药物化学实验1

《药物分析》实验大纲

----氯霉素滴眼液的高效液相色谱分析法

一、目的要求

1. 理解内标法和外标法测定组分含量的原理与方法；

2. 掌握高效液相色谱仪的结构及正确使用方法。

二、基本原理

2.1 基础理论来源

《药物分析》（人民卫生出版社，主编刘文英，第6版），第四章药物定量分析与分析方法验证（课本p96-97）。

2.1 实验原理

内标法和外标法是高效液相色谱（HPLC）中常用的两种含量测定方法。

内标物可以消除仪器与操作或制备样本时带来的误差，精密称取样品后，加入一定量的内标物，然后制成适当溶液进样分析。根据样品和内标物的重量及其相应的峰面积，求出某组分的含量。

外标法是在与被测样品相同的色谱条件下单独测定外标物（标准对照品），把得到的色谱峰面积与被测组分的色谱峰面积进行比较求得被测组分的含量。外标物（标准对照品）与被测组分同为一种物质但要求它有一定的纯度，分析时外标物的浓度应与被测物浓度相接近，以利于定量分析的准确性。本法俗称外标一点法，色谱定量的原理是峰面积与样品浓度成正比，实验条件要求：需要已知浓度的标准样品，且待测成分与杂质间分离良好。

三、实验方法

（一）实验条件

色谱仪Agilent 1260高效液相色谱仪

色谱柱C18柱(填料：SinoChrom ODS-BP 5 μm，尺寸：4.6 mm×250 mm，大连依利特分析仪器有限公司)

温度室温

流动相甲醇:水(v:v = 80:20)

流速0.8 mL/min

检测波长272 nm

（二）标准贮备液的制备

1. 1㎎/mL 氯霉素标准贮备液的配制

精密称取氯霉素100 mg 至100 mL 容量瓶中，以甲醇溶解，并稀释至刻度。

2. 1 mg/mL 对硝基苯酚(内标)标准贮备液的配制

精密称取对硝基苯酚约100 mg 置l00 mL 量瓶中，以甲醇溶解，并稀释至刻度。

(三) 内标法测定氯霉素的含量

1. 相对校正因子的测定

精密吸取对硝基苯酚标准贮备液1.0 mL ，置l0 mL 容量瓶中，精密加入氯霉素标准贮备液1.0 mL ，用甲醇稀释至刻度，摇匀。色谱仪基线平稳后，进样20 μL 得色谱图。读取对硝基苯酚及氯霉素峰面积或峰高，按公式计算相对校正因子（本实验中，采用峰面积法）:

内标内标内标＝A W A W f i i

i （或 内标

内标

内标＝h W h W f i i i ） 式中：W i ――氯霉素重量

W 内标――对硝基苯酚的重量

A i （h i ）――氯霉素的峰面积（峰高）

A 内标（h 内标）――对硝基苯酚的峰面积（峰高）

2. 样品含量测定

精密吸取滴眼液0.4 mL (约相当于氯霉素1 mg ，标示量为2.5 mg/mL)，置10 mL 容量瓶中，并加入对硝基苯酚的贮备液1.0 mL ，用甲醇稀释至刻度，摇匀，进样20 μL ，得色谱图。按下式计算标示量的百分含量（标示量，简单来说就是主药含量，它的百分含量=实际量/标准量，百分标示量是指的实验测得值与百分之百的偏离程度，即在一个允许范围内稍大或者稍小）：

%100%100%???=?=内标

样品内标内标样品标示量i i i f W W A A W W 式中：W i ――氯霉素重量

W 内标――对硝基苯酚的重量

W 样品――滴眼液中氯霉素的标示重量

(四) 外标法测定氯霉素的含量（外标一点法）

精密称取氯霉素25.0 mg 置10 mL 容量瓶中，以甲醇溶解，并稀释至刻度，浓度为2.5 mg/mL 。精密吸取该溶液1.0 mL 置l0 mL 容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，进样20 μL ，得色谱图，读取峰面积。

精密吸取滴眼液（标示浓度2.5 mg/mL ）1.0 mL 置l0 mL 容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，进样20 μL ，得色谱图，读取峰面积。按峰面积与样品浓度成正比计算滴眼液中氯霉素含量，即：

对照

样品对照样品C C A A 式中：A 样品：样品的峰面积；

A 对照：对照品的峰面积；

C 样品：样品的浓度（mg/mL ）；

C 对照：对照品的浓度（mg/mL ）；

四、学习提要

1. 内标法和外标法定量的原理、方法及特点。

2. 怎样选择流动相？流动相中水的作用?

3. 内标物应具备哪些条件？

五、实验思考

(1) 由于操作不当，系统中混入了气泡，则对测定有何影响?如何排除这些气泡?

(2) 变换流动相溶剂时，应如何操作?

《药物分析》实验导学

----氯霉素滴眼液的高效液相色谱分析法

一、液相色谱法

液相色谱法就是用液体作为流动相的色谱法。1903年俄国化学家M.C.茨维特首先将液相色谱法用于分离叶绿素。

1、液相色谱法

液相色谱法不能由色谱图直接给出未知物的定性结果，而必须由已知标准物作对照定性。当无纯物质对照时，定性鉴定就很困难，这时需借助质谱、红外和化学法等配合。2、原理和分类

液相色谱法的分离机理是基于混合物中各组分对两相亲和力的差别。根据固定相的不同，液相色谱分为液固色谱、液液色谱和键合相色谱。应用最广的是以硅胶为填料的液固色谱和以微硅胶为基质的键合相色谱。根据固定相的形式，液相色谱法可以分为柱色谱法、纸色谱法及薄层色谱法。按吸附力可分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱和凝胶渗透色谱。近年来，在液相柱色谱系统中加上高压液流系统，使流动相在高压下快速流动，以提高分离效果，因此出现了高效液相色谱法（又称高压液相色谱法）：

①液固吸附色谱

高效液相色谱中的一种，是基于物质吸附作用的不同而实现分离。其固定相是一些具有吸附活性的物质如硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等。

②液液分配色谱法

基于被测物质在固定相和流动相之间的相对溶解度的差异，通过溶质在两相之间进行分配以实现分离。根据固定相与流动相的极性不同，分为正相色谱和反相色谱【流动相的极性小于固定液的极性，称为正相色谱法。从色谱发展历史看，最先出现的是正相色谱，当时无所谓正反，只是叫色谱，到后来出现了反相色谱，即流动相的极性大于固定相，为了区分两种类型的色谱，就有了正反之说，现在反而是反相色谱的应用更为广泛】。前者是用硅胶或极性键合相为固定相，非极性溶剂为流动相；后者是硅胶为基质的烷基键合相为固定相，极性溶剂为流动相，适用于非极性或弱极性化合物的分离。

③离子交换色谱法

基于离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，依据这些离子对离子交换基具有不同的亲和力而实现分离。（薄壳型离子交换树脂柱效高，主要用来分离简单的混合物；多孔性树脂进样容量大，主要用来分离复杂混合物。）

④凝胶渗透色谱法

又称为尺寸排阻色谱法。1959年首先用于生物化学领域。以溶剂为流动相，多孔填料（如多孔硅胶、多孔玻璃）或多孔交联高分子凝胶为分离介质的液相色谱法。当混合物溶液入凝胶色谱柱后，流经多孔凝胶时，体积比多孔凝胶孔隙大的分子不能渗透到凝胶孔隙里去而从凝胶颗粒间隙中流过，较早地被冲洗出柱外，而小分子可渗透到凝胶孔隙里面去，较晚地被冲洗出来，混合物经过凝胶色谱柱后就按其分子大小顺序先后由柱中流出达到分离的目的。因此，凝胶渗透色谱法为测定高聚物分子量和分子量分布提供了一个有效的方法，此外还可用来分离齐聚物、单体和聚合物添加剂等。（自学、了解：用凝胶渗透色谱的优点是：分离不需要梯度冲洗装置；同样大小的柱能接受比通常液相色谱大得多的试样量；试样在柱中稀释少，因而容易检测；组分的保留时间可提供分子尺寸信息；色谱柱寿命长。它的缺点是：不能分离分子尺寸相同的混合物，色谱柱的分离度低；峰容量小；可能有其他保留机理起作用时引起干扰。）

⑤离子色谱法

采用柱色谱技术的一种高效液相色谱法，样品展开方式采用洗脱法。根据不同的分离方式，离子色谱可以分为高效离子色谱、离子排斥色谱和流动相离子色谱3类。高效离子色谱法使用低容量的离子交换树脂，分离机理主要是离子交换。离子排斥色谱法用高容量的树脂，分离机理主要是利用离子排斥原理。流动相离子色谱用不含离子交换基团的多孔树脂，分离机理主要是基于吸附和离子对的形成。（自学、了解：离子色谱仪由淋洗液贮存器、泵、进样阀、分离柱、抑制柱、电导检导器和数据处理单元等组成。离子色谱仪最重要的部件是分离柱，装有离子交换树脂。抑制柱是抑制型离子色谱仪的关键部件，其作用是将淋洗液转变成低电导部分，以降低来自淋洗液的背景电导，同时将样品离子转变成其相应的酸或碱，以增加其电导。分离阴离子，抑制柱填充强酸性阳离子交换树脂；分离阳离子，抑制柱填充强碱性阴离子交换树脂。检测器分通用型检测器与专用型检测器。前者如电导检测器，对检测池中所有离子都有响应；后者如紫外-可见分光光度计，对离子具有选择性响应。）

3 设备连接

高效液相色谱仪由输出泵、进样装置、色谱柱、梯度淋洗装置、检测器及计算机控制软件和数据处理软件组成。输出泵的功能是将冲洗剂在高压下连续不断地送入柱系统，使混合物试样在色谱中完成分离过程。常用的进样方式主要有2种：手动进样阀进样和自动进样器进样。色谱柱的功能是将混合物中各组分分离。梯度淋洗又称溶剂洗脱程序，通过连续改变淋洗剂的组成，改善复杂样品的分离度，缩短分析周期和改善峰形，其功能类似于气相色谱中的程序升温。检测器的功能是将从色谱柱中流出的已经分离的组分显示出来或转换为相应的电信号，主要有紫外吸收检测器【UV-Vis单波长检测器，光电二极管阵列检测器，简称PDA(Photo-Diode Array)检测器或DAD (Diode Array Detector)检测器】、荧光检测器、电化学检测器和示差折光检测器，其中以紫外吸收检测器使用最广。现代化的仪器都配有计算机，以实现自动数据采集与处理、绘图和打印分析报告等。

二、本实验知识和技能概要

本实验采用ODS柱，开展反相分配高效液相色谱法分析【也称C18柱，是一种常用的反相色谱柱，填料为"C18"，即十八烷基硅烷键合硅胶填料（Octadecylsilyl，简称ODS）。这种填料在反相色谱中发挥着极为重要的作用，它可以完成高效液相色谱70～80％的分析任务】。

通过本实验应掌握内标法、外标法定量的原理、方法及优缺点，并加强高效液相色谱仪的操作技能训练。

1、氯霉素的结构与性质

氯霉素是抗生素类药物，属广谱抑菌抗生素，是治疗伤寒的首选药，治疗厌氧菌感染的特效药物之一，其次用于敏感微生物所致的各种感染性疾病的治疗。由于不良反应严重现用得越来越少。

氯霉素微溶于水，且具苯环结构，所以可以用反相高效液相色谱法进行分离，并用272 nm进行检测，甲醇-水作流动相。

2、校正因子法定量原理

根据重量与峰面积成正比，有i i i A f W ?=。

在绝对校正因子法(i f )中

％组分％＝＝样

内标内标内标样内标

内标内标内标

内标内标100%100'???=????=??W W f f A A W W i A f A f W W A f A f W W i i i i i i i i i

在相对校正因子（内标i f ）法中： 内

内内标内标＝＝A W A W f f f i i

i i ∴ i i i A A W f W ??=内

内内标 ％组分％＝内标样

内内标样100%100???=?i i i f W W A A W W i 当峰形对称且峰窄时还可以用峰高代替峰面积来定量。

4、操作要点及技能训练

(1) 标准贮备液的配置

精密称定重量，先用少量甲醇溶解后，再用甲醇稀释至刻度，否则因部分未溶导致浓度不准确。

(2) Agilent 1260 HPLC 操作规程 一、Agilent 1260 HPLC 化学工作站开机顺序

1：打开计算机；

2：打开主机各模块电源（不分先后），双击1260联机,进入化学工作站；

3：调出一个分析方法，检查各参数的设置；

4：旋开泵上的排气阀，点击开启，将工作站中的泵流量设到5ml/min ，溶剂A 设到100%，排3-5分钟；

5：依此切换到B 、C 、D 溶剂分别排气；

6：将工作站中的泵流量和流动相比例恢复到方法设置；

7：关闭排气阀，观察柱前压力，压力应该逐渐升高后稳定。

二、数据采集方法编辑

1：从“方法”菜单中选择“编辑完整方法” 项，选中除“数据分析”外的三项，点击“确定”，单击确定进入下一画面。

2：在方法信息中，填上方法注释，（如：This is for test!），点击“确定”进入下一画面，此项可以不填。

3:在选择进样源/位置中，如果是手动进样器，选择手动，如果是自动进样器，默认自动进样器，点击“确定”进入下一画面。

4：泵参数设定：

在流量处输入流量,如1ml/min，在溶剂B处输入70.0,(A=100-B) ,在停止时间处填写每次分析时间。在右侧时间列表,编辑梯度。在最大压力极限处输入柱子的最大耐高压，以保护柱子。

5：自动进样器参数设定：

选择合适的进样方式, 进样体积5.0ul ,洗瓶位置为6号。“标准进样”----只能输入进样体积，此方式无洗针功能。“洗针进样”----可以输入进样体积和洗瓶位置，此方式针从样品瓶抽完样品后，会在洗瓶中洗针。“使用进样器程序”---可以点击“编辑” 按钮进行进样程序编辑。

6：柱温箱参数设定:

在柱温下面的左右方框内输入所需温度,左侧右侧一致，使柱温箱的温度左右一致。

7：DAD检测器参数设定:

DAD检测器可以最多同时采集8个波长的信号，设定采集波长，带宽，参比波长，带宽。

光谱---存储：定义了在信号A上提取并保存光谱的点。

“无”，未提取光谱；

“顶点+基线”，在峰的顶点和基线处提取光谱；

“顶点+斜率+基线”，在峰的顶点、基线、上升斜率和下降斜率提取光谱；

“峰中的全部”，提取峰内的所有光谱；

“每个一条光谱”，选择“全部”，将连续提取光谱，但是只每个一条光谱存储一条光谱，其他光谱将被弃用，这样可以减少必要的数据存储量；

“全部”，根据“峰宽”设置连续提取光谱。每个峰宽采集八条光谱，一条光谱的采集时间略少于峰宽除以8，即大于或者等于0.01s且小于或等于2.55s

8：FLD检测器参数设定

右键点击FLD模块视图的空白处，选择“方法”进入FLD的参数设置界面，设定激发波长和发射波长以及PMT增益。

激发---激发波长。限值：200到1200nm，步长1nm。“零级”：氙气灯发出的光全部光谱照射流通池。每种化合物可以吸收其具有特性波长的光，然后最大限度的发射荧光。这将增加该设置中固有的杂散光级别，并降低灵敏度(信噪比)。

发射---发射波长。限值：200到1200nm，步长1nm。“零级”：将单色器至于零级位置，是样品发射的所有光都被反射到检测器。

9：在“ 运行时选项表”中，选中“ 数据采集”、“标准数据分析”，点击“确定”。

10：从“方法”菜单中选择“方法另存为” 项，输入一方法名，如“test”，单击确定。

11：从菜单“视图”中，选中“在线信号”,选中“信号窗口1”,然后点击“改变” 钮,将所要绘图的信号移到右边的框中,点击“确定”。

12：从“运行控制”菜单中，选择“样品信息”选项，输入操作者名称，如“安装工程师”；在“数据文件”中选择“手动”或“前缀/计数器”。

区别: 手动--每次做样之前必须给出新名字,否则仪器会将上次的数据覆盖掉。前缀/计数器

----“前缀”框中输入前缀，在“计数器”框中输入计数器的起始位，仪器会自动命名，如vwd数据0001，vwd数据0002。

13：等仪器准备好，基线平稳，从“运行控制”菜单中选择“运行方法”，进样。(若无自动进样

器，则基线平稳后，进样并搬动手动进样阀，启动运行。)

三、数据处理操作步骤

1 由主菜单上的视图进入数据分析，到数据处理界面；

2 由主菜单上的文件进入调用信号，调出要分析的数据文件色谱图；

3 由主菜单上的图形进入信号选项，调整谱图坐标:

1)点自定义量程，在时间范围中输入横坐标(时间）(例如0到10)；

2)在响应范围:中输入纵坐标(响应值）(例如-50到800)；

3)在量程框中，调到全部使用相同量程；

4)点击确定退出。

4 由主菜单上的积分进入积分事件，设置、修改积分参数；

1)在斜率灵敏度后，输入斜率值；

2)在峰宽后中，输入最小峰宽值；

3)在最小峰面积后，输入最小峰面积值；

4)在最小峰高后，输入最小峰高值；

5)点击左上方带钩的图标，确认；

5 由主菜单上的报告进入设定报告，设置报告参数：

1)在定量结果栏中，选择计算（面积百分比，外标法，内标法等）；

2)在目标栏，选打印机打印，或屏幕打印；

3)点击确定退出。

6 由主菜单上的报告进入打印报告，打印报告；

四、关机

1 关机前，当流动相中有缓冲盐的时，用90%甲醇水溶液冲洗柱子和系统0.5-1小时，流量0.5—1ml/min，再用100%有机溶剂冲0.5小时，当流动相中没有缓冲盐时，直接用用100%有机溶剂冲0.5小时，然后关泵，（适于反相色谱柱）。[正相色谱柱用适当的溶剂冲洗]

2 退出化学工作站，及其它窗口，关闭计算机。

3 关掉Agilent 1260电源开关。

五、注意事项：

1 氘灯是易耗品，应最后开灯，不分析样品即关灯；

2 开机时，打开排气阀，100%水，泵流量5ml/min，若此时显示压力>10bar，则应更换排气阀内过滤白头。

3流动相使用前必须过滤，不要使用多日存放的蒸馏水（易长菌）。

4流动相使用前必须进行脱气处理，可用超声波振荡10- 15min。

5当使用缓冲溶液时，要用水冲洗手动进样器进样口，同时搬动进样阀数次，每次数毫升。6溶剂和样品过滤非常重要，对色谱柱和仪器起到保护作用。

对色谱柱：色谱柱内填料颗粒很细，色谱柱内腔很小，溶剂和样品中的细小颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞。

对仪器：溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨损，同时会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和密封垫的磨损。

(3) 数据处理

测定峰高或峰面积，分别按内标法和外标法求测含量。