激光共聚焦显微镜系统的原理和应用讲解
简述激光共聚焦显微镜的工作原理
简述激光共聚焦显微镜的工作原理激光共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope，简称LSCM）是一种高分辨率的显微镜，它具有优异的成像能力和深度探测能力。
它的工作原理基于激光光源和共聚焦技术，可以对样品进行非破坏性的三维成像和表面拓扑分析。
本文将简要介绍激光共聚焦显微镜的工作原理。
1. 激光光源激光共聚焦显微镜使用一束强度稳定、单色、相干性好的激光光源。
常用的激光光源包括氩离子激光器、氦氖激光器和二极管激光器等。
激光光源通过准直器和聚焦镜系统聚焦成一束准直的、直径极小的激光光斑。
2. 共聚焦技术激光共聚焦显微镜采用共聚焦技术，即通过聚焦光斑和探测光斑的重叠来实现高分辨率成像。
聚焦光斑从样品的一个点与探测光斑重叠之后，仅有从这个点散射回来的光能够通过探测光斑，其他来自样品其他区域的光则被阻隔掉。
这样可以消除样品其他区域的散射光对图像质量的影响。
3. 共焦平面激光共聚焦显微镜通过调节聚焦镜的位置，可以获得不同深度的共焦平面。
共焦平面是指光路中聚焦光斑和探测光斑达到最小的位置。
在共焦平面之上和之下，成像出的图像将会出现模糊和散焦现象。
调节聚焦镜的位置，可以实现在样品不同深度层面进行三维成像。
4. 探测和成像聚焦光斑扫描样品上的一个区域，样品上的荧光探针或反射光信号通过物镜收集到探测器上。
激光共聚焦显微镜常用荧光探针来标记样品的特定结构或分子，使其发出荧光信号，进而获得一幅高对比度的荧光图像。
探测器接收到的信号经过放大、滤波和转换等处理后，最终形成图像。
5. 高分辨率成像激光共聚焦显微镜具有高分辨率的成像能力。
其分辨率可以达到光学显微镜的两倍，约为200纳米级别。
激光光源的单色性和相干性，以及共聚焦技术的应用，使得激光共聚焦显微镜能够获得更清晰、更准确的显微图像。
总结起来，激光共聚焦显微镜利用激光光源以及共聚焦技术，能够实现高分辨率的三维显微成像。
通过调节聚焦镜的位置，可以获得不同深度层面的图像，更好地观察样品的内部结构。
激光扫描共聚焦显微镜
1、 选择好适宜的荧光探针。 原则上讲,无论是荧光素还是荧光标记抗体均 可用于LSCM 。如果打算用2种以上荧光标记物,要 注意它们是否激发光波长及发射光波长能区别开， 还要注意是否与LSCM的激发器相匹配，要根据现有 的激发波长来选择荧光标记物。
• 不同的荧光探针在不同标本的效果常有差异，故除综合 考虑以上因素以外，有条件者应进行染料的筛选，以找 出最适的荧光探针。
6.观察活细胞、活组织：ＬＳＣＭ在不损伤
细胞的前提下，对活组织、活细胞进行观 察和测量，这不仅省去了繁琐的样品前期 处理过程(如脱水、脱蜡、染色等);而且观 察过的样品还可以继续用于其他的研究。 这种功能对于细胞培养、转基因研究尤为 重要。这可以说是ＬＳＣＭ最大的优势。
7. 生化成分精确定位观察配合专用的分子探 针，对于要检测的成分不仅可以定位到细 胞水平，还可以定位到亚细胞水平和分子 水平。
2015/6/12
激光扫描共聚焦显微镜：以激光作为激发光源，采用 光源针孔与检测针孔共轭聚焦技术，对样本进行断层扫 描，以获得高分辨率光学切片的荧光显微镜系统.
形态学研究：组织细胞 标本的抗原免疫荧光检 测，凋亡检测…
目的结构是用荧光探针标记的， 都可以用激光共聚焦显微镜观察
分子生物学：荧光原位杂交对DNA 和RNA定量，外源基因在真核细胞 的表达及定位，蛋白质相互作用 (FRET)…
4. 采 用点扫描技术将样品分成无数个点，用十分细小的激光 束逐点逐行扫描成像，再通过电脑组合成一个整体。传统的 光镜在场光源下一次成像，标本上每一点都会受到相邻点的 衍射光和散射光的干扰。这两种图像的清晰度和精密度是无 法相比的。
5.光电倍增管：检测设定范围内的光信号，并将光信号转换成 电 信号，相当于相机中的CCD或胶卷。 PMT只能检测到信号的强弱，不能记录信号的颜色，记录 的 结果通过信号强度和填充颜色表示。PMT单位用电压值V 表示，数值越大代表信号倍增越大，提高倍增会同时增加图 像的正常信号强度和噪声信号强度，使图像的信噪比下降。
简述激光共聚焦显微镜的工作原理
简述激光共聚焦显微镜的工作原理
激光共聚焦显微镜是一种高分辨率显微镜，它利用激光束的聚焦作用和荧光探针的发光特性，可以在细胞和组织水平上观察生物分子的动态过程。
下面我们来详细了解一下激光共聚焦显微镜的工作原理。
激光共聚焦显微镜的工作原理基于激光束的聚焦作用。
激光束通过透镜系统聚焦到样品表面上，形成一个非常小的光点。
这个光点的大小和形状可以通过调整透镜系统的参数来控制。
当激光束聚焦到样品表面上时，样品中的荧光探针会被激发发出荧光信号。
这个荧光信号会被激光束收集并聚焦到探测器上，形成一幅荧光图像。
激光共聚焦显微镜的另一个重要特点是它的光学切片能力。
由于激光束的聚焦作用，激光共聚焦显微镜可以在样品内部形成一个非常小的光点，这个光点可以在样品内部移动，形成一系列的荧光图像。
通过这些荧光图像，我们可以重建出样品内部的三维结构，实现光学切片的效果。
激光共聚焦显微镜的工作原理还包括荧光探针的选择和激发波长的选择。
不同的荧光探针有不同的发光特性，可以用来标记不同的生物分子。
激发波长的选择也非常重要，不同的荧光探针有不同的激发波长，选择合适的激发波长可以提高荧光信号的强度和分辨率。
激光共聚焦显微镜是一种高分辨率显微镜，它利用激光束的聚焦作
用和荧光探针的发光特性，可以在细胞和组织水平上观察生物分子的动态过程。
它的工作原理包括激光束的聚焦作用、荧光探针的选择和激发波长的选择等。
通过激光共聚焦显微镜，我们可以更加深入地了解生物分子的结构和功能，为生命科学研究提供有力的工具。
激光共聚焦显微镜原理
LSCM的优越性
动态连续扫描及三维图像重组 LSCM可以对对活细胞和
组织或细胞切片样品的不同层面进行连续逐层扫描, 来获得各个 层面的图像，即所谓的“无损伤的光学切片”。激光扫描共聚 焦显微镜扫描的每个层面之间的间距可以达到0.1um甚至更小。 获得的图像通过计算机重组，可获得精细的细胞骨架、染色体、 细胞器和细胞膜系统的三维图像。与普通光学显微镜获得的图 像相比，LSCM所得 到的重组三维图像清晰度高、立体感强, 可通过计算机软件对细胞内所研究的结构进行各种测量，对细 胞内的空间结构和某些物质在细胞内的定位方面的研究中有广 泛的应用。
发展历史
1957年，Malwin Minsky在其专利中首次阐明了激光共聚焦显微镜技 术的基本工作原理， 1967年，Egger第一次成功能共聚焦显微镜产生了一个光学横断面， 1970年，Sheppard和Wilson 推出第一台单光束共聚集激光扫描显微 镜 1987年，White 和Amos在Nature杂志发表了“Confocal microscopy come of age”,标志着LSCM已成为科学研究的重要工具。
普通荧光显微镜和激光共聚焦显微镜图像的差别
激光共聚焦显微镜的基本原理
利用放置在光源后的照明针孔 (P1)和放置在检测器前的探测针 孔(P2)实现点照明和点探测；激 光经过照明针孔形成点光源， 由物镜聚焦在样品焦面的某个 点上，只有该点所发射 的荧光 成像在探测针孔上，该点以外 的任何发射光线被探测器阻挡， 不能到达PMT探测器，从而提 高了成像效果。照明针孔和探 测针孔 共焦，共焦点为被探测 点，被探测点所在的平面为共 焦平面。
计算机系统
数据采集、处理、转换、应用软件
共焦显微镜技术原理、参数及其应用
一、共焦显微镜技术原理共焦显微镜是一种基于激光光源和透镜系统的高分辨率显微镜，它可以在不破坏样品的情况下获得清晰的三维成像。
其原理可以简单概括为通过激光束或者其他聚焦光源在样品上照射，然后通过物镜将样品上的光信号聚焦到探测器上，形成清晰的成像。
这种成像方式可以减少背景干扰，提高成像的清晰度和分辨率。
二、共焦显微镜技术参数1. 分辨率：共焦显微镜的分辨率一般在几十纳米到几百纳米之间，取决于光源的波长和物镜的数值孔径。
2. 放大倍数：共焦显微镜的放大倍数通常在50倍到1000倍之间，不同的放大倍数适用于不同尺寸的样品。
3. 成像速度：共焦显微镜的成像速度很快，可以实现实时成像，适用于观察快速变化的生物过程或其他动态现象。
4. 深度分辨：共焦显微镜也具有较好的深度分辨能力，可以在样品内部获得准确的三维结构信息。
5. 光源选择：共焦显微镜的光源一般采用激光光源，常见的有激光二极管、激光器等，其波长和功率对成像效果有着重要的影响。
三、共焦显微镜技术应用共焦显微镜技术在生物医学、纳米材料、材料科学等领域有着广泛的应用。
1. 生物医学领域：共焦显微镜可以观察生物细胞的形态、亚细胞结构和动态变化，对于病理学研究、细胞生物学研究等有着重要的意义。
2. 纳米材料研究：共焦显微镜可以观察纳米颗粒的形貌、大小分布和表面性质，对于纳米材料的合成和应用研究起着重要作用。
3. 材料科学：共焦显微镜可以观察材料结构的微观表面形貌和内部结构，对于材料的力学性能、热学性能等提供详细的信息。
4. 化学生物学：共焦显微镜可以观察分子水平的化学反应过程，对于研究生物大分子的结构和功能具有重要的意义。
共焦显微镜技术以其高分辨率、实时成像和三维观察能力，被广泛应用于生物医学、纳米材料、材料科学和化学生物学等领域，为科学研究和工程技术提供了重要的手段和方法。
随着科技的不断进步，相信共焦显微镜技术在更多领域会发挥更大的作用，为人类的发展和进步做出更大的贡献。
激光扫描共聚焦显微镜
分辨率高
免疫荧光标记技术
• 免疫荧光技术是将抗体（或抗原）标记上荧光素（例如 FITC )，它与细胞或组织内相应抗原（或抗体）结合后， 通过观察、检测特征的荧光，定性、定位及定量地检测样 品中的抗体。免疫荧光技术的优点是其具有免疫反应的特 异性，又结合了荧光检测的敏感性
•注：动态监测过程需要连续采集一个固定视野的图像，因此 在离子测定时要求细胞贴壁牢固，监测期间不发生移位现象， 否则，不易的到好的定量结果。
常见的应用和方法
用激光扫描共聚焦显微镜在细胞原位检测核酸 激光扫描共聚焦显微术通过成像显示出细胞内核酸的
分布特征及含量，即实现定位，定性及定量检测 核酸 常用：细胞核定位及形态学观察 染色体观察等 前提：需将核酸用荧光探针标记 常用荧光探针： Hoechst33342 Hoechst33258 DAPI 等
激光扫描 共聚焦显微镜
简介
• 激光扫描共聚焦显微镜是二十世纪80年代发展起 来的一项具有划时代意义的高科技新产品，它是 在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置， 利用计算机进行图像处理，把光学成像的分辨率 提高了30%~40%，使用紫外或可见激光激发荧光 探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光 图像，在亚细胞水平上观察诸如Ca 2+ 、pH值， 膜电位等生理信号及细胞形态的变化，成为形态 学，分子生物学，神经科学，药理学，遗传学等 领域中新一代强有力的研究工具，是目前生物医 学领域中最先进的荧光成像和细胞分析手段之一。
• 另一方面，样品也会受到同一焦平面上的 临近区域所激发荧光的干扰，使得图象对 比度降低，这被称为侧向（XY）干扰
激光共聚焦技术讲解
模块九激光共聚焦技术1. 实验目的让学生了解激光共聚焦显微镜硬件组成，掌握激光共聚焦显微镜常用的基本操作及注意事项，能够熟练、准确地设计光路，重点掌握激光共聚焦显微镜测定细胞荧光信号动态变化的方法以及钙指示剂（fluo-3/AM ）标记Ca2＋的基本原理与方法，了解激光共聚焦显微镜在生物学上的应用。
2. 实验原理激光扫描共聚焦显微镜是采用激光为光源，在传统荧光显微镜成像的基础上，附加了激光扫描装置和共轭聚焦装置，通过计算机控制来进行数字化图像采集和处理的系统。
激光扫描共聚焦显微镜系统主要包括扫描模块、激光光源、荧光显微镜、数字信号处理器、计算机以及图像输出设备等。
激光扫描共聚焦显微镜基本结构（1）扫描模块扫描模块主要由针孔光栏（控制光学切片的厚度）、分光镜（按波长改变光线传播方向）、发射荧光分色器（选择一定波长范围的光进行检测）、检测器（光电倍增管）组成。
荧光样品中的混合荧光进入扫描器，经过检测针孔光栏、分光镜和分色器选择后，被分成各单色荧光，分别在不同的荧光通道进行检测并形成相应的共焦图象，同时在计算机屏幕上可以显示几个并列的单色荧光图象及其合成图象。
（2）荧光显微镜系统激光扫描共聚焦显微镜所用的荧光显微镜大体与常规荧光显微镜相同，但又有其特点：需与扫描器连接，使激光能进入显微镜物镜照射样品，并使样品发射的荧光到达检测器；需有光路转换装置，即汞灯与激光转换，同时汞灯光线强度可调。
（3）常用激光器激光扫描共聚焦显微镜使用的激光光源有单激光和多激光系统，常用的激光器包括以下三种类型：多谱线Ar 离子激光器（氩离子激光器）：发射波长为458 nm、477 nm、488 nm、514 nm 的蓝绿光；He-Ne 激光器（氦氖激光器）：发射波长为543 nm的绿光和633 nm的红光；UV激光器（紫外激光器）：发射波长为351 nm、364 nm 的紫外光。
（4 ）辅助设备风冷、水冷冷却系统及稳压电源。
激光共聚焦作用
激光共聚焦作用激光共聚焦（laser scanning confocal microscopy）是一种高分辨率、高对比度的三维成像技术，利用激光的高能量和聚焦的特性，使显微镜成像更加清晰、详细。
这种技术能够消除掉沿深度方向的部分遮挡效应，得到三维图像，因此被广泛应用于生物学、医学和材料科学领域，在生物医学诊断、组织学和细胞学的研究中具有重要作用。
激光共聚焦显微镜的成像原理基于激光的共聚焦效应。
其主要包括两个重要步骤：聚焦和扫描。
聚焦是指将激光束聚焦到一个点，激发样品中的荧光发射。
扫描是指对样品的感兴趣的区域进行点扫描，再将所得信号进行处理，通过计算机系统得到高质量的图像。
激光共聚焦显微镜的探针有两个重要部分：一个是激光，另一个是探测器。
激光是共聚焦显微镜的核心，应用于激发样品的荧光发射。
激光束经过透镜，聚焦到样品表面。
探测器由迪特克森分光镜和探测器组成。
迪特克森分光镜接收发射光，分离出荧光、激光和散射光，再使荧光物质的发射光传递到探测器上，最后由计算机处理成图像。
激光共聚焦显微镜的应用范围十分广泛，如生物学、医学、材料科学等领域。
在生物学中，比较常见的应用是真实有机体的3D成像，如神经元、组织样品等。
同时，激光共聚焦显微镜还可以用于荧光共振能量转移（FRET）的应用，通过荧光物质之间的谷间距的变化，以计算特定事件的生物化学反应的速率和强度。
在医学领域，激光共聚焦显微镜可以用于细胞和组织的成像，用于临床诊断和治疗，如腺体组织、肝脏组织等。
在材料科学领域，激光共聚焦显微镜同样具有广泛的应用，可用于纳米结构、材料缺陷等的分析。
总之，激光共聚焦显微镜利用激光的高能量和聚焦特性，具有高分辨率、高对比度的显微成像优势，在生物学、医学和材料科学领域具有广泛的应用。
在生物医学中，可以用于组织学和细胞学的研究，在材料科学中可以用于分析材料的纳米结构和缺陷。
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激光共聚焦显微镜系统的原理和应用
激光扫描共聚焦显微镜是二十世纪80年代发展起来的一项具有划时代的高科技产品，它是
在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置，利用计算机进行图像处理，把光学成像的分
辨率提高了30%--40%，使用紫外或可见光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结
构的荧光图像，在亚细胞水平上观察诸如Ca2+ 、PH值，膜电位等生理信号及细胞形态的
变化，成为形态学，分子生物学，神经科学，药理学，遗传学等领域中新一代强有力的研究
工具。激光共聚焦成像系统能够用于观察各种染色、非染色和荧光标记的组织和细胞等，观
察研究组织切片，细胞活体的生长发育特征，研究测定细胞内物质运输和能量转换。能够进
行活体细胞中离子和PH值变化研究（RATIO），神经递质研究，微分干涉及荧光的断层扫
描，多重荧光的断层扫描及重叠，荧光光谱分析荧光各项指标定量分析荧光样品的时间延迟
扫描及动态构件组织与细胞的三维动态结构构件，荧光共振能量的转移的分析，荧光原位杂
交研究（FISH），细胞骨架研究，基因定位研究，原位实时PCR产物分析，荧光漂白恢复
研究（FRAP），胞间通讯研究，蛋白质间研究，膜电位与膜流动性等研究，完成图像分析
和三维重建等分析。
一.激光共聚焦显微镜系统应用领域：
涉及医学、动植物科研、生物化学、细菌学、细胞生物学、组织胚胎、食品科学、遗传、药
理、生理、光学、病理、植物学、神经科学、海洋生物学、材料学、电子科学、力学、石油
地质学、矿产学。
二.基本原理
传统的光学显微镜使用的是场光源，标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射或散射光的
干扰；激光扫描共聚焦显微镜利用激光束经照明针孔形成点光源对标本内焦平面的每一点扫
描，标本上的被照射点，在探测针孔处成像，由探测针孔后的光点倍增管（PMT）或冷电
耦器件（cCCD）逐点或逐线接收，迅速在计算机监视器屏幕上形成荧光图像。照明针孔与
探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔，焦平
面以外的点不会在探测针孔处成像，这样得到的共聚焦图像是标本的光学横断面，克服了普
通显微镜图像模糊的缺点。
三.应用范围：
细胞形态学分析（观察细胞或组织内部微细结构，如：细胞内线粒体、内质网、高尔基体、
微管、微丝、细胞桥、染色体等亚细胞结构的形态特征；半定量免疫荧光分析）；荧光原位
杂交研究；基因定位研究及三维重建分析。
1.细胞生物学：细胞结构、细胞骨架、细胞膜结构、流动性、受体、细胞器结构和分布变化
2.生物化学：酶、核酸、FISH（荧光原位杂交）、受体分析
3.药理学：药物对细胞的作用及其动力学
4.生理学：膜受体、离子通道、细胞内离子含量、分布、动态
5.神经生物学：神经细胞结构、神经递质的成分、运输和传递、递质受体、离子内外流、神
经组织结构、细胞分布
6.微生物学和寄生虫学：细菌、寄生虫形态结构
7.病理学及临床应用：活检标本诊断、肿瘤诊断、自身免疫性疾病诊断、HIV等
8.遗传学和组胚学：细胞生长、分化、成熟变化、细胞的三维结构、染色体分析、基因表达、
基因诊断
四.激光共聚焦显微镜在医学领域中的应用
A.在细胞及分子生物学中的应用
1. 细胞、组织的三维观察和定量测量
2. 活细胞生理信号的动态监测
3. 粘附细胞的分选
4. 细胞激光显微外科和光陷阱功能
5. 光漂白后的荧光恢复
6. 在细胞凋亡研究中的应用
B.在神经科学中的应用
1. 定量荧光测定
2. 细胞内离子的测定
3. 神经细胞的形态观察
C.在耳鼻喉科学中的应用
1. 在内耳毛细胞亚细胞结构研究上的应用
2. 激光扫描共聚焦显微镜的荧光测钙技术在内耳毛细胞研究中的应用
3. 激光扫描共聚焦显微镜在内耳毛细胞离子通道研究上的应用
4. 激光扫描共聚焦显微镜在嗅觉研究中的应用
D.在肿瘤研究中的应用
1. 定量免疫荧光测定
2. 细胞内离子分析
3. 图像分析：肿瘤细胞的二维图像分析
4. 三维重建
E.激光扫描共聚焦显微镜在内分泌领域的应用
1. 细胞内钙离子的测定
2. 免疫荧光定位及免疫细胞化学研究
3. 细胞形态学研究：利用激光扫描共聚焦显微镜
F.在血液病研究中的应用
1. 在血细胞形态及功能研究方面的应用
2. 在细胞凋亡研究中的应用
G.在眼科研究中的应用
1. 利用激光扫描共聚焦显微镜观察组织、细胞结构
2. 集合特殊的荧光染色在活体上观察角膜外伤修复中细胞移行及成纤维细胞的出现
3. 利用激光扫描共聚焦显微镜观察视网膜中视神经细胞的分布以及神经原的树枝状形态
4. 三维重建
H. 激光扫描共聚焦显微镜在肾脏病中的应用
可以系统观察正常人肾小球系膜细胞的断层扫描影像及三维立体影像水平，使图像更加清
晰，从计算机分析系统可从外观到内在结构，从平面到立体，从静态到动态，从形态到功能
几个方面对系膜细胞的认识得到提高。