Liposome脂质体表征

时晓芳 2016.6.8
背景介绍
脂质体(liposomes) ：将药物包封于类脂质双分子层内
而形成的微型泡囊。也称类脂小球或液晶微囊。
磷酸骨架
亲水的头部
磷脂 脂质体 胆固醇
水溶性分子（胆碱、丝氨酸、季胺盐等）
疏水的尾部 两条脂肪酸链，（10-24个C原子，0-6个双键）
HO
磷脂结构示意图
胆固醇的结构图
2.
在样品传输、进样、TEM观察的过程中始终 保持低温。
对于囊泡类样品的观察，通常使用这种方法。
高压冷冻仪可与超薄切片机及冷冻样品杆配合，进行低温透射电镜观测
外部资源：
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中国科学院上海生命科学研究院 中国科学院上海巴斯德研究所 同济大学
Sugikawa K et al. Angewandte Chemie International Edition, 2016. Jonas Gustafsson et al.Biochimica et Biophysica Acta 1995
1.脂质体干燥过程中会发生结构变化。 2. 对小颗粒分辨率不高。100nm左右。
常规SEM
AFM
1. 将含有脂质体的样品滴在干净的硅片上面 2. 晾干或者烘干 3. 对其进行喷金处理（增强样品的导电性） 1.把样品稀释为浓度1Wt%左右 2. 样品滴在云母片上 3. 放置待溶剂挥发干后进行测试
1.只能看表面结构，不能区分脂质体和其它纳米颗粒 2.脂质体不导电，需要喷金处理。 只能看表面结构，X,Y轴不灵敏，分辨率低 探针难控制
对被包裹物质提供保护 脂质体可以将油性原料分散在亲油层中，也可以将水性原料包裹在脂质体球心。 而磷脂则可以将有效成分与空气隔离开，使有效成分更长久的保存，延长产品的保质期，也可以延长涂 抹在皮肤上后的有效时间。
降低配方难度 由于卵磷脂独特的亲油亲水性，脂质体可以随意分散在水中，不增加乳化工作。
优点：专属性，排除其他物质干扰，外部资源多 缺点：分辨率较低，可能无法达到几十纳米级别
超高分辨率荧光显微镜
超高分辨率荧光显微镜 （分辨率达到分子级别1nm 左右，2014年诺贝尔化 学奖）
Eric Betzig
Stefan W. Hell 2014诺贝尔化学奖
W. E. Moerner
STORM 技术的开创者庄小威
二、对于一些特例。比如低倍的Cyro-TEM或者切片法观测不到脂质体,不 确定是否稳定存在于体系中，可以尝试使用荧光法。该方法对样品纯度没 有要求。如果在共聚焦显微镜不能看到完整的脂质体形状，说明脂质体极 大可能已经被破坏，那么这样的脂质体在体系中发挥不了增溶的作用，已 经没有太大的实用价值。 三、如果在共聚焦显微镜下可以看到完整的脂质体形状，可以进一步尝试 高分辨Cryo-TEM 或者超高分辨荧光显微镜进行观察。
胆固醇衍生物CDBA和CTBBA
Liu XM, Yang B, etc. Biochim Biophys Acta, 2005, 1720(1-2), 28-34. Liu XM, Yang B, etc. Chem Mater, 2005, 17(11), 2792-2795.
脂溶性药物 定位于双分子层脂质膜间 包裹物质 水溶性药物 包裹在水相 两性化合物 定位于水相与膜内部交界磷脂上 不能包裹物质 在水相和有机溶剂中都不溶的物质
不同材料，形成不同结构的脂质体
⑴磷脂酰胆碱(phosphatidyl choline,PC)
①天然的PC a. 从蛋黄、大豆、牛心脏和脊髓提取 b. 每一种PC具有不同长度、不同饱和度的脂肪链 植物性PC的脂肪链具有高度不饱和性 动物性PC的脂肪链大部分是饱和的 ②合成的PC 二棕榈酰胆碱（DPPC)、 二硬脂酰胆碱(DSPC) 二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱（DMPC)
区分不同结构和类型的脂质体
SCIENCE 348 1147-1151 (2015) FEBS Journal 280 (2013) 28–45
国家蛋白质科学中心-上海
荧光法
胆固醇与脂质体异性结合，对胆固醇进行荧光修 饰，通过confocal 观测荧光脂质体结构 Sung T C et al. Scientific reports, 2016, 6. Shi X et al. Polymer Chemistry, 2013
双分子结构：磷脂分子的亲水端呈弯曲的弧形，形似“手杖”，与胆固醇分子的亲水基团 相结合，形成“U”形结构。两个“U”形结构相对排列，则形成双分子结构
卵磷脂与胆固醇在脂质体中的排列形式
胆固醇与磷脂的排列示意图
脂质体形成示意图
Liposomes
脂质体
组成 结构 中心区域 磷脂和胆固醇 双分子层 水相，可容纳亲水性药物
相变温度与脂质体膜稳定性
磷脂含量
Zeta电位 粒度 形貌 包封率
电镜法
Fig 1 脂质体的TEM 测试项目
Fig 2 脂质体的SEM 样品制备 缺点局限性
Fig 3 脂质体的AFM
1. 样品一般需要使用磷钨酸染色（负染） 常规TEM 2. 将样品用稀释到合适的浓度，1Wt%左右 3. 用毛细管滴到铜网上，晾干或烘干 Fig 1 脂质体的TEM
优势 结构生物学的突破性工具
2014 年全球科技十大进展
诺贝尔奖热门
Yigong Shi al. Structure of a yeast spliceosome at 3.6-angstrom resolution[J]. Science, 2015, 349(6253): 1182-1191.
分辨率达到原子水平 区分不同结构和类型的蛋白质 局限性：外部资源少
磷脂酰乙醇胺（PE） 中性磷脂 磷脂酰胆碱（PC） 鞘磷脂（SM） 磷脂酸（PA） 磷脂酰甘油（PG） 磷脂酰肌醇 (PI) 磷脂酰丝氨酸(PS) 硬脂酰胺（SA） 胆固醇衍生物 大豆甾醇葡萄糖苷(SG） 大豆甾醇SS
脂质体材料
负电荷磷脂 （酸性磷脂）
正电荷脂质
大豆甾醇及其葡萄糖苷 胆固醇（Ch)
脂质体的形貌大小的表征
独创的方法
ACS applied materials & interfaces, 2015, 7(14): 7526-7533.
2013年，冷冻电镜技术在照相技术和软件分析的图像处理技术方面取得突破性 进展成为施一公实验室诺奖级工作-剪切体的结构解析的关键性工具
最高分辨率达2.2 Å
在两种介质中溶解性都非常好的物质
单室脂质体
多室脂质体
脂质体与细胞的相互作用：吸附、脂交换、内吞、融合
在护肤品领域，一般是指用卵磷脂类形成双分子层微囊，把需要被皮肤吸收利用的原料 包裹在其中；将对皮肤有养护作用的原料，用卵磷脂包裹后，有这样几个好处：
提高吸收效率 脂质体细胞膜的磷脂双分子层的结构非常接近，提高脂质体的经皮吸收效率。
Conclusion:
结构
Seeing is Believing
形貌
分辨率非常重要
大小
一、假设脂质体加入化妆品体系之后仍然稳定存在，则使用Cryo-TEM或者 切片法检测，这两种方法保留了脂质体的原貌，理论上可以分辨出脂质体 的双层结构。受配方体系中其他添加剂的影响不大，而且对体系纯度要求 不高。
对于复杂样品体系，需要多种表征方法一起反复确认，以保证观测结果的 可靠性。
激光粒度仪DLS
原理：在不同的角度上测量散射光的强度，得到样品粒度分布
颗粒平均粒径表示方法 • 体积（D4,3） • 表面积（D3,2） • 数量 不同颗粒均值对颗粒分布的 不同特征敏感
体积分布与数量分布之间的转换关系
常规电镜法缺点：1. 样品干燥后失去原貌 2. 分辨率不高，不能区分脂质体和其他纳米颗粒。
Ruan L P, Zhang H Y, Luo H L, et al. Science in China Series B: Chemistry, 2009 Aline F Xavier, Daiana K Deda2,, et al. IJABPT, 2016, 7(2), 303-313
脂质体的水合粒径表征，应根据具体的样品体系选择合适的表示方法
包封率
方法
HPLC法 透析法 微柱离心法
原理
参照磷脂含量测定 利用半透膜分子大小差别，通过及时更换 外相达到分离的目的 利用游离药物与含药脂质体的重力差异进 行分离，计算包封率 利用脂质体与游离药物分子质量和粒径大 小的差异进行分离 1. 具有荧光的物质,在高浓度时发生“自 淬灭”, 在某一低浓度范围内, 荧光强度又 和浓度成正比。 2. 高浓度包封于脂质体内水相中荧光物质 保持自淬灭无荧光产生, 而未包封在脂质 体外水相中浓度降低荧光重现 3. 通过荧光检测器测定荧光值, 准确测定 最初脂质体包封和未包封的荧光物质浓度 计算得到包封率 当添加顺磁性试剂如铁氢化物时, 外部标 记物的电子自旋谱带会显著加宽;还可以 利用包裹在脂质体内部的标记物与游离标 记物间扩散系数的不同来测定包封率 外相标记的游离药物显示出pH敏感的化 学位移，而内水相标记的药物则没有。根 据游离药物的量和总量计算得到包封率
Micelles
胶束
表面活性剂 单分子层 疏水区，可容纳疏水性药物
单室脂质体
小单室SUV 20-100nm 大单室LUV 100-1000nm
结构和粒径
多室脂质体MLV 1~5μm 洋葱式、管状、球形、椭球形
多囊脂质体MVV 1~5μm 缓释效应和储库效应
洋葱式
管状
球形、椭球形
多囊
Akbarzadeh et al. Nanoscale Research Letters. 2013,8:102
低分辨荧光显微镜和超高分辨荧光显微镜图片的对比
优点：突破光学极限的分辨率： 1nm 左右， 具有专属性，可作为通用的方法
局限性：外部资源少