动物性食品中克伦特罗残留量的测定
分 子 式:Cl2H18Cl2N2O 分 子 量:277.19
二、国家限量标准
肉制品的国家标准中没有注明瘦 肉精的限值。不过国家禁止使用瘦肉 精,也就是说,限量是不得检出。根 据仪器的精密程度和检测方法,国内 一般是0.5ppb,国外(日本)是 0.05ppb。
动物性食品中克伦特罗残留量的测定
食品1302班24号 彭岭
CONTENTS 目 录
01 克伦特罗的简介 02 限量标准及检出限 03 检测方法 04 检测方法的评价
一、克伦特罗的简介
克伦特罗(Clenbuterol)既不是兽药,也不属于饲料添 加剂,而是一种激素类物质,有极强的热稳定性。并严重 危害畜牧业健康发展和畜产品安全。
酶联免疫法(ELISA) 高效液相色谱法(HPLC) 气相色谱—质谱法(GC-MS) 二级质谱法(GC-MS/MS)
GC-MS/MS法的检测步骤
样品提取
称取样品5g
置离心管中
加高氯酸10mL
置混匀管中
80℃超声提取30min
冷却至室温
6000r/min离心20min
倾出上清液
样品净化
甲醇、超纯水各3mL
固相提取柱活化
高氯酸、超纯水和含5%氨 水的甲醇各3mL
洗涤
去除杂质
样品的衍生
加入美托洛尔内标试剂
氮气流吹干
迅速加入衍生剂,
1 min后
微波炉中低档衍生化反应
冷却到室温
氮气流吹干
加入甲苯
供GC-MS分析。
四、检测方法的评价
检测方法
优点
缺点
高效液相色谱法 检测精确度高,假阳性率低, 检测过程烦琐、检测时间
克伦特罗的检出限
气相色 谱—质谱
法
高效液相 色谱法
酶联免疫 法
检出限:0.5μg/kg 线性范围:0.025ng—2.5ng
检出限:0.5μg/kg 线性范围:0.5ng—4ng
检出限:0.5μg/kg 线性范围:0.004ng—0.054ng
三、克伦特罗的检测方法
NO.1 NO.2 NO.3 NO.4
样品不必衍生
长,需贵重仪器同时存在情 况下对某种特定的残留物进 行定性、定量分析。灵敏度 更高,假阳性率更低
同 HPLC 法一样
酶联免疫法
灵敏度高、操作简便、检测 不能实现在线检测,而假阳
迅速
性率较高。
谢
高效液相色谱法检测克伦特罗的探讨
弱 阳离子 交换 柱 ( C wc ( U E C L — x) S P L O)
罗进入机体后 具有半 衰期 长 , 代谢 和排泄缓慢 的特
点, 其性质稳定不 易破坏 , 人若食用含瘦肉精残 留量
过高的肉制品后 ,5rn到 6h内可 出现肌痛、 1 i a 心动
过速 、 头晕 目眩 等 中毒 症 状 。近 几 年 来 , 内外 接 连 国 发 生人 食用 有瘦 肉精残 留的 肉制 品 中毒事 件 , 因此 引 起 人们 高度 的关 注 。
纯 ) 去 离子 水 、
其余 试 剂都 是分 析纯 如 :. lL高 氯酸 、 0 1mo / 异丙 醇、 乙酸 乙酯 、. mo L磷 酸 二氢 钠 01 l /
加 速动物 生 长 , 增 加 瘦 肉率 , 而 将 其 广 泛应 用 于 并 从 养殖 业 , 随后 我 国也将 此方 法用 于养殖 业 。但 克 伦 特
流速 : mL m n 1 / i
般 的基 层 单 位 都 有 H L 所 以选 用 H L P C, P C法 来 进
行检测 较为适用 , 而建立快速、 从 准确 、 有效 的检测 方法 。
1材 料 与方 法
进样量 :0 l 2
15 标 准 曲线 称 取盐 酸 克伦 特 罗 ( . 纯度 9 . ) 9 1
[ 摘要 ] 目的 建 立高效液相色谱法检测动物性食 品中克伦特罗 残 留量 的方法。方法 样 品经预处理 后 , 分别 以 甲醇
+ 4 + 5 和乙腈 + .2mlL乙酸铵(0+ 0 作为流动相对样品进行检测。结果 以乙腈 + 水(5 5 ) 00 o / 3 7) 乙酸铵作为流动相
对样 品进行检测有较好 的峰形 , 回收率为 7.% 一 64 , 95 8.% 浓度在 05 50 #L 围内的线 性为 099 , .0~ . m 范 .9 检出限为 9
43. 牛羊尿液中盐酸克伦特罗残留的测定DB21/T 1833-2010
试剂盒使用前恢复到室温。
标准和样品做平行试验以增加准确性。
14.5
以空白溶液(浓度为
绘制标准相对吸光度与浓度
14.6
本方法在牛、羊等动物尿液中的检测限为0.5μg/L。
15
15.1
调节样品的pH值为5.2,用乙酸乙酯-异丙醇提取,蒸干后用乙酸铵溶解,经固相萃取小柱净化,氮气吹干后经双三甲基硅基三氟乙酰胺(BSTFA)衍生,气相色谱-质谱仪测定。
-As——标准工作液中经衍生化盐酸克伦特罗m/z 86碎片离子的峰面积;
-V0——供试试样体积,单位为升(mL)
-V——试样溶液最终定容体积,单位为毫升(mL);
-P——稀释倍数。
注:计算结果需扣除空白值,测定结果用平行测定的算术平均值表示,保留小数点后2位。
15.6
灵敏度
本方法在牛、羊等动物尿液中的定量限为1.0μg/L。
天平:感量
冷冻
离心管:
阳离子交换固相萃取柱
固相萃取装置。
氮气吹干仪。
涡旋混合器。
振荡器。
恒温干燥箱。
15.4
提取
准确量取尿样5.0 mL于50 mL离心管中,用乙酸调pH至5.2,加入乙酸铵缓冲液(5.2.3)1 mL混匀,再加入乙酸乙酯-异丙醇混合提取液(5.2.10)10 mL,涡旋30 s使其充分混匀,中速振荡提取5 min,静置分层,用滴管收集上层有机相,再用乙酸乙酯-异丙醇混合提取液10 mL重复提取一次,合并有机相,50℃水浴旋转蒸发至近干,加入3 mL乙酸铵缓冲液(5.2.3)振荡溶解后备用。
1
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则并起草。
本标准由辽宁省畜牧兽医局提出并归口。
肉原料肉中激素(盐酸克伦特罗、莱克多巴胺)的测定—气质联用技术
2 液质联用法检测瘦肉精 2.2实验方法与主要步骤
2.2.4结果计算
计算结果小于本标准检出限0.5ug/kg时,视为未检出
2 液质联用法检测瘦肉精
备注 在检测实验室,确证和定量瘦肉精时,相对于气质联用,更
多使用液质联用。
2 液质联用法检测瘦肉精 2.2实验方法与主要步骤
2.2.3主要步骤 5.振荡均匀,放入37℃水浴 锅震荡16h 放置一夜 (备注:样品中有油脂,需要加入正己烷;若无油脂,无需加入正己烷) 6.离心 9000r/min 7min 7.上清液过滤(用漏斗、定量滤纸)到另一新管,用乙酸铵冲洗滤纸
详细过程参考实训指导书或国标GB-T22286-2008
2 液质联用法检测瘦肉精
2.2实验方法与主要步骤
2.2.2主要仪器: 高效液相色谱-串联质谱联用仪:配有电喷雾离子源(ESI)、 均质器、 漩涡混合器 离心机 氮吹仪、 真空过柱装置。
2 液质联用法检测瘦肉精 2.2实验方法与主要步骤
2.2.3主要步骤 (1)提取 1.称取5g样品(均匀取样)于50ml离心管中,
2.1原理
试样中的残留物经酶解,用高氯酸调节pH值,沉淀蛋白后离心, 上清液用异丙醇-乙酸乙酯提取,再用阳离子交换柱净化,液相色谱串联质谱法测定,内标法定量。
2 液质联用法检测瘦肉精
2.2实验方法与主要步骤
2.2.1主要试剂 甲醇(液相色谱纯) 乙酸钠 高氯酸 氨水甲醇溶液 标准储备溶液; 混合标准储备溶液; 同位素内标物:克仑特罗-D9, 沙丁胺醇-D3,纯度大于98%等
2 液质联用法检测瘦肉精 2.2实验方法吹干样液,吹到似干非干干为止; (6)用1ml 0.1 甲酸/水—甲醇定容; (7)超声后放沃悬器沃悬30s-1min; (8)用注射器吸需要样液,经0.22微米滤膜除杂,转入进样瓶 3.液相色谱串联质谱测定
优化试验条件测定动物性食品中盐酸克伦特罗残留含量
21 提取 .
称 取 (0400) 试 料 , 02m lL盐 1 - .1g 用 . o /
酸溶 液 2 L匀浆 , 于离 心管 超声 振 荡 3 i, 0m 置 0mn 取 出 ,0 8 ℃水 浴加 热 2 i, 却后 40 mn离心 2 5mn冷 50r i / 5 mn取上 清 液 , 淀 用 0 2m lL盐 酸 5m i, 沉 . o / L洗 涤 , 40 mn离心 1 i, 并 上 清 液 。用 1m lL氢 50r i / 5mn合 o / 氧化 钠调 p H值 至 9 5 0 1若 有 沉淀 产 生 , 50 . ., - 4 再 00 rmn离 心 1 i, /i 0mn 取上 清液 加人 1 0g氯化 钠 , 混匀 , 加人 2 L异丙 醇 一乙酸 乙酯 (06 )振荡 提 取 2 5 m 4 :0 , 0
1 材 料与 方 法
分 别用 5m L水 和 3m L乙醇 冲洗 柱子 , 去流 出液 , 弃 用 6m L乙 醇 一浓 氨 水 (8 2 冲 洗 柱 子 , 集 流 出 9 :) 收 液 , 流 出液浓 缩 至干 。于 净化 、 干 的残 渣 中加 人 将 吹 0 1m lL 盐 酸 10 , 残 渣 充 分 溶 解 。 用 . o / 0 使 04  ̄ ' 膜 过滤 , .5mn L 滤 收集 滤液 作 为供试 液 。 2 3 色谱 条 件 色 谱 柱 : D . O S—C 8 20 n l 1,5 l × n
mn i 。提取 完毕 , 放置 5mn 若有 乳化 层再离 心 ) i( 。 用 1 L异 丙 醇 一乙 酸 乙 酯 ( :0 再 重 复 萃 取 1 5m 0 4 6)
次 , 并 有 机 相 ,0 合 6 ℃旋 转 蒸 发 仪 浓 缩 至 近 干 。用
瘦肉精ELISA法 - 2018 - 2
四、酶标仪使用
五、结果判定
标准曲线的绘制 以标准品百分吸光率为纵坐标,以克伦特罗标准品浓度(
ng/ml)的半对数为横坐标,绘制标准曲线。将样本的百分 吸光率代入标准曲线,从标准曲线上读出样本所对应的浓度 ,乘以对应的稀释倍数即为样本浓度。
克伦特罗检测(ELISA检测法)
《 GB/T 5009.192-2003 动物性食品中克伦特罗 残留量的测定》
实验的目的
1、通过本次试验同学们能够掌握ELISA法Fra bibliotek测瘦肉精 的原理
2、掌握快速检测的基本程序及操作,具有独立进行快
速检测的基本技能。
一、实验原理
间接竞争ELISA方法
在酶标板孔条上预包被克伦特罗 抗原,
30min,反之则减少反应时间 7.最佳反应温度是25℃,温度过高或过低将导致结果误差。
如何进行半对数作图
六、注意事项
1.试剂使用前要回复到室温否则影响结果(室温放置30min 以上)
2.洗版拍干后要立即进行下一步否则影响结果 3.每加一种试剂前需轻轻摇匀 4.终止液为2M浓硫酸,避免接触皮肤 5. 0号标准的吸光值小于0.5时,试剂可能变质 6.加入底物A和B显色放应,若颜色较浅,可延长反应时间到
试剂:
0.1M HCI、0.1MNaOH溶液、乙腈-0.1MHCI 溶液 克伦特罗酶标物、克伦特罗抗试剂、去离子水、底物A、底
物B、终止液 标准品:浓度为0、0.1、0.3、0.9、2.7、8.1ppb(10-3ug/ml) 对照品:浓度为100ppb
三、操作过程
1、样品前处理
酶联免疫吸附法(ELISA)检测猪肉中盐酸克伦特罗
酶联免疫吸附法(ELISA)检测猪肉中盐酸克伦特罗作者:薛金英来源:《中国动物保健》2014年第10期盐酸克伦特罗(俗称瘦肉精)为一种人工合成的β-肾上腺素兴奋剂,具有扩张支气管的作用,常用来防治哮喘、肺气肿等肺部疾病。
当其应用量达到治疗量的5~10倍时,其有能量重分配作用,可使肌肉合成增加,脂肪沉积减少,因此俗称为“瘦肉精”。
在畜牧业生产中一些非法使用者将其作为一种和生长促进剂添加到动物饲料中,用以改善胴体的品质,同时也造成食品中盐酸克伦特罗(瘦肉精)的残留。
当人们食用盐酸克伦特罗残留的产品后会出现一系列的中毒症状。
动物源性食品药物残留问题逐渐引起人们的重视。
本法用于定量、定性检测猪肉中盐酸克伦特罗的残留。
1试验原理采用间接竞争ELISA法,在微孔板上包被抗盐酸克伦特罗检测抗原,样品中的盐酸克伦特罗将和酶标板上的盐酸克伦特罗检测抗原竞争结合盐酸克伦特罗抗体,盐酸克伦特罗检测抗原结合的盐酸克伦特罗抗体再与同时加入的酶标二抗结合,洗涤后,用TMB底物系统显色,微孔板吸光值与样品中盐酸克伦特罗含量成负相关,与标准曲线比较再乘以浓度比值即可得出盐酸克伦特罗在样品的实际含量。
2试验方法(稀释倍数为4倍)称取1.0 g(±0.05 g)均质样品于50 mL聚苯乙烯离心管中,加入1 mL 0.1 M盐酸,再加入2 mL提取工作液,充分振荡混匀5 min,4 000 rpm(20~25℃)离心10 min。
取1 mL上清液加入约25 μL 1 M 氢氧化钠调节pH至6.5~7.5之间,充分振荡混匀,取50 μL用于分析。
如果上层中存在白色脂肪层,取样时应避开。
试剂准备:将10×浓缩洗涤液和蒸馏水(或去离子水)按1∶9充分混匀,即为1×洗涤液。
编号:将盐酸克伦特罗标准溶液和待测样品对应微孔按序编号,建议每个标准溶液和待测样品均做重复孔。
加样:加入标准溶液或样品50 μL,然后每孔分别加入盐酸克伦特罗酶标二抗50 μL和盐酸克伦特罗抗体溶液50 μL。
酶联免疫吸附法测定猪肉中盐酸克伦特罗的方法
酶联免疫吸附法测定猪肉中盐酸克伦特罗的方法作者:张清超来源:《现代食品》 2017年第11期盐酸克伦特罗俗称瘦肉精,是人工合成类的β- 肾上腺素兴奋剂的一种,在治疗支气管扩张方面有显著效果,用量适当时,是防治哮喘、肺气肿等肺部疾病的有效物质;但当其用量为正常治疗量的5 ~ 10 倍时,在能量重分配的作用下,将导致脂肪沉积异常减少、肌肉合成异常增加,部分非法使用者往往将其添加到动物饲料中,用以改善动物胴体品质。
当动物食用盐酸克伦特罗后,其体内将残留不同程度的盐酸克伦特罗,用其制作的食品一旦被人们食用,将引发一系列中毒症状,严重危害人体生命安全。
调查显示,盐酸克伦特罗一次摄入量过大,人体将产生呕吐、心跳骤然加速等异常生理反应,严重者甚至直接死亡,因此被世界上大多数国家禁用。
近年来,在我国的严厉打击下,非法生产销售添加盐酸克伦特罗食品的现象显著减少,但畜产品抽检的实际工作显示,瘦肉精仍时有检出,加强对畜产品中盐酸克伦特罗的检测势在必行。
在多种检测方法中,胶体金免疫层析法、酶联免疫吸附法较为常见,广泛应用于畜牧业中,具有准确率高、操作简便、耗时短等优点。
下面本文将就酶联免疫吸附法测定猪肉中盐酸克伦特罗的方法进行进一步分析和总结。
1 原料与方法1.1 原料到附近市场随机抽取一批剔除杂质、脂肪的无皮精肉,使用高速捣碎机对无皮精肉进行处理,彻底捣碎后将所有精肉混合均匀并置于冰箱冷冻备用。
检测时,从冰箱冷冻室抽取5 g 捣碎样品,将25 mL 的50 mmol/L HCl与样品混合,持续摇动至均质。
在离心管中加入5 g 均质物,以10 000 r/min 的速度高速离心15 min,分离血清,提取上清液,在上清液中加入300μL 的1 mol/L NaOH,混匀并静置15 min。
15 min 后,在混合上清液中加入4 mL 的500 mmol/L KH2PO4,混匀静置,保存在温度为4 ℃左右的环境中。
90 min 后,取出混合液,以10 000 r/min的速度高速离心15 min,分离上清液,待检,待检标本共10 份[1]。
瘦肉精相关检测标准汇总
瘦肉精相关检测标准汇总央视曝光双汇济源分公司收购含“瘦肉精”猪肉,瘦肉精再次引起人们的关注,因此汇总整理出瘦肉精相关检测标准,供大家参考。
GB/T5009.192-2003动物性食品中克伦特罗残留量的测定本标准规定了动物性食品中克伦特罗的测定方法。
本标准适用于新鲜或冷冻的畜、禽肉与内脏及其制品中克伦特罗残留的测定。
本标准也适用于生物材料(人或动物血液、尿液)中克伦特罗的测定。
本方法检出限:第一法气相色谱—质谱法为0.5μg/kg;第二法高效液相色谱法为0.5μg/kg;第三法酶联免疫法为0.5μg/kg。
线性范围:第一法气相色谱—质谱法为0.025ng~2.5ng;第二法高效液相色谱法为0.5ng~4ng;第三法酶联免疫法为0.004ng~0.054ng。
GB/T20189-2006饲料中莱克多巴胺的测定高效液相色谱法本标准规定了检测动物饲料中莱克多巴胺含量的高效液相色谱(HPLC)方法。
本标准适用于配合饲料、浓缩饲料和添加剂预混合饲料中莱克多巴胺含量的测定。
GB/T21036-2007饲料中盐酸多巴胺的测定高效液相色谱法本标准适用于配合饲料、浓缩饲料和预混合饲料中盐酸多巴胺含量的测定。
GB/T22147-2008饲料中沙丁胺醇、莱克多巴胺和盐酸克仑特罗的测定液相色谱质谱联用法本标准规定了同步测定饲料中β-激动剂沙丁胺醇、莱克多巴胺和盐酸克仑特罗的液相色谱质谱联用法。
GB/T21313-2007动物源性食品中β-受体激动剂残留检测方法液相色谱-质谱/质谱法本标准规定了β-受体激动剂类兽药残留检测的制样方法和高效液相色谱/质谱确证方法。
本标准适用于猪肉、猪肝、猪肾等动物源性食品以猪屎中克伦特罗、沙丁胺醇、妥布特罗、特布它林、非诺特罗、福莫特罗、莱克多巴胺、异丙喘宁等8种β-受体激动剂类残留量的高效液相色谱-质谱/质谱测定。
GB/T22286-2008动物源性食品中多种β-受体激动剂残留量的测定液相色谱串联质谱法本标准规定了动物源性食品中沙丁胺醇(salbutamol)、特布他林(terbutaline)、塞曼特罗(cimat-erol)、塞布特罗(cimbuterol)、莱克多巴胺(ractompamine)、克仑特罗(clenbuterol)、溴布特罗(brombu-terol)、苯氧丙酚胺(isoxsuprine)、马布特罗(mabuterol)、马贲特罗(mapenterol)、溴代克仑特罗(brom- chlorbuterol)残留量的液相色谱-串联质谱的测定方法。
气相质谱法测定瘦肉中的克伦特罗
气相质谱法测定瘦肉中的克伦特罗罗杰鸿 邓建文|文克伦特罗,又名瘦肉精,是一种对动物具有促进生长,减少脂肪含量的兴奋剂类物质,曾经广泛应用于生猪的饲养。
然而由于克伦特罗易在动物组织形成残留,当人们食用后,就会发生中毒,所以我国已禁止作为生长促进剂使用。
但由于其经济效益,非法使用克伦特罗的现象依然存在,因此,建立有效的克伦特罗检测方法具有重要意义。
气相质谱法测定克伦特罗的方法比较多,例如GB/T 5009.192-2003,但有些方法步骤多,繁琐,在实验的基础上,我们改进了克伦特罗的测定方法。
材料与方法试剂与仪器。
克伦特罗标准品购自德国Dr.E。
N,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)/三甲基氯硅烷(TMSCl)购自sigma,材料为市场常见的瘦肉。
正己烷,乙酸乙酯等为色谱纯,高氯酸,氢氧化钠等为分析纯。
气相质谱联用仪。
色谱条件。
色谱柱:HP-5MS,30 m x 0.25 mm x 0.25μm;进样口温度:240o C ;进样量:1μL,不分流;柱温程序:70o C 保持1min,以18o C/min 速度升至200o C,以5o C/min 的速度再升至245o C,再以25o C/min 升至280o C 并保持2min。
EI 源:电子轰击能量:70eV ;离子源温度:200o C ;接口温度:285o C ;溶剂延迟:12min ;EI 源检测特征峰:86、187、243、262。
分析过程提取。
称取10.0 g 瘦肉,用20mL 0.1mol/L 高氯酸溶液,匀浆后,超声萃取20min,取出置于80o C 水浴中加热30min。
取出冷却后离心15min。
倒出上清液,沉淀用5mL 0.1mol/L 高氯酸溶液洗涤,再离心。
合并高氯酸溶液后,加入10mL 正己烷,震荡,分层后弃掉正己烷,用10mL 正己烷重复萃取油脂一次。
用1mol/L 的氢氧化钠溶液调节水相的PH 至9.5左右,加入8g 氯化钠,混匀后加入10mL 乙酸乙酯,涡旋振荡提取20min。
动物性食品中盐酸克伦特罗(瘦肉精)残留的检测
阴性 : C线条显色, T线条肉眼可见, 无论颜色深浅均判
人( 女性) 经口T L ( D o 最低中毒剂量)460 gk 。小鼠静 : 0 /g n 脉 L S( D 0半数致死剂量) 2 60v /g :7 0 gk 。所 以盐酸克伦特 罗早期仅在医学上用于急救和肺科病( 主要是平喘) 。因副 作用较大已被禁用。 2 样品快速判断方法 看该猪肉是否具有脂肪( 猪油)如该猪肉在皮下就是瘦 , 肉或仅有少量脂肪, 则该猪肉就存在含有“ 精” 瘦肉 的可能。 喂过“ 瘦肉精” 的瘦肉外观特别鲜红, 后臀较大, 纤维比 较疏松, 切成 2 指宽的猪肉比较软, ~3 不能立于案, 瘦肉与 脂肪间有黄色液体流出, 脂肪特别薄; 而一般健康的瘦猪肉 是淡红色, 肉质弹性好, 瘦肉与脂肪间没有任何液体流出。
为阴性。
对高血压、 心脏病、 甲亢和前列腺肥大等疾病患者危害更
大, 严重的可导致死亡。
112 预防方法 : .. 控制源头, 加强法规的宣传, 禁止在饲料
阳性 : C线条显色, T线条不显色, 判为阳性。 无效 : C线条不显色 , 无论 T线条是否显色, 该试纸均
食 品 质 量 与 安 全
4 g次, 次/ 儿童 5 0 / 3 日; v 岁以上 5 ~2 g次, 次/ g O i b / 3 日。
达到提高瘦 肉率的效果。它用量大、 使用的时间长、 代谢 慢, 所以在屠宰前到上市, 在猪体内的残留量都很大。这个
残留量通过食物进入人体, 就使人体渐渐地, 积蓄中毒。如 果一次摄入量过大, 就会产生异常生理反应的中毒现象, 因 此而被禁用。国内养猪户不顾农业部的规定, 为了使猪肉 不长肥膘, 在饲料中掺入瘦肉精。猪食用后在代谢过程中 促进蛋白质合成, 加速脂肪的转化和分解, 提高了猪肉的瘦
