Cell Quest Pro双色淋巴细胞亚群分析样本制备

Cell Quest Pro双色淋巴细胞亚群分析样本制备

【实验目的】：使用双色组合标记抗体对人外周血中淋巴细胞亚群进行检测，了解人的免疫状态。从而指导临床诊断和治疗。

【实验原理】：利用荧光技术，在不同的鼠抗人的抗体上标上荧光素，此荧光抗体就同人淋巴细胞表面的CD分子特异性的结合；然后用流式细

胞仪检测，结合分析软件的自动分析,便可以得出各亚群细胞的百

分比。

【主要试剂】：1、流式细胞仪（FACSCalibur）、台式离心机、涡旋震荡器，微量移液器（1000μl、200μl、20μl，流式细胞专用试管、鞘液；PBS

（加0.1%叠氮钠）

2、双色检测试剂：

①Isotype Control(MouseIgG1/IgG2a) ②CD3-FITC /CD19-PE

③CD3-FITC /CD4-PE ④CD3 FITC /CD8-PE

⑤CD3-FITC /CD16+CD56-PE

3、FACS Lysing Solution红细胞裂解液。（10×,使用前用蒸馏水

稀释成1×）。

4、1%的多聚甲醛配制方法：

称1.0克多聚甲醛加少量PBS放入56℃水浴箱中使之溶解，用1N NaOH溶液和1N的HCl调整PH值在6.9~7.0，然后加入100ml

容量瓶中定容；最后用0.45um的滤膜过滤。

【实验步骤】：1、取5支流式试管，编号为1、2、3、4、5，分别取100µl抗凝全血加入每支试管中，不要碰到管壁。

2、轻轻混匀，依次加入20µl双标Isotype Control (Mouse IgG1/

IgG2a)、CD3/CD19、CD3/CD4、CD3/CD8、CD3/CD16+CD56

荧光抗体。室温避光保存20分钟。

3、取出试管，每管加入10倍稀释了的1×FACS Lysing Solution

2ml，涡旋混匀，避光〈10分钟。待管内液体透亮。然后300g

离心5min，弃去上清液。

4、每管加入2ml的PBS ，涡旋混匀，300g离心5min，弃去上清

液。然后加入0.5ml PBS混匀，4℃避光1h内上机检测；若不能及时上机，加入0.5ml 含1%多聚甲醛的PBS，放4℃冰箱保存，48h内上机检测。