德国Zeiss LSM710激光扫描共聚焦显微镜操作说明

德国Zeiss 激光扫描共聚焦显微镜

快速操作手册

制作制作：：Zeiss 光学仪器光学仪器（（上海上海））国际贸易有限公司孙凯

2009年6月

系统组成及光路示意图实物照片实物照片说明说明

2.1 开机顺序

2.2 软件的软件的快速快速快速使用使用使用说明说明 2.3 显微镜显微镜的的触摸屏控制

2.4 关机顺序

激光扫描共聚焦显微镜系统主要由激光扫描共聚焦显微镜系统主要由：：电动荧光显微镜电动荧光显微镜、、扫描检测单元扫描检测单元、、激光器激光器、、电脑工作站及各相关附件组成电脑工作站及各相关附件组成。。

系统系统组成及光路组成及光路组成及光路示意图示意图示意图：：

电脑工作站

激光器

扫描检测单元

电动荧光显微镜

实物照片说明实物照片说明：：

电动荧光显微镜

扫描检测单元

CO 2培养系统控制器

激光器

电脑工作站

2.1 开机顺序

（1）打开稳压电源打开稳压电源（（绿色按钮绿色按钮））

（2）主开关 [ MAIN SWITCH ]“ON ” 电脑系统 [ SYSTEMS/PC ]“ON ” 扫描硬件系统 [ COMPONENTS ]“ON ”

（3）打开 [ 扫描载物台开关 ] 打开 [ 电动显微镜开关 ]

打开 [ 荧光灯开关 ]

（注：具有荧光光强调节具有荧光光强调节旋钮旋钮旋钮））

（4）Ar 离子激光器 “ON ” 顺时针旋转钥匙至 “—” 预热预热等待约等待约15分钟分钟，，

将激光器 [ 扳钮 ] 由“Standby

“Laser run ”状态状态，，即可正常使用

（5）打开 [ 电脑开关 ]，进入操作系统注：键盘上也具有 [ ]

2.2 软件的快速使用说明

（1）电脑开机进入操作系统界面后，双击桌面共聚焦软件ZEN 图标

（2）进入ZEN 界面，弹出对话框：

“Start System ”————初始化整个系统，用于激光扫描取图、分析等。

“Image Processing ”——不启动共聚焦扫描硬件，用于已存图像数据的处理、分析。

（3）软件界面：

1 功能界面切换功能界面切换：：扫描取图扫描取图（（Acquisition 、）、图像处理图像处理图像处理（（Processing 、）、维护维护维护（（Maintain ）（注：Maintain 仅供Zeiss 专业工程师使用专业工程师使用））

2 动作按钮动作按钮；；

3 工具组工具组（（多维扫描控制多维扫描控制））；

4 工具详细界面工具详细界面；；

5 状态栏状态栏；；

6 视窗切换按钮视窗切换按钮；；

7 图像切换按钮图像切换按钮；；

8 图像浏览/预扫描窗口预扫描窗口；；

9 文档浏览/处理区域处理区域；；10 视窗中图像处理模块

动作按钮动作按钮：：

Single ——扫描单张图片、并在图像预览窗口显示。

Start ——

——开始扫描单张图片或一个实验流程（1组图片，如XYZ 、XYT 等）。 Stop ————暂停/结束扫描。

New ——

——建立一个新图像扫描窗口/文档。

激光激光连接状况检查连接状况检查

眼睛观察/相机/共聚焦LSM 光路切换光路切换（（ZEN 软件界面右上角软件界面右上角））

：

Ocular ——通过观察筒用眼睛观察。（激光安全保护装置自动阻断激光、保护眼睛。） Camera ————光路切换至相机。 LSM ——

——共聚焦扫描成像光路。

显微镜设置显微镜设置：：

“Ocular ”——> “Light Path ”——>

点击物镜图标点击物镜图标，，选择物镜选择物镜————> 样品聚焦样品聚焦。。

透射光控制透射光控制（（Transmitted Light Control ）反射光光闸控制反射光光闸控制（（Reflected Light Shutter ）荧光激发块选择荧光激发块选择（（Reflector ）

共聚焦LSM 扫描设置

点击点击““LSM ”（ZEN 软件界面右上角软件界面右上角）），系统切换至共聚焦扫描光路系统切换至共聚焦扫描光路：：

光路设置光路设置：：

选取“荧光探针”、“颜色”、扫描方法，应用“Apply ”。

（注：Fastest 为最快速扫描，多条激光谱线同时扫描。Best signal 为最佳信号扫描，多条激光谱线顺序扫描。Best compromise 为兼顾速度与信号的折中式扫描。）

扫描图像参数设置扫描图像参数设置：：

每个通道的精细调节每个通道的精细调节：：包括包括：：

（1）Pinhole 的调节的调节（（一般设为1AU 。该值越大该值越大，，则信号越强则信号越强，，但共聚焦图像效果会降低但共聚焦图像效果会降低。。原则上原则上，，在保证图像质量的前提下在保证图像质量的前提下，，该值越接近于1AU 越好越好））

；（2）Master Gain 的调节的调节（（增大则信号和噪音都增增大则信号和噪音都增强强，减小则信号和噪音均减小减小则信号和噪音均减小。。原则上原则上，，在保证图像质量的前提下像质量的前提下，，Gain 值越小越好值越小越好））

；（3）Digital Offset 的调节的调节（（可扣除背景噪音可扣除背景噪音，，但标本信号但标本信号也也有一定程度的扣除有一定程度的扣除。。原则上原则上，，在保证图像质量的前提下像质量的前提下，，Digital Offset 值越接近于0越好越好））

；（4）Digital Gain 的调节的调节（（增大则信号和噪音都增强增大则信号和噪音都增强，，减小则信号和噪音均减小减小则信号和噪音均减小。。原则上原则上，，在保证图像质量的前提下像质量的前提下，，Gain 值越接近于1.0~1.2越好越好））；

（5）另外另外，，对于每个通道对于每个通道，，需要灵活调节激光的强度需要灵活调节激光的强度（（激光强度越高激光强度越高，，则信号越强则信号越强，，但噪音也相应增强，同时标本更容易被漂白或淬灭同时标本更容易被漂白或淬灭。。原则上原则上，，在保证图像质量的前提下在保证图像质量的前提下，，激光强度越低越好激光强度越低越好。。

）

选择

可连续扫描可连续扫描、、一边预览图像效果一边预览图像效果、、一边一边精细调节精细调节精细调节各个通道的扫描参数各个通道的扫描参数各个通道的扫描参数。。

如果预览图像的效果可以如果预览图像的效果可以，，则先则先““Stop ”，再点击再点击““Single ”

或“Start ”

即可完成图像的扫描即可完成图像的扫描。。

图像的保存图像的保存：：

三种方法三种方法：：

（1）“File ”菜单下菜单下，，“Save ”或者或者““Save AS ”。（2）点击右下角按钮。（3）点击工具栏按钮。

（如图所示如图所示））

另外另外，，通过通过““File ”菜单下的菜单下的““Export ”，也可将图像以其它格式输出也可将图像以其它格式输出。。

2.3 显微镜的显微镜的触摸屏控制触摸屏控制

显微镜可由TFT 液晶触摸屏进行控制：

由触摸屏“Home/主页”进入“Control/显微镜控制”界面，

触摸屏常用控制界面触摸屏常用控制界面：：

TFT 触摸屏控制直观直观、、便捷便捷。。

Objectives 物镜控制

TL 透射光光闸 RL 反射光光闸

Reflector 荧光激发块荧光激发块控制控制荧光观察时荧光观察时，，需要选择相应的荧光激发块

（或者激发波长或者激发波长、、发射波长相近的荧光激发块近的荧光激发块）） Light path 光路设置触摸控制触摸控制，，可将光路切换至可将光路切换至““Eyepiece ”

目镜观察筒目镜观察筒，，或者将光路切换或者将光路切换至左侧共聚至左侧共聚焦光路焦光路““Sideport L ”，或者将光路切换至前侧前侧““Frontport ”相机相机。。

2.4 关机顺序关机顺序：：

（1）关闭软件关闭软件：：主菜单主菜单““File ”——>“Exit ”，退出共聚焦软件ZEN 。（2）关闭关闭主电脑主电脑主电脑操作系统操作系统操作系统、、显示器电源显示器电源。。（3）关闭 [荧光荧光灯电源灯电源 ]。

（4）关闭 [扫描载物台电源] 、[显微镜系统电源]。（5）关闭Ar 激光器激光器：：

先将 [扳钮] 从 “Laser run ” 扳到 “Standby ” 状态状态；；再将 [钥匙] 逆时针逆时针从从“—”旋转到“O ”状态状态；；等待约8-10分钟分钟、、激光器激光器风扇停止转动风扇停止转动风扇停止转动后后（切记切记！！），

将主开关按钮按钮按到按到按到““OFF ”。

（6）如果使用了 [CO2培养系统] ，则关闭其电源则关闭其电源。。（7）扫描硬件系统 [ COMPONENTS ]“OFF ”

电脑系统 [ SYSTEMS/PC ]“OFF ” 主开关 [ MAIN SWITCH ]“OFF ”

（8）等 [灯箱] 充分冷却后充分冷却后，，再放防尘罩再放防尘罩。。

（9）如果长时间如果长时间（（>1 day ）不使用不使用，，则关闭稳压电源则关闭稳压电源、、墙上总电源墙上总电源。。

主要注意事项如下：

（1）打开稳压电源时，应等待2分钟（电压稳定）后，再开其它开关。（2）严格遵守[激光器]的开、关流程（详见“2.1 开机顺序”）。

（3）如果使用过[油镜]，或者物镜表面较脏，则需用[擦镜纸]擦干净物镜的前表

面（清洁液使用无水乙醇和无水乙醚的混合液，混合比例：无水乙醇30%、无水乙醚70%）。

（4）不使用荧光时，不打开[荧光灯]。避免频繁开/关荧光灯。（5）必须等灯箱充分冷却后，再小心地盖上[防尘罩]。（6）显微镜可由[TFT 触摸屏]控制，使用触摸屏时注意：

①手指保持清洁、干燥状态，并且为了保证他人使用安全，触摸时严禁配戴有可能接触污染物或危险样品的手套； ②触摸屏已足够灵敏，不要大力按压触摸屏； ③不要旋转、插拔触摸屏。

（7）刻录图像数据资料：应使用刻录光驱刻录，实验前应准备好刻录光盘。

切记切记：：为了防止计算机病毒为了防止计算机病毒，，严禁在共聚焦电脑上使用U 盘、硬动硬硬动硬盘或盘或者上网者上网！！

！！（8）未经授权，严禁自行安装任何软件！！！

（9）实验室温度应保持在22℃±2℃，湿度40%-60%。（10）避免空调直接对着显微镜吹风。

（11）整个实验过程应注意保持显微镜周围环境清洁。

Nikon ECLIPSE Ti倒置荧光显微镜使用说明

Nikon ECLIPSE Ti倒置荧光显微镜使用说明操作步骤：本显微镜的荧光光路与明视场（相差、DIC也属明视场）光路相对独立。当使用明视场时，无需打开荧光光源，进打开总电源即可。当使用荧光观察时，可同时打开总电源和荧光电源。明视场观察： 1.开机：按动总电源开关“1”处接通电源，此时开关和指示灯点亮，打开显微镜底座左侧的透射照明器开关，从小到大调节照明器开关下方的亮度调节旋钮，使照明亮度适当。 2.首先将聚光器模板A放入光路，用10×物镜对样品进行对焦，调节目镜的屈光度调节环，然后换用40×物镜观察样品。 3.关机：将亮度调节旋钮旋至亮度最暗位置，关掉显微镜底座左侧的透射照明器开关，然后按动总电源开关“0”处关闭电源。 DIC微分干涉观察：开机、关机等与明视场观察相同，区别是要使用聚光器相对应的DIC模板N1及起偏器、检偏器，将其放入光路后，再使用专用的银白色DIC物镜对焦观察。在观察过程中可旋转起偏器，达到最佳的观察效果。相差观察：开机、关机等与明视场观察相同，区别是要使用聚光器相对应的相差模板PH1。荧光观察： 1.开机：先打开荧光灯电源开关，然后按住电源开关上方的荧光灯激发按钮3秒钟后松开，即可见荧光灯点亮。 2.打开荧光转盘上的荧光拨杆至“0”位置，此时荧光光路打开。旋转荧光转盘，转入所对应的滤光片位置即可进行荧光观察；在观察过程中可插入位于荧光灯源前方的减光片，以改变荧光强度，减弱对活细胞样品的损伤。 3.关机：直接关掉荧光灯电源开关即可。注意事项： 1.短时间内频繁开关荧光灯电源，将极大的缩短荧光灯寿命。 2.荧光光源打开后即可使用，但必须使用20分钟才可以关闭；关闭30分钟以后才可以再次打开，否则会导致荧光灯损坏。 3.不要同时反方向转动显微镜左右两侧的调焦钮，否则会导致显微镜损坏。 4.粗动调焦钮达到限定位置后，如果继续向同一方向旋转会引起显微镜故障。请不要旋转过度。 5.显微镜光源在工作时会产生高温，因此小心不要接触光源以防烫伤，也不要将易燃品如纸张、布、塑料和酒精等放置于光源附近。

德国Zeiss 激光共聚焦显微镜快速操作手册

德国Zeiss 激光共聚焦显微镜快速操作手册德国 Zeiss 激光扫描共聚焦显微镜快速操作手册制作: 光学仪器(上海)制作:Zeiss 光学仪器(上海)国际贸易有限公司孙凯 2009 年 6 月目录:目录:1 系统的组成系统组成及光路示意图实物照片说明实物照片说明2 系统的使用2.1 开机顺序软件的快速使用说明2.2 软件的快速使用说明快速使用显微镜的2.3 显微镜的触摸屏控制2.4 关机顺序3 系统的维护1 系统的组成激光扫描共聚焦显微镜系统主要由:电动荧光显微镜、扫描检测单元、激光器、电脑工作站及各相关附件组成。激光扫描共聚焦显微镜系统主要由:电动荧光显微镜、扫描检测单元、激光器、电脑工作站及各相关附件组成。系统组成及光路示意图:系统组成及光路示意图: 组成及光路示意图电动荧光显微镜扫描检测单元激光器电脑工作站实物照片说明:实物照片说明: 电动荧光显微镜扫描检测单元CO2 培养系统控制器激光器电脑工作站2 系统的使用2.1 开机顺序 )打开稳压电源(绿色按钮)(1)打开稳压电源(绿色按钮) 等待 2 分钟(电压稳定)后，再开其它开关) “ ”(2)主开关 MAIN SWITC H “ON” “ ”电脑系统SYSTEMS/PC “ON” “ ”扫描硬件系统COMPONENTS “ON” )(3)打开电动显微镜开关打开荧光灯开关 (注:具有 5 档光强调节旋钮) ) 离子激光器主开关”(4)Ar 离子激光器主开关“ON”顺时针旋转钥匙至“—”预热等待约分钟，预热等待约 15 分钟，”将激光器扳钮由“Standby”扳至”状态，“Laser run”状态，即可正常使用 ) ，(5)打开电脑开关，进入操作系统注:键盘上也具有电脑开关 2.2 软件的快速使用说明(1)电脑开机进入操作系统界面后，双击桌面共聚焦软件 ZEN 图标(2)进入 ZEN 界面，弹出对话框: ”——“Start System”——初始化整个系统，用于激光扫描取图、分析等。“Image Processing”——不启动共聚焦扫描硬件，用于已”存图像数据的处理、分析。(3)软件界面: 功能界面切换:扫描取图( ) 图像处理( 、图像处

激光共聚焦扫描显微镜简介

激光共聚焦扫描显微镜简介一、激光共聚焦显微镜的基本组成激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope LSCM)是20世纪80年代发展起来的一项具有划时代意义的高科技新产品，是当今世界最先进的细胞生物学分析仪器。激光共聚焦显微镜利用激光作为光源，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦的原理和装置，以及通过针孔的选择和PMT的收集，并带有一套对其所观察到的对象进行数字图像分析处理的系统软件。与传统光学显微镜相比，它具有更高的分辨率，实现多重荧光的同时观察并可形成清晰的三维图象等优点。所以它问世以来在生物学的研究领域中得到了广泛应用。激光共聚焦显微镜主要有四部分组成：1、显微镜光学系统。2、扫描装置。3、激光光源。4、检测系统。整套仪器由计算机控制，各部件之间的操作切换都可在计算机操作平台界面中方便灵活地进行。 1.1 显微镜光学系统显微镜是LSCM的主要组件，它关系到系统的成象质量。显微镜光路以无限远光学系统可方便地在其中插人光学选件而不影响成象质量和测量精度。物镜应选取大数值孔径平场复消色差物镜，有利于荧光的采集和成象的清晰。物镜组的转换，滤色片组的选取，载物台的移动调节，焦平面的记忆锁定都应由计算机自动控制。 1.2 扫描装置 LSCM使用的扫描装置在生物领域一般为镜扫描。由于转镜只需偏转很小角度就能涉及很大的扫描范围，图象采集速度大大提高，512×512画面每秒可达5帧以上，有利于那些寿命短的离子作荧光测定。扫描系统的工作程序由计算机自动控制。 1.3 激光光源 LSCM使用的激光光源有单激光和多激光系统。多激光器系统在可见光范围使用多谱线氩离子激光器，发射波长为457nm、488nm和514nm的蓝绿光，氦氖绿激光器提供发射波长为543nm的绿光，氦氖红激光器发射波长为633nm的红光。 1.4 检测系统 LSCM为多通道荧光采集系统，一般有三个荧光通道和一个透射光通道，能升级到四个荧光通道，可对物体进行多谱线激光激发，样品发射荧光的探测器为感光灵敏度高的光电倍增管PMT，配有高速12位A/D转换器，可以做光子计数。PMT前设置针孔，由计算机软件调节针孔大小，光路中设有能自动切换的滤色片组，满足不同测量的需要,也有通过光栅或棱镜分光后进行光谱扫描功能的设置。二、激光共聚焦显微镜的特点以及在生物领域的应用与传统光学显微镜相比，激光共聚焦显微镜具有更高的分辨率，实现多重荧光的同时观察并可形成清晰的三维图象等优点，在对生物样品的观察中，激光共聚焦显微镜有如下优越性： 1、对活细胞和组织或细胞切片进行连续扫描，可获得精细的细胞骨架、染色体、细胞器和细胞膜系统的三维图像。 2、可以得到比普通荧光显微镜更高对比度、高解析度图象、同时具有高灵敏度、杰出样品保护。 3、多维图象的获得，如7 维图象(XYZaλIt): xyt 、xzt 和xt 扫描,时间序列扫描旋转扫描、区域扫描、光谱扫描、同时方便进行图像处理。

荧光显微镜操作手册簿

荧光显微镜操作手册 Olympus BX51 物镜： 4 ×0.16 （无DIC） 10×0.40 20×0.75 40×1.00 oil 100×1.40 oil 荧光滤色块转盘： 1. WU 蓝 2. WIB 绿（长通） 3. WIBA 绿（带通） 4. WIG 红 5. CFP 青 6. YFP 黄操作步骤：（注意：样品须在低倍镜下放置和取下） DIC观察：

1.打开明场电源开关（“︱”为开，“○”为关） 2.将样品置于载物台上，用样品夹夹好 3.将起偏器、检偏器、DIC棱镜推入光路，荧光滤块转盘拨到“1”位置，DIC棱镜应与相应的物镜倍数相匹配 4.先选用低倍物镜（“10×”） 5.调节透射光的强度，调节焦距，找到视野 6.换到高倍镜头，观察样品 7.DIC观察时，光路选择拉杆拉到中间位置，既可观察，也可拍照荧光观察： 1.打开明场电源开关 2.打开汞灯电源开关 3.将样品置于载物台上，用样品夹夹好 4.检偏器、DIC棱镜在光路外 5.将荧光光路shutter打开（“○”为开，“●”为关），需保护样品时关闭shutter 6.光路选择拉杆推至最里边 7.根据样品的标记情况将荧光滤块转盘转到相应的位置 8.通过两组减光滤片调节激发光强度 9.从低倍镜开始观察，调焦，找到预观察视野， 10.依次换到高倍镜头，观察样品 11.拍照时光路选择拉杆完全拉出普通明场观察： 1.打开明场电源开关（“︱”为开，“○”为关） 2.将样品置于载物台上，用样品夹夹好 3.起偏器、检偏器、DIC棱镜在光路外，荧光滤块转盘拨到“1”位置，DIC棱镜拨到明场（BF）位置 4.先选用低倍物镜（“4×”） 5.调节透射光的强度，调节焦距，找到视野 6.依次换到高倍镜头，观察样品 7.光路选择拉杆拉到中间位置既可观察，也可拍照关机： 1.关闭汞灯电源（注意：汞灯需使用半小时以上方可关闭，关闭半小时以后方可再次开启） 2.将透射光调到最小，关闭明场电源开关 3.将镜头转到低倍镜，取出样品，若使用过油镜用干净的擦镜纸擦拭镜头 4.确认数据已经保存，关闭软件 5.使用光盘拷贝数据（禁止使用移动储存设备拷贝数据） 6.关闭电脑，登记使用时间、荧光数字等使用情况

Zeiss 激光扫描共聚焦显微镜操作手册

Zeiss 激光扫描共聚焦显微镜操作手册目录: 1 系统得组成系统组成及光路示意图实物照片说明 2 系统得使用 2、1 开机顺序 2、2 软件得快速使用说明 2、3 显微镜得触摸屏控制 2、4 关机顺序 3 系统得维护 1 系统得组成激光扫描共聚焦显微镜系统主要由:电动荧光显微镜、扫描检测单元、激光器、电脑工作站及各相关附件组成。系统组成及光路示意图: 电脑工作站激光器电动荧光显微镜扫描检测单元实物照片说明: 电动荧光显微镜扫描检测单元 CO2 培养系统控制器激光器电脑工作站 2 系统得使用 2、1 开机顺序 (1)打开稳压电源(绿色按钮) 等待2 分钟(电压稳定)后,再开其它开关 (2)主开关[ MAIN SWITCH ]“ON” 电脑系统[ SYSTEMS/PC ]“ON” 扫描硬件系统[ PONENTS ]“ON” (3)打开[ 电动显微镜开关] 打开[ 荧光灯开关] (注:具有5 档光强调节旋钮) (4)Ar 离子激光器主开关“ON” 顺时针旋转钥匙至“—” 预热等待约15分钟, 将激光器[ 扳钮] 由“Standby”扳至 “Laser run”状态,即可正常使用 (5)打开[ 电脑开关],进入操作系统

注:键盘上也具有[ 电脑开关] 2、2 软件得快速使用说明 (1)电脑开机进入操作系统界面后,双击桌面共聚焦软件ZEN 图标 (2)进入ZEN 界面,弹出对话框: “Start System”——初始化整个系统,用于激光扫描取图、分析等。 “Image Processing”——不启动共聚焦扫描硬件,用于已存图像数据得处理、分析。 (3)软件界面: 1 功能界面切换:扫描取图(Acquisition)、图像处理(Processing)、维护(Maintain) (注:Maintain仅供Zeiss专业工程师使用) 2 动作按钮; 3 工具组(多维扫描控制); 4 工具详细界面; 5 状态栏; 6 视窗切换按钮; 7 图像切换按钮;8 图像浏览/预扫描窗口;9 文档浏览/处理区域;10 视窗中图像处理模块动作按钮: Single ——扫描单张图片、并在图像预览窗口显示。 Start ——开始扫描单张图片或一个实验流程(1组图片,如XYZ、XYT 等)。 Stop ——暂停/结束扫描。 New ——建立一个新图像扫描窗口/文档。激光连接状况检查眼睛观察/相机/共聚焦LSM 光路切换(ZEN软件界面右上角): Ocular ——通过观察筒用眼睛观察。(激光安全保护装置自动阻断激光、保护眼睛。) Camera ——光路切换至相机。 LSM ——共聚焦扫描成像光路。显微镜设置: “Ocular”——> “Light Path”——> 点击物镜图标,选择物镜——> 样品聚焦。透射光控制(Transmitted Light Control) 反射光光闸控制(Reflected Light Shutter) 荧光激发块选择(Reflector) 共聚焦LSM 扫描设置点击“LSM”(ZEN软件界面右上角),系统切换至共聚焦扫描光路: 光路设置: Smart Setup ——自动预设光路选取“荧光探针”、“颜色”、扫描方法, 应用“Apply”。 (注:Fastest 为最快速扫描,多条激光谱线同时扫描。Best signal 为最佳信号扫描,多条激光谱线顺序扫描。Best promise 为兼顾速度与信号得折

激光共聚焦显微镜的原理与应用范围

激光共聚焦显微镜的原理与应用范围激光扫描共聚焦显微镜是采用激光作为光源，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦原理和装置，并利用计算机对所观察的对象进行数字图象处理的一套观察、分析和输出系统。把光学成像的分辨率提高了30%~40%，使用紫外或可见光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察生理信号及细胞形态的变化，成为形态学，分子生物学，神经科学，药理学，遗传学等领域中新一代的研究工具。 1激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）的原理从基本原理上讲,共聚焦显微镜是一种现代化的光学显微镜,它对普通光镜从技术上作了以下几点改进: 1．1用激光做光源因为激光的单色性非常好,光源波束的波长相同,从根本上消除了色差。1．2采用共聚焦技术在物镜的焦平面上放置了一个当中带有小孔的挡板,将焦平面以外的杂散光挡住,消除了球差;并进一步消除了色差 1．3采用点扫描技术将样品分解成二维或三维空间上的无数点,用十分细小的激光束(点光源)逐点逐行扫描成像,再通过微机组合成一个整体平面的或立体的像。而传统的光镜是在场光源下一次成像的,标本上每一点的图像都会受到相邻点的衍射光和散射光的干扰。这两种图像的清晰度和精密度是无法相比的。 1．4用计算机采集和处理光信号,并利用光电倍增管放大信号图在共聚焦显微镜中,计算机代替了人眼或照相机进行观察、摄像,得到的图像是数字化的,可以在电脑中进行处理,再一次提高图像的清晰度。而且利用了光电倍增管,可以将很微弱的信号放大,灵敏度大大提高。由于综合利用了以上技术。可以说ＬＳＣＭ是显微镜制作技术、光电技术、计算机技术的完美结合,是现代技术发展的必然产物。 2ＬＳＣＭ在生物医学研究中的应用目前,一台配置完备的ＬＳＣＭ在功能上已经完全能够取代以往的任何一种光学显微镜,它相当于多种制作精良的常用光学显微镜的有机组合,如倒置光学显微镜、紫外线显微镜、荧光显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜(ＰＨ)、微分干涉差显微镜(ＤＩＣ)等,因此被称为万能显微镜,通过它所得到的精细图像可使其他的显微镜图像无比逊色。

倒置荧光显微镜操作说明

显微镜及数码成像系统操作简要第一部分观察方法步骤 1、明场观察方法步骤 2、相差观察方法步骤 3、荧光观察方法步骤第二部分使用IPP拍摄图像流程(相差观察、荧光观察) 第三部分使用BX2-BSW拍摄图像流程(明场观察)

1、明场观察方法步骤步骤涉及部件主开关拨到“I ” 准备工作：柯勒照明光轴中心调节第一次观察须完成此调试，完成后不需要再调节，直至装卸过部件后，使用过程中请不要扭动聚光镜中心调节旋钮。 ① 聚光镜升高到最高位置聚光镜高度升降旋钮 ② 用10X 物镜聚焦至清晰 ③ 视场光阑打至最小视场光阑 ④ 逐步下降聚光镜，使视场中出现清晰正多边形图像聚光镜升降旋钮 ⑤ 调节聚光镜中心调节旋钮，使正多边形移至视场中心聚光镜中心调节旋钮 ⑥ 逐步打开视场光阑，使正多边形与视场边缘内切视场光阑 ⑦ 稍加大视场光阑，使它的图象刚好与视场外切即可视场光阑

步骤涉及部件 I ” 载物台、标本夹 3、荧光观察方法步骤准备工作：高压汞灯对中（第一次观察时调整，以后观察时不需调整，除非更换汞灯）步骤涉及部件主开关拨到“I ” CD+或CD-钮

主开关拨到“I ” ND 片插槽 /孔径光阑准备工作：高压汞灯对中（第一次观察时调整，以后观察时不需调整，除非更换汞灯）调整完成后，请不要触动对中部件，如汞灯对中旋钮，视场光阑对中钮等。，待弧载物台

观察筒视场光阑中心调节钮第二部分使用IPP 拍摄图像流程 1. 在桌面点击以下图标打开IPP。 2. 在菜单栏中，（采集）Acquire 菜单下点击（视频/数字图像采集）Video/Digital Capture，或点击工具栏中，即出现控制CCD 拍照的对话框。

德国Zeiss激光扫描共聚焦显微镜快速操作手册

德国Zeiss 激光扫描共聚焦显微镜快速操作手册制作制作：：Zeiss 光学仪器光学仪器（（上海上海））国际贸易有限公司孙凯 2009年6月

目录目录：： 1 系统的组成系统组成及光路示意图实物照片实物照片说明说明 2 系统的使用 2.1 开机顺序 2.2 软件的软件的快速快速快速使用使用使用说明说明 2.3 显微镜显微镜的的触摸屏控制 2.4 关机顺序 3 系统的维护

1 系统的组成激光扫描共聚焦显微镜系统主要由激光扫描共聚焦显微镜系统主要由：：电动荧光显微镜电动荧光显微镜、、扫描检测单元扫描检测单元、、激光器激光器、、电脑工作站及各相关附件组成电脑工作站及各相关附件组成。。系统系统组成及光路组成及光路组成及光路示意图示意图示意图：：电脑工作站激光器扫描检测单元电动荧光显微镜

实物照片说明实物照片说明：：电动荧光显微镜扫描检测单元 CO 2培养系统控制器激光器电脑工作站

2 系统的使用 2.1 开机顺序（1）打开稳压电源打开稳压电源（（绿色按钮绿色按钮））等待2分钟（电压稳定）后，再开其它开关（2）主开关 [ MAIN SWITCH ]“ON ” 电脑系统 [ SYSTEMS/PC ]“ON ” 扫描硬件系统 [ COMPONENTS ]“ON ” （3）打开 [ 电动显微镜开关 ] 打开 [ 荧光灯开关 ] （注：具有5档光强调节旋钮）（4）Ar 离子激光器离子激光器主开关主开关 “ON ” 顺时针旋转钥匙至 “—” 预热预热等待约等待约15分钟分钟，，将激光器 [ 扳钮 ] 由“Standby ”扳至 “Laser run ”状态状态，，即可正常使用（5）打开 [ 电脑开关 ]，进入操作系统注：键盘上也具有 [ 电脑开关 ]

荧光显微镜使用方法和荧光显微镜操作规程

荧光显微镜使用方法和荧光显微镜操作规程荧光显微镜是中的一种。关键字：荧光显微镜使用方法荧光显微镜操作规程荧光显微镜使用使用方法和荧光显微镜操作规程 1. 用窗帘遮蔽光线，关闭房间内的灯光，除去显微镜的防尘罩，确保显微镜灯室通风良好、无遮盖。装上汞灯灯箱，并转动灯箱卡圈上的拨杆，将灯箱与镜臂连接。 2. 将汞灯灯箱的电源插头插入荧光电源箱后的插座，再将荧光电源箱的插头插入220V外接电源。 3. 打开电源开关，电压表显示出电源电压，如电源电压波动不大于额定电压值的±5%，即可按下启动开关点燃汞灯，如因天气太冷或电压不稳定等原因，一次启动未点燃汞灯，可以多揿动几次。待超高压汞灯弧光达到稳定状态并达到最大发光效率，即可开始工作。 4. 灯泡的调中：（1）任选一块标本放在载物台上. （2）转动镜臂上的聚光镜旋钮使聚光镜移出光路，转动滤色片组转换手轮，将紫光（Ｖ）或蓝光（Ｂ）或绿光（Ｇ）激发滤色片组转入光路，并将10×荧光物镜转入光路。

（3）调节粗微调手轮，将标本像调焦清晰。（4）前后推动垂直照明器右边的聚光镜调焦推杆，使视场光栏成像清晰，转动视场光栏拨杆将视场光栏收小，调节视场光栏调中螺钉使视场光栏居中，然后再将视场光栏开至最大。（5）转动镜臂上的聚光镜旋钮使聚光镜移入光路，前后调节灯箱上的聚光镜拨杆，使汞灯的弧光在视场内成像清晰。（6）调整灯箱上的灯泡水平调节螺钉和垂直调节螺钉，使汞灯的弧光居中。（7）调整反光镜水平调节螺钉和垂直调节螺钉，使光源的反射像与汞灯的弧光分开。（8）转动聚光镜旋钮把聚光镜移出光路，此时视场照明均匀。 5. 荧光观察：（1）将荧光染色标本放到载物台上。（2）将10×平场物镜或40×荧光物镜转入光路，调节载物台纵横移动手轮，将标本移入光路。（3）转动滤光片转换拨轮，将荧光染色标本所需要的激发滤光片组转入光路。激发滤光片组编号刻在滤片组转换拨轮上。滤光片选择正确与否，是荧光显微镜能否得到正确应用的关键。选用滤光片时，必须遵守斯托克斯定律：激发滤光片的透射波长＜双色束分离器的透射波长＜阻断滤光片的透射波长。由于激发滤光片、双色束分离器和阻断滤光片，出厂时已按其用途和本身的光学特性进行了严格的组合匹配，在观察和摄影时，只需选择滤光片组即可。（4）调节粗调手轮，当看清荧光图像轮廓后，再用微调手轮调焦，直至看到清晰的荧光图像。（5）当需要得到较强的荧光图像时，可转动聚光镜旋钮把聚光镜移入光路，可获得较明亮的荧光图像。

LeicaSP8激光扫描共聚焦显微镜快速操作手册2013-5-13

Leica激光扫描共聚焦显微镜快速操作手册制作：徕卡显微系统（上海）贸易有限公司 2013年3月

目录： 1 系统的组成系统组成 (3) 光路示意图 (4) 2 系统的使用 2.1 开机顺序 (5) 2.2 软件界面简介 (7) 2.3 在显微镜下观察样品 (8) 2.4 采集共聚焦图像 (9) 2.5 XYZ三维扫描（Z-Stack） (11) 2.6 时间序列扫描（Timeseries or xyt Scan） (15) 2.7 波长扫描（xyλScan） (16) 2.8 HyD检测器 (17) 2.9 图像的保存及输出 (18) 2.10 关机 (20) 3 系统的维护 (21)

Leica SP8 系统组成图

1可见波长激光或白激光15UVIS, HIVIS或VISIR的光路镀膜 2声光调制器（AOTF）16扫描视场旋转镜（Abbe-Konig 旋转）* 3红外激光（IR）* 17在NND位置上的反射光检测器（RLD）* 4电光调制器18物镜（可提供各种选择）* 5紫外激光* 19在NND位置上的透射光检测器（TLD）* 6 AOTF或直接调制器（DMOD）20正方型针孔 7STED 激光* 21Fluorifier盘* 8Setlight监控二极管22X1出口接口* 9AOBS, 及其他选配件23外置检测器* 10用于FRAP的光束增强镜* 24色散棱镜 11红外激光耦合25分开的荧光光谱 12与CS2紫外光路耦合的紫外激光26最多5个光电倍增管或4个HyD检测器 13STED激光耦合*选配组件 14全视野扫描镜及串行高速扫描镜选件

激光共聚焦显微镜

激光共聚焦显微镜 1．激光器： 1.1系统激光器覆盖可见光及紫外光： 1.1.1蓝光固体激光器488nm20mW； 1.1.2绿光固体激光器552nm20mW； 1.1.3红光固体激光器638nm，20mW 1.1.4紫外固体激光器405nm50mW； 1.2激光器的开闭和电压调节完全由软件控制，无需另设单根激光器的开关。并具有激光寿命保护装置。 1.3具有激光强度回馈稳定电路设计，在动态记录中激光强度不会受环境的影响而改变。 2．共聚焦扫描系统： 2.1激光扫描系统直接与共聚焦机身连接 2.2检测器数量 ①三个荧光扫描检测器+一个透射光DIC（明场/相差/微分干涉）扫描检测器； ②扫描检测器包括2个光电倍增管（PMT）和一个磷砷化镓混合型检测器HyD。*③可以升级为五个以上独立连续光谱荧光检测器。 2.3连续分光设计系统（或其它光谱分离系统） *①三个通道，一个透射光DIC通道；二个荧光通道均为可做连续全光谱检测的荧光通道； ②光谱型荧光通道可自由更换荧光通道检测的波长范围，二个荧光通道和一个透射光DIC通道可同时进行快速扫描； ③多通道荧光图像即时叠加、荧光图像与透射光DIC图像即时叠加，精确对光谱进行分析； ④荧光通道具有高精度的共聚焦针孔，具有宽波谱范围内的色差校正功能，保证在多重荧光标记的同时检测过程中每个通道扫描光切平面和厚度的一致性和荧光精确定位。 2.4光谱扫描功能 ①高速多通道光谱分析和扫描，可获得透射光谱图像； ②光谱分辨率2nm，可连续以1nm波长调节； ③光谱扫描范围：400-800nm；光谱扫描步进：1nm； ④高速棱镜分光，线性光谱拆分，可区分光谱大量重叠的染料； ⑤光谱数据来源：用户指定/用户自建/厂家预设（可调节）。 2.5扫描速度及速度调节 *①扫描视野22mm下扫描速度7幅/秒（512×512pixels）；70幅/秒（512×16pixels）； ②双向扫描速度3600线/秒；扫描速度可精确调节。 2.6共聚焦针孔1个，全自动调节型，孔径50-300微米，调节步进0.5微米。

激光扫描共聚焦显微镜的原理和应用

激光扫描共聚焦显微镜的原理和应用一、激光扫描共聚焦显微镜的原理传统的光学显微镜使用的是场光源，标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射或散射光的干扰；激光扫描共焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscope，LSCM)采用点光源照射样本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光点，该点被照射后发出的荧光被物镜搜集，并沿原照射光路回送到由双色镜构成的分光器。分光器将荧光直接送到探测器。光源和探测器前方都各有一个针孔，分别称为照明针孔和探测针孔。照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔，焦平面以外的点被挡在探测针孔之外不能成像，这样得到的共聚焦图像是标本的光学切面，避免了非焦平面上杂散光线的干扰，克服了普通显微镜图像模糊的缺点，因此能得到整个焦平面上清晰的共聚焦图像。原理图二、激光扫描共聚焦显微镜组成特点 LSCM由显微镜光学系统，激光光源，扫描装置和检测系统构成，整套仪器由计算机控制，各部件之间的操作切换都可在计算机操作平台界面中方便灵活地

进行。显微镜是LSCM的主要组件，它关系到系统的成像质量。通常有倒置和正置两种形式，前者在切片、活细胞检测等生物医学应用中使用更广泛。三、激光扫描共聚焦显微镜的应用（一）细胞的三维重建普通荧光显微镜分辨率低，显示的图像结构为多层面的图像叠加，结构不够清晰。LSCM能以0.1μm的步距沿轴向对细胞进行分层扫描，得到一组光学切片，经A/D转换后作为二维数组贮存。这些数组通过计算机进行不同的三维重建算法，可作单色或双色图像处理，组合成细胞真实的三维结构。旋转不同角度可观察各侧面的表面形态，也可从不同的断面观察细胞内部结构，测量细胞的长宽高、体积和断层面积等形态学参数。通过模拟荧光处理算法，可以产生在不同照明角度形成的阴影效果，突出立体感。通过角度旋转和细胞位置变化可产生三维动画效果。LSCM的三维重建广泛用于各类细胞骨架和形态学分析、染色体分析、细胞程序化死亡的观察、细胞内细胞质和细胞器的结构变化的分析和探测等方面。（二）静态结构检测 1.细胞原位检测核酸用于细胞核定位及其形态学观察、检测细胞内DNA的复制及断裂情况以及染色体定位观察。 2.原位检测蛋白质、抗体及其他分子原位检测蛋白质、抗体及其他分子免疫荧光标记技术检测荧光蛋白 3.检测细胞凋亡检测细胞凋亡不同时期细胞形态、细胞凋亡相关蛋白

荧光显微镜及其操作

荧光显微镜(Fluorescence microscope)及其操作某些物质经一定波长的光（如紫外光）照射后，物质中的分子被激活，吸收能量后跃迁至激发态；当其从激发态返回到基态时，所吸收的能量除部分转化为热量或用于光化学反应外，其余较大部分则以光能形式辐射出来，由于能量没能全以光的形式辐射出来，故所辐射出的光的波长比激发光的要长，这种波长长于激发光的可见光部就是荧光(fluorescence)。所谓荧光就是某些物质在一定波长光（如紫外光）的照射下、在极短时间内所发出的比照射光波长更长的可见光。由此可见，被照射物质产生荧光必须具备以下两个条件：①物质分子（或所特异性结合的荧光染料）必须具有可吸收能量的生色团；②该物质还必须具有一定的量子产率和适宜的环境（如溶剂、pH、温度等）。荧光显微术是利用荧光显微镜结可发荧光的物质进行观测的一种实验技术。某些物质在一定短波长的光(如紫外光)的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时, 就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光(如见光)，这种光就称为荧光。有些生物体内的物质受激发光照射后可直接产生荧光, 称为自发荧光(或直接荧光)，如叶绿素的火红色荧光和木质素的黄色荧光等。有的生物材料本身不能产生荧光，但它吸收荧光染料后同样却能发出荧光，这种荧光称为次生荧光(或间接荧光)，如叶绿体吸附吖啶橙后便可发出桔红色荧光。荧光显微镜具特殊光源（多为紫外光光源），提供足够强度和波长的激发光，诱发荧光物质发出荧光。在视场中所所观察到的图像，主要是样品的荧光映像。（一）光源现在多采用200W的超高压汞灯作光源，它是用石英玻璃制作，中间呈球形，内充一定数量的汞，工作时由两个电极间放电，引起水银蒸发，球内气压迅速升高，当水银完全蒸发时，可达50～70个标准大气压力，这一过程一般约需5～15min。超高压汞灯的发光是电极间放电使水银分子不断解离和还原过程中发射光量子的结果。它发射很强的紫外和蓝紫光，足以激发各类荧光物质，因此，为荧光显微镜普遍采用。超高压汞灯也散发大量热能。因此，灯室必须有良好的散热条件，工作环境温度不宜太高。新型超高压汞灯在使用初期不需高电压即可引燃，使用一些时间后，则需要高压启动（约为15000V），启动后，维持工作电压一般为50～60V，工作电流约4A左右。200W超高压汞灯的平均寿命，在每次使用2h 的情况下约为200h，开动一次工作时间愈短，则寿命愈短，如开一次只工作20min，则寿命降低50%。因此，使用时尽量减少启动次数。灯泡在使用过程中，其光效是逐渐降低的。灯熄灭后要等待冷却才能重新启动。点燃灯泡后不可立即关闭，以免水银蒸发不完全而损坏电极，一般需要等15min。由于超高压汞灯压力很高，紫外线强烈，因此灯泡必须置灯室中方可点燃，以免伤害眼睛和发生爆炸时造成操作。超高压汞灯（100W或200W）光源的电路和包括变压、镇流、启动几个部分。在灯室上有调节灯泡发光中心的系统，灯泡球部后面安装有镀铝的凹面反射镜，前面安装有集光透镜。国产超高压汞灯GCQ-200型性能良好，可以代替HBO-200等型的进口灯泡，平均寿命在200h以上，价格也比较低。我国研制的一种简易轻便型高色温溴钨荧光光源装置，体积小，重量轻，功率小，交、直流两用（自带直流电源），易于携带，使用方便，已推广应用。

激光扫描共聚焦显微镜的原理和应用-17954讲解

激光扫描共聚焦显微镜的原理和应用 Tina(2007-10-23 09:40:17 一、激光扫描共聚焦显微镜的原理传统的光学显微镜使用的是场光源，标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射或散射光的干扰；激光扫描共焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscope，LSCM采用点光源照射样本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光点，该点被照射后发出的荧光被物镜搜集，并沿原照射光路回送到由双色镜构成的分光器。分光器将荧光直接送到探测器。光源和探测器前方都各有一个针孔，分别称为照明针孔和探测针孔。照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔，焦平面以外的点被挡在探测针孔之外不能成像，这样得到的共聚焦图像是标本的光学切面，避免了非焦平面上杂散光线的干扰，克服了普通显微镜图像模糊的缺点，因此能得到整个焦平面上清晰的共聚焦图像。原理图

二、激光扫描共聚焦显微镜组成特点 LSCM由显微镜光学系统，激光光源，扫描装置和检测系统构成，整套仪器由计算机控制，各部件之间的操作切换都可在计算机操作平台界面中方便灵活地进行。显微镜是LSCM的主要组件，它关系到系统的成像质量。通常有倒置和正置两种形式，前者在切片、活细胞检测等生物医学应用中使用更广泛。三、激光扫描共聚焦显微镜的应用一）细胞的三维重建

普通荧光显微镜分辨率低，显示的图像结构为多层面的图像叠加，结构不够清晰。LSCM 能以0.1μm的步距沿轴向对细胞进行分层扫描，得到一组光学切片，经A/D转换后作为二维数组贮存。这些数组通过计算机进行不同的三维重建算法，可作单色或双色图像处理，组合成细胞真实的三维结构。旋转不同角度可观察各侧面的表面形态，也可从不同的断面观察细胞内部结构，测量细胞的长宽高、体积和断层面积等形态学参数。通过模拟荧光处理算法，可以产生在不同照明角度形成的阴影效果，突出立体感。通过角度旋转和细胞位置变化可产生三维动画效果。LSCM 的三维重建广泛用于各类细胞骨架和形态学分析、染色体分析、细胞程序化死亡的观察、细胞内细胞质和细胞器的结构变化的分析和探测等方面。二）静态结构检测：原位鉴定细胞或组织内生物大分子、观察细胞及亚细胞形态结构 1.细胞原位检测核酸用于细胞核定位及其形态学观察、检测细胞内DNA的复制及断裂情况以及染色体定位观察。 2.原位检测蛋白质、抗体及其他分子原位检测蛋白质、抗体及其他分子免疫荧光标记技术检测荧光蛋白 3.检测细胞凋亡

激光共聚焦显微镜操作规程

激光共聚焦显微镜操作规程一、准备工作 a)打开计算机。依次打开激光器电源、钥匙开关。多线氩离子(458 nm, 488 nm, 514 nm) ON、氦氖绿(543 nm) ON、氦氖红(633 nm) ON。打开汞灯电源开关。 b)登陆Windows XP系统。双击快捷方式：FV10-ASW 1.1。User ID: Administrator ; Passeword: Administrator。注意区分大小写。二、显微镜镜下观察１.微分干涉差观察 a)使用手控面板选择物镜。插入起偏镜。插入微分干涉滑块。 b)点击FV10-ASW软件中的图标。标本聚焦. ２.荧光观察： c)使用手控面板选择物镜。 d)打开汞灯的机械快门，拉出DIC滑块，点击FV10-ASW软件中的图标 e)使用手控面板选择荧光滤色片。标本聚焦。３.获取单张荧光图像 a)点击FV10-ASW软件中的按钮。 b)关闭汞灯快门，点击按钮，关闭卤素灯快门。 c)点击染料选择按钮，在染料列表中，双击用于观察的荧光染料。点击Apply按钮。 d)点击XY Repeat按钮开始扫描。调节图像。点击Stop按钮停止扫描。 e)选择AutoHV,，并选择扫描速度。 f)点击XY按钮取得一幅图像。 g)点击SeriesDone按钮，“2D View-LiveImage(x)”2D界面就出现。 h)保存该幅图像:右图像管理器中显示的图像图标，选择另存为保存该幅图像。(保存为“xml”类型是击FV10-ASW 软件专用的图像格式。) ４.获得单张（荧光+微分干涉）图像 a)点击FV10-ASW软件中的按钮，关闭汞灯快门。点击按钮，关闭卤素灯快门。 b)点击染料选择按钮，在染料列表中，双击用于观察的荧光染料。点击Apply按钮。 c)选择TD1。 d)点击XY Repeat按钮开始扫描。调节绿色(FITC)图像和微分干涉差的图像。点击Stop按钮停止扫描。 e)选择AutoHV, 并选择扫描速度。 f)点击XY按钮取得一幅图像。 g)点击SeriesDone按钮, “2D View-LiveImage(x)”2D界面就出现。 h)保存该幅图像。５.获取3D图像例: 绿色荧光(FITC)和红色荧光(Rhodamine)双标（这里介绍线序列扫描取图的过程.）

激光共聚焦显微镜技术1讲解

激光共聚焦显微镜技术 The techniques and applications of Confocal Laser Scanning Microscopy 激光共聚焦显微镜(LSCM)的发展简史 1957年，Marvin Minsky提出了共聚焦显微镜技术的某些基本原理，获得了美国的专利。1978年，阿姆斯特丹大学的G.J.Brakenhoff首次展示了改善了分辨率的共焦显微镜。 1985年，Wijnaendtsvan Resandt推出了第一台对荧光标记的材料进行光切的共焦显微镜激光共聚焦显微镜(LSCM)的发展简史 ?80年代末，各家公司都推出了商品化的共焦显微镜,英国的Bio-Rad公司的MRC系列，德国Leica公司的TCS系列，Zeiss公司的LSM系列等。 ?近二十年来，从滤片型到光谱型，人们对共焦高分辨率，采集图像快速，技术的改进及应用开发不断进行，出现了很多新的技术。如双光子，FCS,FLIM ,STED等。共焦显微镜的优点人眼分辨率：0.2mm 光学显微镜分辨率：0.25μm 电子显微镜分辨率：0.2nm 共焦显微镜分辨率：μm 共焦显微镜的优点 ?电子显微镜的缺陷： 1.只能观察固定样品 2.样品制备过程（固定、包埋、切片）造成的假象 ?荧光显微镜的缺陷: 1.可以观察活细胞或组织，但细胞或组织内结构高度重叠。 2.荧光具有强散射性，造成图像实际清晰度的大大下降。 3.荧光漂白很快，使荧光图像的拍照有困难。 4.如果荧光滤片选配不当，多荧光标记样品图像的采集很困难，且很难抑制光谱交叉。共焦显微镜的优点 ?共焦显微镜与传统显微镜的区别 1.抑制图像的模糊，获得清晰的图像激光扫描共焦显微镜技术 ?共焦显微镜与传统显微镜的区别

激光共聚焦显微镜在材料领域应用的初探

激光共聚焦显微镜在材料领域应用初探夏仲琦，周向群(2010-07-02 18:35:09) 一、前言作为一种微观形态学工具，光学显微镜在工业测试方面的应用，目前主要大家比较熟悉的主要是以下方面：首先，单独作为形态学工具，进行材料组织分析和外观缺陷检查，其典型的产品是金相显微镜和立体显微镜。第二、光栅量测结合，进行部件的精密尺寸测量，其典型的产品是工具显微镜，测量显微镜。近年来，随着计算机软件技术的发展，显微镜与图象处理系统的结合，产生了定量金相软件、工显测量软件、一般几何测量软件等等，使其不仅可以定性分析，更能在定量化上发挥重大作用。但光学显微镜的局限在于，它是一种二维的形态学工具，其极限有效分辨率是0.35微米，该分辨率下的景深在1微米以下。因此如果要在高倍率下观察表面的三维形态，特别是纵向方向的形态，通常一定需要使用SEM而不是OM。SEM是这一方面非常成熟有效的标准工具，但有些样品使用SEM会碰到以下困难： 1、样品本身比较大，且不能做分割的器件组，虽然被观察的部分是微小的局部，但整个样品难以放入SEM中。 2、非金属样品，且不适合做导电性处理。特别是一些对微小处理很敏感的样品。 3、无法测量多种尺寸数据，比如体积，面积，粗糙度等等。针对这些问题，SEM厂家在不断推出更新的技术。同时，光学显微镜开发者也在探索如何使光学显微镜成为一种三维的微观形态学工具。这方面目前比较有成效的技术，是激光扫描共焦显微镜（CF-LSM）。共聚焦激光扫描显微镜的发展在国外，主要为日本。是从80年代末期开始的，目前在日本，共聚焦激光扫描显微镜已经是一种被广泛采用的技术，既用来观察样品表面亚微米程度（0.12微米）的三维形态和形貌，又可以测量多种微小的尺寸，诸如体积、面积、晶粒、膜厚、深度、长宽、线粗糙度、面粗糙度等等。另外，它还有以下特点： 1、使用方便,与一般光学相似,且全部采用计算机直观控制。 2、基本无须制样,不损伤样品。不需要做导电处理,也容许大尺寸样品直接观察,完全不破坏样品。 3、几十秒到一两分钟即完成全部的扫描，成像，测量采样工作。该设备目前已经为吉林大学，哈尔滨工业大学用于材料和机械加工方面的研究。

荧光显微镜使用说明及注意事项

荧光显微镜使用说明及注意事项（1）严格按照荧光显微镜厂家说明书要求进行操作，不要随意改变程序。（2）观察对象必须是可自发荧光或已被荧光染料染色的标本。（3）应在暗室中进行检查。进入暗室后，接上电源，点燃超高压汞灯5～15min，待光源发出强光稳定后，眼睛完全适应暗室，再开始观察标本。（4）载玻片、盖玻片及镜油应不含自发荧光杂质，载玻片的厚度应在0.8～1.2mm之间，太厚可吸收较多的光，并且不能使激发光在标本平面上聚焦。载玻片必须光洁，厚度均匀，无油渍或划痕。盖玻片厚度应在0.17mm左右。（5）防止紫外线对眼睛的损害，在调整光源时应戴上防护眼镜。（6）选用效果最好的滤光片组。（7）检查时间每次以1～2h为宜，超过90min，超高压汞灯发光强度逐渐下降，荧光减弱；标本受紫外线照射3～5min后，荧光也明显减弱；所以，最多不得超过2～3h。（8）荧光标本一般不能长久保存，若持续长时间照射（尤其是紫外线）易很快褪色。因此，如有条件则应先照相存档，再仔细观察标本。（9）荧光显微镜光源寿命有限，启动高压汞灯后，不得在15min内将其关闭，一经关闭，必须待汞灯冷却后方可再开启。严禁频繁开闭，否则，会大大降低汞灯的寿命。标本应集中检查，以节省时间，保护光源。天热时，应加电扇散热降温，新换灯泡应从开始就记录使用时间。灯熄灭后欲再用时，须待灯泡充分冷却后才能点燃。一天中应避免数次点燃光源。（10）标本染色后立即观察，因时间久了荧光会逐渐减弱。若将标本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延缓荧光减弱时间，防止封裱剂蒸发。（11）若暂不观察标本时，可拉过阻光光帘阻挡光线。这样，既可避免对标本不必要的长时间照射，又减少了开闭汞灯的频率和次数。（12）荧光亮度的判断标准：一般分为四级，即“一”—无或可见微弱荧光。“+”—仅能见明确可见的荧光。“++”—可见有明亮的荧光。“+++”—可见耀眼的荧光。（13）较长时间观察荧光标本时，一定要戴能阻挡紫外光的护目镜，加强对眼睛的保护。在未加入阻断滤光片前不要用眼直接观察，否则会损伤眼睛。 (14) 激发光长时间的照射，会发生荧光的衰减和淬灭现象，因此尽可能缩短观察时间，暂时不观察时，应用挡板遮盖激发光。 (15) 作油镜观察时，应用“无荧光油”。 (16) 荧光几乎都较弱，应在较暗的室内进行。

激光扫描共聚焦显微镜及其应用讲解

激光扫描共聚焦显微镜及其应用激光扫描共聚焦显微镜（Laserscanningconfocalmicroscope,LSCM)是近代最先进的细胞生物医学分析仪器之一。它是在荧光显微镜成像的基础上加装激光扫描装置，使用紫外光或可见光激光荧光探针，利用计算机进行图像处理，不仅可观察固定的细胞、组织切片，还可对活细胞的结构、分子、离子进行实时动态地观察和检测。目前，激光扫描共聚焦显微技术已用于细胞形态定位、立体结构重组、动态变化过程等研究，并提供定量荧光测定、定量图像激光扫描共聚焦显微镜（Laser scanning confocal microscope, LSCM)是近代最先进的细胞生物医学分析仪器之一。它是在荧光显微镜成像的基础上加装激光扫描装置，使用紫外光或可见光激光荧光探针，利用计算机进行图像处理，不仅可观察固定的细胞、组织切片，还可对活细胞的结构、分子、离子进行实时动态地观察和检测。目前，激光扫描共聚焦显微技术已用于细胞形态定位、立体结构重组、动态变化过程等研究，并提供定量荧光测定、定量图像分析等实用研究手段，结合其他相关生物技术，在形态学、生理学、免疫学、遗传学等分子细胞生物学领域得到广泛应用。激光共聚焦显微镜的原理激光扫描共聚焦显微镜是采用激光作为光源，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦原理和装置，并利用计算机对所观察的对象进行数字图象处理的一套观察、分析和输出系统。主要系统包括激光光源、自动显微镜、扫描模块（包括共聚焦光路通道和针孔、扫描镜、检测器）、数字信号处理器、计算机以及图象输出设备（显示器、彩色打印机）等。通过激光扫描共聚焦显微镜，可以对观察样品进行断层扫描和成像。因此，可以无损伤的观察和分析细胞的三维空间结构。同时，通过激光扫描共聚焦显微镜也是活细胞的动态观察、多重免疫荧光标记和离子荧光标记观察的有力工具。主要功能 1、图像处理功能 2、细胞生物学功能应用范围：（1）定量荧光测定；（2）定量共焦图像分析；（3）光学切片及三维重组；（4）动态观察；（5）荧光漂白恢复研究；（6）质膜流动性研究；（7）蛋白质相互作用研究；（8）激光显微外科及“光陷阱”研究；（9）光活化技术研究。（编辑：文静）