋白凝胶电泳
④贮备液D（浓缩胶贮备液）：称取9.3gAcr和0.31gBis，先 加入30ml去离子水，搅拌至完全溶解，再定容到50ml，倒入 棕色瓶中低温保存。 ⑤贮备液E（浓缩胶缓冲液）：吸取含量为88%甲酸 0.218ml，称取甲酸钠0.5228g，加入30ml去离子水溶解，并 定容到50ml，调节pH至5.6。倒入棕色瓶中低温保存。或者 先溶解甲酸钠，然后用甲酸滴加，调节pH至5.6。 ⑥贮备液F（浓缩胶聚合催化剂1%APS）：称取1gAPS，先 用60-70ml去离子水溶解，搅拌至完全溶解后定容到100ml， 倒入棕色瓶中低温保存。仅能保存1周。 ⑦贮备液G（凝胶聚合加速剂TEMED）：吸取1mlTEMED， 加去离子水1ml溶解，放入冰箱低温保存。
的蛋白谱带来鉴定品种，可根据杂交种的数
量计算出纯度，同时也可统计异交种和自交
种粒数。
五、思考题
1．应用电泳鉴定品种的理论基础是什么？ 2. 如何根据电泳图谱鉴定结果判断玉米种 子的真实性和纯度？
（2）样品提取液的配制
称取0.2928g NaCl，20g蔗糖和0.04g甲基绿，加去离子 水溶解，充分搅拌至溶解，定容到100ml。（稀盐溶液）
（3）电极缓冲液配制
吸取含量为88%甲酸溶液8.54ml，称取甘氨酸6.006g， 先用1600ml去离子水溶解后定容到2000ml，混匀并调节 pH至3.45备用，可重复使用5次（或先将甘氨酸溶解， 然后滴加甲酸，调至pH3.45）。
加入），然后迅速摇匀，沿下槽玻板外壁倒入，将底
缝封住。将电泳槽在实验台面上振动一下，使底缝封
平。对于多个电泳槽的封底缝可用同时进行。一般 510min，分离胶就会聚合将底缝封住。
④灌分离胶：
封底后，用滤纸条插入两玻板之间，吸去因成胶而析出 的水，从分离胶混合液中取出一块板的胶量，按比例加入 G液，迅速摇匀，将电泳槽倾斜，将分离胶混合液倒入两 玻板之间达一定高度（距玻板上边约1.0-1.5cm）。灌胶过 程中注意不能产生气泡，如出现气包可用细不锈钢丝快速 挑出。灌胶后，用预先准备好的注射器注水封住胶面，水 封的动作必须要轻，不能冲坏胶面，当水封后，分离胶和 水层间有一界面，等一下界面消失，再出现界面时表明凝 胶已成，此时倒出封水，用滤纸吸干，注意滤纸不能接触 胶面。
玉米盐溶蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳谱带分析
玉米盐溶蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的工作原理，是从玉米种子中提取的盐溶蛋白在聚丙烯酰胺凝胶的浓缩效应、分子筛效应和电泳分离的电荷效应作用下得到良好分离，通过染色显示蛋白质谱带类型；根据分子遗传学的理论，遗传信息的转移是遵守DNA →RNA →蛋白质这样的中心法则的，遗传信息在不同的大分子之间的转移都是单向的，不可逆的，只能从DNA 到RNA （转录），从RNA 到蛋白质（翻译）。
不同的玉米品种具有不同的遗传物质，那么种子内也就具有不同的蛋白质，不同的蛋白质其所带电荷不同，电泳谱带也就不同，通过对电泳谱带的分析达到对种子的真实性和品种纯度的鉴定。
玉米盐溶蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳，经过从试剂的配制到灌胶制板、从样品的制备到点样、从通电到卸板、再到胶板的染色等一系列复杂的程序之后，终于得到了一块染色清晰的胶板，接下来最关键也是最重要的一步就是对谱带进行分析，如何对谱带进行正确的分析、分析时又会遇到哪些问题，现结合多年工作经验就这些问题总结分析。
1 电泳谱带区域划分及其作用首先要对谱带进行区域划分，电泳谱带一般按分子量的大小划分为3个区域：主谱带区、次谱带区、辅助区。
主谱带区位于胶板的中间区域，该区由中分子量的蛋白质所组成，在该区域中，蛋白质谱带数量多、染色深，品种间差异大，是纯度鉴定的主要区域；次谱带区，位于胶板的下部区域，该区由小分子量的蛋白质所组成，在该区域中蛋白质谱带数量少，谱带扩散，染色相对较浅，品种间有差异，但不太显著，在纯度鉴定中，当主谱带区差异不明显时，可根据该区域的谱带差异进行鉴定；辅助区，该区域在胶板的上部，该区由大分子量的蛋白质所组成，蛋白质谱带数量多，染色谱带细，易受电泳条件的影响，对于虫蚀、发霉、生病的子粒，该区域谱带会部分或全部消失，所以，在磨样时要先将虫蚀、发霉、生病的子粒剔除，该区域品种间差异小，不太容易观察，最好不作为纯度鉴定时用，如果主谱带区和次谱带区无差异，只有辅助区有差异时，最好严格控制操作条件，使该区域的谱带清晰，以便容易观察分析。
玉米种子室内纯度测定技术应用
玉米种子室内纯度测定技术应用电泳技术是国际公认的作为种子室内种子纯度鉴定有效方法，电泳在品种鉴定中的成功开发应用是基于蛋白质可作为对编码的结构基因的标记。
种子贮藏蛋白组分是由遗传基因控制的，不同品种的蛋白质电泳图谱必然存在差异，因此，可有效区分不同品种的玉米作物。
我们将醋酸尿素聚丙烯酰胺凝胶玉米电泳技术和玉米种子纯度盐溶蛋白电泳鉴定方法进行比较，得出适合新疆玉米室内鉴定方法。
1醋酸尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳技术和盐溶蛋白电泳技术的对比性研究1.1两种玉米电泳技术对玉米亲本及杂交种的鉴定试验首先抽取具有代表性的玉米种子样品采用醋酸尿素聚丙烯酰胺凝胶玉米电泳技术和玉米种子纯度盐溶蛋白电泳鉴定两种方法进行室内的纯度鉴定，检测样品中自交系和异品种的数量，从基因水平鉴定玉米种子样品的纯度状况，同时验证小区种植鉴定结果。
1.2两种玉米电泳技术图谱分析通过对样品的鉴定我们对醋酸尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳技术和盐溶蛋白电泳技术进行了比较，两种方法鉴定结果基本一致，从图谱的外观上看，盐溶蛋白电泳技术谱带平整清晰，底色清亮，谱带与底色反差大，易鉴定，因为是不连续电泳谱带非常平整，胶板谱带美观，制作干板的成功率高。
但操作相对繁琐复杂；醋酸尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳技术(AU-PAGE)是连续电泳，只需配一种凝胶溶液，仍然具有浓缩效应(与配方有关)，操作方法简单易于掌握，电泳分离效果好，谱带信息量大。
胶板弹性较好，对变质的种子也有较好的分离效果，此方法需检验人员有较丰富的实践经验，经验不足，蛋白提取量掌握不均，加样量不匀，可造成谱带不平，鉴定困难。
2新疆玉米室内纯度鉴定技术实际情况新疆种子生化试验技术起点较低，检测人员技术水平与内地相比有一定差距，多数生产企业不具备生化试验条件，实验室仪器配备相对滞后。
多年来，醋酸尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳技术用于企业生产玉米种子纯度自检，具有较丰富的实践经验和熟练操作技巧，对仪器设备的要求不高，国产大一厂稳压稳流电泳仪、垂直板电泳槽、离心机、手动粉碎器等就可进行实验操作，实验所需药品试剂在新疆都能购买到，因此这项技术在新疆具有一定的应用基础，分离效果较好，简单可操作性强，便于在新疆推广。
玉米种子纯度盐溶蛋白电泳鉴定的流程方法及注意事项
·种子科技··2012（04）·于10℃，湿度85%~90％。
将瓶苗移到温室摆放在畦内，浇透水，瓶间距5cm，3天后打开瓶盖封膜，每天用喷壶喷水一次，4天后脱毒苗变绿就可以定植。
一般炼苗7~10天，使幼苗叶片黑绿中大、气生根多而发达时定植。
温室顶部要覆遮荫网，防止爆晒。
4.2定植将畦内蛭石浇水达饱和状态，用木板刮平，按8cm行距划行。
将脱毒苗用镊子从培养瓶中取出，放在清水中轻轻洗净根部的培养基，按株距5cm、行距12cm栽入基质内2.0~2.5cm深（大苗稍深，小苗略浅）。
栽满畦后用喷壶小水细喷一遍，使基质与种苗充分愈合。
栽植后温室顶部覆遮荫网遮荫7~10天，遮荫期间每隔一天细水喷浇一遍，保持空气湿度85%~ 90％，促使幼苗早生根，早发新叶。
7~10天后即可转入正常管理。
实践证明，在温、湿度条件合适时，移栽成活率可达90%以上。
4.3马铃薯移栽苗的扦插试验为了提高马铃薯微型种薯产量，降低生产成本，根据马铃薯的生理特性，我们在苗畦内进行了马铃薯移栽苗的扦插试验。
在试管苗移栽成活、苗高8~10cm、15~20天时，切取顶芽（3~5cm）进行扦插，扦插后立即浇透水，使空气湿度保持在85%左右，3天后略喷点水，以保持湿润。
当发现基质变干时立即浇水，正常情况下两天浇水一次，具体视苗床干湿情况决定，要用手深入到基质中掌握干湿。
需要注意的是，水分也不能过多，否则易引起烂苗。
浇水一般在上午10时以前进行。
通过试验调查：扦插苗结薯数量比试管苗略少，但薯块却明显大于试管苗所结薯块。
试验结果表明：在微型种薯生产过程中，采用试管苗移栽结合顶芽扦插技术，可明显提高微型种薯产量和质量，并降低成本。
收稿日期：2012-02-16玉米种子纯度盐溶蛋白电泳鉴定较传统的生态方法具有速度快、准确可靠、成本低廉、技术比较容易掌握等优点，在检验工作中应用广泛。
但它涉及到化学、生化、遗传学和植物学等多方面的知识，测定操作步骤较为繁琐，在实际操作中往往会出现一些问题，影响鉴定的正常进行。
浅析玉米种子纯度检验方法
浅析玉米种子纯度检验方法【摘要】农业作为我国国民经济发展过程中的重要支柱性行业，农业的增产丰收关系着国家的安全团结，而种子作为农业生产的基础性物资，与农业的产量的息息相关。
本文对影响玉米种子质量的因素进行了分析，并进一步对玉米种子纯度的检验方法进行了具体的阐述。
【关键词】玉米种子；质量；纯度；检验方法为了确保种子的质量和纯度，需要对农作物种子一个或多个质量特性进行一定的检验，从而使其满足规定的质量要求，这样不仅可以有效的保证种子的质量，同时也可以实现农业的增产丰收。
玉米是当前种植较为普遍的农作物，所以在播种前需要对其种子质量进行检验，通过检验合格的种子才可以进行播种，这样可以有效的确保播种的品种的优质性，同时也有效的保证了农业生产的安全性。
1.影响玉米种子质量的因素玉米作为广泛种植的农作物，其播种面积不断的扩大，这就对玉米种子的需求量增加，玉米种植过程中如果想要达到高产，则需要有效的保证玉米种子的纯度，使玉米种子的质量得以保证。
而在实际繁殖和培育中，导致玉米种子纯度受到影响的因素较多，大致总结为以下几个方面：（1）种子在繁殖田期间没有及时对所产生的杂合粒进行去杂，从而导致种子的纯度降低。
（2）由于玉米制种田中种子的亲本纯度不高，又没有及时进行去杂，从而导致异品种株及变异株的产生，影响到玉米种子的纯度。
（3）没有对玉米制种田进行良好的隔离，从而导致异品种花粉传入，从而导致杂合籽粒的产生。
（4）玉米种子在收获、运输、存储等过程中由于管理不严格，使异品种籽粒混入玉米种子中间，使玉米种子的纯度受到影响。
2.玉米种子纯度的检验方法2.1田间检验这是在玉米种子生产过程中所需要进行的检验，通过田间检验可以有效的保证种子的质量，使玉米种子的纯度得以进一步的提高。
（1）在检验过程中需要对玉米种子名称、种类、制种地、前期作业情况及田间管理等情况进行一个全面的了解，同时还要对其玉米种子的各生育期的特征进行掌握，从而对玉米种子的各方面情况有一个全面的了解和掌握。
试论玉米中蛋白质含量测定的技术方法
试论玉米中蛋白质含量测定的技术方法玉米是世界四大粮食作物之一，也是人类重要的食用和经济作物之一，而玉米中蛋白质含量的测定对于玉米的优质育种和加工利用具有重要意义。
玉米中蛋白质含量测定的技术方法有多种，本文将从传统方法到现代方法进行探讨，并对比它们的优缺点，以期对玉米中蛋白质含量的测定方法有一个较为全面的了解。
一、传统方法：考马斯亮蓝法考马斯亮蓝法是一种比较传统的蛋白质含量测定方法，其原理是将样品中的蛋白质与考马斯亮蓝形成复合物，然后用特定波长下的光吸收率来测定复合物的浓度。
这种方法操作简单，使用范围广泛，但其对样品的选择性不够高，容易受其他物质的干扰，而且需要大量有机溶剂，不符合现代绿色环保的要求。
二、生物学方法：凝胶电泳法凝胶电泳法是一种生物学方法，其原理是根据蛋白质在凝胶电泳中的迁移速率和大小分子间的差异，来对蛋白质进行分离和测定。
这种方法能够对蛋白质进行定性和定量分析，但操作复杂，需要较长时间，且对实验者的技术要求较高。
三、色谱法：高效液相色谱法高效液相色谱法是一种利用高效液相色谱仪进行分析的方法，其原理是利用样品中蛋白质与色谱柱填料相互作用不同，从而使蛋白质分离，并通过检测器进行定量分析。
这种方法具有分析速度快、选择性好、准确度高等优点，但仪器价格昂贵，维护成本高，不适合一般实验室的使用。
四、光谱法：红外光谱法不同的方法各有优缺点，具体选择何种方法还需根据实际情况来综合考虑。
在实际应用中，可以根据实验目的、仪器设备和实验操作水平等因素来选择合适的方法。
随着科学技术的不断进步，蛋白质含量测定的方法也在不断更新和完善，相信未来会有更多更加精准和便捷的方法出现，为玉米中蛋白质含量的测定提供更多选择。
玉米种子纯度盐溶蛋白电泳鉴定方法
玉米种子纯度盐溶蛋白电泳鉴定方法NY／T449—20011 范围本标准规定了玉米单交种及亲本的真实性和品种纯度的室内检测方法。
本标准适用于玉米单交种及亲本的真实性和品种纯度鉴定。
2 引用标准下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。
本标准出版时，所示版本均为有效。
所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。
GB／T 3543．2—1995 农作物种子检验规程扦样GB／T 3543．5—1995 农作物种子检验规程真实性和品种纯度鉴定GB 4404．1—1996 粮食作物种子禾谷类3 定义本标准采用下列定义。
3．1 种子真实性供检品种与文件记录(如标签等)是否相符。
3．2 品种纯度品种在特征特性方面典型一致的程度，用本品种的种子数占供检本作物样品种子数的百分率表示。
[GB／T 3543.5]3．3 育种家种子育种家育成的遗传性状稳定的品种或亲本种子的最初一批种子，用于进一步繁殖原种的种子。
4 原理从玉米种子中提取的盐溶蛋白在聚丙烯酰胺凝胶的浓缩效应、分子筛效应和电泳分离的电荷效应作用下进行分离，通过染色显示蛋白质谱带类型。
不同玉米品种由于遗传组成的不同，种子内所含的蛋白质种类有差异，这种差异可利用电泳图谱加以鉴别，从而对种子真实性和品种纯度进行鉴定。
5 仪器设备及试剂5．1 仪器设备电泳仪(500V±5V连续可调、0～400mA连续可调、额定输出功率200W)、垂直板夹心式电泳槽、单籽粒粉碎器、天平(感量0．0lg、0．001g、0．000 1g 各一台)、酸度计、磁力搅拌器、高速离心机(5 000r／mln以上)、电冰箱、电炉、离心管(1．5 mL)、离心管架、移液管(10 mL、5 mL、2 mL各两支)、微量进样器(5～100μL)、恒温箱、观片灯等。
5．2 试剂丙烯酰胺、NN－亚甲基双丙烯酰胺、乳酸、乳酸钠、甘氨酸、抗坏血酸、硫酸亚铁、氯化钠、蔗糖、甲基绿、三氯乙酸、过氧化氢、考马斯亮蓝R250、无水乙醇、（略：正丁醇等）(所用试剂均为分析纯，所用水均为去离子水)。