各种尼帕病毒的检测技术综述

各种尼帕病毒的检测技术综述 摘要： 尼帕病毒(Nipah virus,NiV)是一种烈性人畜共患病原体,该病毒自从1998年在马来西亚暴发后,相继在新加坡、印度、孟加拉等国多次出现,引发人类重症呼吸道和神经系统疾病,病死率较高。由于NiV的高致病性、具有大流行的潜在威胁以及缺乏有效的抗病毒药物和疫苗,因此建立灵敏、快速、特异的检测和诊断方法对于防控未来的NiV疫情尤为重要。本文就NiV检测方法的研究进展进行概述。

关键词： 尼帕病毒(NiV); 病毒分离; 分子诊断; 血清学检测; Abstract： The Nipah virus(NiV)is a zoonotic paramyxovirus. Since an outbreak in Malaysia in 1998,the virus has reappeared in Singapore,India,Bangladesh and other countries,resulting in severe and fatal human respiratory and neurologic diseases. Due to the high pathogenicity of the NiV,the potential for pandemics,and the lack of efficacious antiviral drugs and vaccines,the research and development of sensitive,rapid,and specific diagnostic tools for preventing and controlling future outbreaks is crucial. Here,we discuss research progress on the detection methods for the NiV.

Keyword： Nipah virus(NiV); Virus isolation; Molecular diagnosis; Serum detection; 在过去的几十年中，世界各地多次出现导致严重烈性疾病的病毒暴发事件，包括已知及未知的病毒病原体，如严重急性呼吸道综合征冠状病毒、埃博拉病毒、拉沙热病毒、马尔堡病毒、尼帕病毒、亨德拉病毒、裂谷热病毒和中东呼吸综合征冠状病毒等。上述病毒引发的疾病在全球范围内对人类健康产生了严重影响，造成巨大的经济损失。1998年9月下旬，马来西亚的怡保（Ipoh）附近报告了第一例尼帕病毒感染病例，并于1999年3月在Kampung sungai nipah地区病人样本中首次成功分离，因此命名为尼帕病毒（Nipah virus,NiV)。根据其外观NiV被分类为副黏病毒科（Paramyxovirinae），又因其与亨德拉病毒（Hendra virus,HeV）抗血清有强烈的交叉反应，且进一步测序表明其为一种新型副黏病毒，故与HeV一同被划为亨尼帕病毒属（Henipavirus）。自从NiV首次暴发以来，相继在马来西亚、新加坡、孟加拉国、印度和菲律宾五个国家出现，导致人群严重感染与高死亡率。目前，尚无特异性治疗药物和预防疫苗，对感染高风险地区的动物宿主和环境进行持续监测有助于发现感染的早期迹象，控制疾病暴发。本文旨在通过对各种NiV检测方法的描述和分析，加强人们对于NiV疫情防控的认识，应对潜在的传染病疫情。

1、 NiV基因结构 NiV属副黏病毒科亨尼帕病毒属，是一种包膜病毒，形状多形，病毒颗粒平均直径500nm（范围180nm～1 900nm），有囊膜和刺突，基因组为不分节段的单负链RNA。基因组从3' 端开始编码6种结构蛋白，依次是核蛋白（Nucleoprotein,N）、磷蛋白（Phosphoprotein,P）、基质蛋白（Matrix protein,M）、融合蛋白（Fusion protein,F）、糖蛋白（Glycoprotein,G）和大蛋白（Large protein,L）。其中P基因由于开放编码区不同，还编码3种非结构蛋白C、V、W。病毒核衣壳由N、L、P三种蛋白组成，囊膜由M、G、F三种蛋白组成。NiV有两个主要家系：马来西亚株（NiV‐M）和孟加拉株（NiV‐B),NiV‐M与NiV‐B氨基酸同源性大于92%，核苷酸序列的同源性为91.8%。两种毒株非常相似，但长度不同，NiV‐M基因组长度为18 246 nt,NiV‐B基因组为18 252 nt，多出的6nt主要位于F基因的5' 端非编码区。本文作者下载了GenBank发布的全部30条NiV全基因组序列，MEGA7.0软件构建全基因进化树，分析结果表明，NiV分为明显的两支，马来西亚和柬埔寨检测到的NiV毒株为同一分支，而孟加拉国和印度流行的毒株则为另一分支（图1）。

2、 流行病学特征 狐蝠属果蝠已被确认是NiV的主要自然宿主。另外，NiV也可感染其他哺乳动物，如猪、猫、狗、马、人等。区别于大多数副黏病毒，NiV拥有更广泛的宿主范围。流行病学研究表明，与被NiV感染的动物密切接触，以及食用被携带NiV蝙蝠污染的椰枣汁是导致NiV由动物向人传播的重要因素。此外，在孟加拉国和印度的NiV暴发中有明显的人际传播。

研究表明，大多数NiV感染病例的潜伏期不到15d，特殊情况下潜伏期可延长至4个月或更久。NiV感染引发疾病始于非特异性症状，如突然发烧、头痛和肌痛，甚至恶心和呕吐。然后病毒扩散至不同的器官和系统，引发系统性血管炎、肺炎、脑炎等疾病。根据WHO报告的数据，截至2018年6月，NiV疫情出现在马来西亚、新加坡、孟加拉国、印度和菲律宾五个国家，共有643名实验室确诊患者，导致至少380人（59%）死亡，其中新加坡病死率最低，为9.1%，而印度和孟加拉国的病死率最高，分别达到75.3%和75.9%（图2）。

图1 尼帕病毒全基因组核酸序列进化分析

Figure 1 Phylogenetic analyses of nucleic acid sequences of the whole genome of Nipah Virus(NiV)

3、 NiV检测方法 目前，实验室诊断是确诊NiV感染的唯一途径，可以通过病毒分离、组织病理学、血清学、分子诊断和免疫组化等技术进行检测。

3.1、 病毒分离培养 病毒分离是实验室诊断的金标准，NiV病毒分离有助于确定新病例或鉴定新宿主，感染样本通常来源于急性期患者脑脊液、血液、鼻/咽拭子、尿液或感染动物组织（淋巴结、肺、肾、脾等）。NiV在Vero细胞中生长良好，在病毒感染3d内可以观察到细胞病变效应（Cytopathic effect,CPE），若未出现CPE，建议每隔5d进行两次盲传。CPE主要表现为20个或更多的细胞核组成的合胞体，核衣壳和细胞核通常位于细胞周围，在感染后期这种现象更明显。值得注意的是，由于所用毒株和细胞系不同，CPE也会略有不同。此外，BHK和RK‐13细胞也可用于NiV病毒分离。从狐蝠属黑蝠的20个不同器官组织中成功培养出原代细胞，使用逆转录病毒系统稳定表达SV40大T抗原和人端粒酶逆转录酶蛋白可使细胞永生化，从而构建出稳定的蝙蝠细胞系。在2011年HeV暴发调查中应用此细胞系成功对蝙蝠尿液样本进行病毒分离，这对于NiV的分离培养提供了一种新思路。

图2 尼帕病毒感染引起的人类病例数和病死率

Figure 2 Number of NiV infections and mortality due to Nipah Virus(NiV)infection in human

NiV作为一种烈性病原体，其分离培养需要在生物安全4级实验室（Biosafety laboratory level 4,BSL‐4）中进行。病毒在细胞中增殖可以达到较高滴度（108TCID50），透射电镜下可直接观察病毒，免疫印迹法可检测病毒和抗体的相互作用。但若要确诊NiV感染还需其他诊断方法，如免疫荧光、免疫电镜、血清中和实验以及分子诊断等。

3.2、 分子诊断 3.2.1、 PCR检测 PCR以及基因组测序等分子诊断技术由于灵敏度高、检测速度快，在人和动物疾病的病毒感染检测中发挥重要作用。在NiV的实时荧光定量PCR(real‐time quantitative PCR,qPCR）检测方法建立之前，常规PCR方法一直用于亨尼帕病毒（Henipavirus）的检测与诊断。美国CDC基于NiV保守的N基因设计的PCR方法可用于检测不同类型标本中的核酸，包括脑脊液、尿液、各种拭子、新鲜的或者固定的组织。PCR产物测序有助于从组织上清液中快速鉴定病毒分离株。一种靶向N基因且带有内参的巢式PCR检测方法，降低了由于样本中含有PCR抑制剂造成的假阴性结果，从而提高检出准确率和监测的可靠性，应用该方法证实泰国蝙蝠种群中至少存在两种不同的NiV毒株流行。

Guillaume V等开发出一种基于N基因序列的Taqman qPCR检测方法，检测范围为103～109拷贝/反应，灵敏度接近1pfu，且有较好的特异性，不能检测到同为亨尼帕病毒属的HeV RNA。基于N基因序列开发的SYBR Green qPCR检测方法检测限约为100pfu，因其同时可以检测到HeV RNA，故特异性有待提高。此方法虽不能应用于标本的诊断，但可用于定量评估NiV在不同细胞上的体外复制动力学。Zoologix公司开发的qPCR检测试剂盒也可用于检测血液、血清、脑脊液、受感染动物组织或分泌物中的NiV。

为检测Henipavirus包含的所有病毒，Feldman K S等建立了检测NiV的N、P、M、L基因的qPCR检测方法。结果表明，N基因SYBR Green qPCR方法更适用于调查潜在未知的Henipavirus,P基因Taqman qPCR方法则最适用于检测需要高灵敏度的已知NiV或HeV感染。

在qPCR技术基础上开发建立的Taqman探针微流体阵列卡（TaqMan array card,TAC）检测技术可以同时检测包括NiV在内的26种可引起急性发热性疾病的相关病原体，灵敏度和特异性分别达到88%和99%，可用于现场疫情调查或病原体快速筛选。

3.2.2、 基因组测序 Sanger测序在NiV的诊断以及确定基因组靶区域的潜在突变位点方面起重要作用，新一代测序技术（Next‐generation sequencing,NGS）成为新的Henipavirus分离株快速全基因组测序的首选。应用测序技术研究发现，马来西亚分离的NiV毒株来源于蝙蝠、猪和人等不同宿主，但其基因组序列却非常相似，后来从孟加拉国和印度分离的NiV毒株序列与马来西亚毒株序列差异很大，基因进化分析表明NiV有两个主要家系：马来西亚NiV和孟加拉NiV。