利用根癌农杆菌转化木本植物的研究进展

利用根癌农杆菌转化木本植物的研究进展 曹艳春;赵振利 【摘 要】本文着重论述了近年来国内外利用根癌农杆菌介导法转化林木的研究进展.简述了获得转基因林木的应用现状,并将国内外林木转基因工作给以概括,提出了转化过程中存在的问题,并对这一转化方法的应用前景进行了展望.

【期刊名称】《河南林业科技》 【年(卷),期】2006(026)001 【总页数】3页(P16-18) 【关键词】根癌农杆菌;转化;林木 【作 者】曹艳春;赵振利 【作者单位】河南农业大学,郑州,450002;河南农业大学,郑州,450002 【正文语种】中 文 【中图分类】S722.3+9 19世纪末Smith发现根癌农杆菌[1]及1987年Fillatti利用根癌农杆菌Ti质粒为载体，将新霉素磷酸转移酶基因转入杨树杂种NC5339无性系内，并经Southern blotting杂交证明转基因杨树中有外源基因存在[2]，从此利用根癌农杆菌介导成为重要的林木转化方法。同其他林木遗传转化方法相比，根癌农杆菌介导法具有仪器设备简单、成本低、发生基因沉默率低、转化频率高、导入DNA片段大等优点[3]。 根癌农杆菌转化林木的受体系统和方法主要有以下几个方面： 该方法是Monsanto公司的Horsch等人于1985年建立的。最常用的植物外植体有受伤叶片（叶盘法）、茎段和叶柄，已在欧洲黑杨、挪威云杉、毛白杨、杨树（Populus spp.）、苹果、桃等树种上获得成功。 一般采用种子实生苗、试管苗或继代苗作为外植体，人为地在整株植株上造成创伤，然后把根癌农杆菌接种在创伤面上，或用针头注射到植物体内进行侵染转化[4]。这种方法是充分利用实生苗的生长潜力，同时针对针叶树树叶形细小、韧皮部厚等特点，在针叶树种上获得成功。如在挪威云杉、欧洲落叶松和杂种落叶松上得到稳定的再生转化植株。 是指将处于再生壁时期的原生质体与根癌农杆菌一起培养，离心洗涤除菌后，在含抗生素的选择培养基上培养，得到转化的细胞或植株。Gupta等将荧光素酶基因（Luciferase）导入火炬松（Pinus elliotii Engelm.）原生质体中，并在培养过程中存活的原生质体及再生细胞中测到了外源基因的表达。 李卫等利用沙田柚具有一年抽梢三四次、自然出芽容易等特点，采用农杆菌直接感染附体叶腋，并将转化腋芽离体扩繁鉴定，诱导生根形成完整植株[5]。这种附体腋芽转化-离体扩繁鉴定的方法无需无菌操作，又免除了抑制农杆菌的繁琐过程，再生时间短，效率高，且这种方法直接在树体上进行转化可大大缩短童期。 鉴定外源基因的方法包括：报告基因检测、DNA分子鉴定、RNA分子鉴定和蛋白质分子鉴定等。其中又分为直接鉴定法和间接鉴定法：直接鉴定法为采用外源基因做探针，与转化体的DNA进行分子杂交，以确定有无外源基因，这就是“Southern blotting”鉴定法[6]；间接鉴定法如对Ti质粒上胭脂碱合成酶基因的产物进行检测，或使用报告基因如β-葡萄糖苷酸酶和荧光素酶基因等进行间接鉴定。 3.1.1 苏云金杆菌毒蛋白基因 苏云金杆菌（简称Bt）制剂，长期以来用于多种害虫的生物防治。饶红宇等在2000年将Bt基因转入杨树NL-80106，获得了再生植株[7]。郑钧宝等将CryAc基因与慈姑蛋白酶抑制剂基因构建的双抗虫基因转入白杨杂种741，检测证明已得到转基因植株[8]。 3.1.2 蛋白酶抑制剂基因 蛋白酶抑制剂（PI）是自然界含量最为丰富的蛋白种类之一，存在于所有生命体中。它影响外来蛋白的正常消化，使昆虫产生厌食反应，最终造成昆虫的非正常发育或死亡[9]。2001年Rro采用根癌农杆菌介导共转化法将Bt CryIA和CpT-Ⅰ基因导入黑杨无性系NL-80106种，结果表明转双价基因的株系比转单价基因的株系抗虫效果好。 3.1.3 其它 淀粉抑制剂、蝎神经毒素基因、外源凝集素、核糖体失活蛋白等基因也是丰富的抗虫基因。2000年伍宁丰等将抗虫的蝎神经毒素基因导入黑杨无性系N80106中获得转基因植株[10 ]。 林木病害是导致林业减产的主要原因之一。采用常规的喷施杀菌剂不仅容易诱导病原菌发生突变产生抗性而失效，更重要的是污染环境。基因工程给林木抗病育种开辟了新的途径。 3.2.1 抗病毒基因工程 目前使用的抗林木病毒基因有杨树花叶病毒外壳蛋白基因、洋李痘病毒的外壳蛋白基因和黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因等几种。1991年Scorza等利用根癌农杆菌介导法，将改造的含新霉素磷酸转移酶（NPT-Ⅱ）、β-糖苷酸酶基因（GUS）与番木瓜环斑病毒（PRV-CP）构建的抗病毒基因表达载体导入欧洲李（Prunus domestica L.）中获得转基因植株。 3.2.2 抗真菌、细菌病害基因工程 几丁质酶基因和角质酶基因是目前克隆的抗树木真菌病的两种主要基因。此外，我国已从兔子中成功的克隆了防御素基因，构建了植物表达载体。1999年赵世民等将兔防御素导入毛白杨[11]。2001年汤浩茹等成功将哈兹木霉几丁质酶基因导入核桃[12]。 林木的抗除草剂基因工程中，目前导入的外源基因主要有：来自沙门氏菌的aroA基因、来自吸水链霉菌的抗膦丝菌素的抗性基因（bar基因）和抗草甘膦基因等。1987年Fillatti等将突变的EPSP合成酶基因aroA，转入银白杨×大齿杨中，获得了转基因植株。 植物体内的小分子化合物如脯氨酸、甜菜碱等对于植物忍受环境胁迫的能力具有十分重要的作用。国内外专家在这方面作了很多研究，主要有以下几个方面。 3.4.1 抗盐碱基因研究 应用的耐盐碱基因主要有：甜菜脱氢酶基因、磷酸山梨脱氢酶基因、脯氨酸合成酶A基因、胆碱脱氢酶基因等。2001年杨传平等将外源基因BetA导入小黑杨，并获得转基因植株[13]。 3.4.2 抗旱基因研究 目前研究较多的干旱应答基因有两类，一类与植株细胞内特定渗透调节物质合成有关；另一类为编码与自由基清除有关的酶。1997年，温尚昆等通过根癌农杆菌介导把与抗旱有关的激素合成基因导入毛白杨，获得再生植株[14]。 3.4.3 抗寒冻基因研究 目前用于林木抗寒冻性遗传转化的基因主要有三类：鱼类抗冻蛋白基因、编码超氧化物歧化酶和脂肪酸去饱和代谢关键酶基因[15]。1998年Arisi等将拟南芥的Fe-SOD基因导入杨树，增加了杨树抗氧化能力和耐冻性。1999年Dolgov等用根癌农杆菌介导法将抗冻蛋白（AFP antifreeze）导入酸樱桃（P. cerasus）中，获得转基因植株。 目前用于林木生殖发育调控的基因主要有芽孢杆菌RNA酶基因、DN-A基因以及影响林木花期的LEAFY基因[16]。已从辐射松、黑云杉、挪威云杉、苹果和杨树中分离和鉴定出定向进化同源开花基因[17]。 提高林木的生长速度，改良林木的木材性状是林木育种的重要目标。木质素在林木中具有重要的生物学作用，但在造纸中需花费大量费用取出木质素，且会造成严重的环境污染。目前通过反义或正义同源DNA改良木质素基因工取得了一定的效果。所用的基因主要是一些编码调控木质素生物合成的关键性酶，如肉硅醇脱氢酶、L-苯丙氨酸裂解酶和香豆醇辅酶等[18]。 利用根癌农杆菌介导法获得了一些转基因植株，但根癌农杆菌的转化体系还不完善。此外，我国林木遗传转化工作中还存在科研经费不足、技术储备不足和创新性不够以及参加单位多、经费分散等问题。因此，在今后的林木遗传改良研究中不仅应加强科研单位之间的合作，而且应该将常规育种技术和现代生物技术有机的结合起来，充分重视拥有自主知识产权的林木基因和基因工程育种，加快转基因林木成果的产业化，提高转基因林木的经济价值。 总之，根癌农杆菌介导法为我们提供了一种快速、便捷的林木遗传转化的方法，大大提高了林木育种的目的性和可操作性。应加大研究投入、改进转化技术、寻找稳定高效的转化体系，从而培育出具有更高价值的林木新品种。

【相关文献】 [1] 陈章良. 植物基因工程研究与进展[J].生物学通报，1990，9（9）：4～7. [2] Fillatti J J. Development of glyphosate tolerant populus plants through expression of a mutant agrogene from Salmonella typhimurium[J]. Genetic Manipulation of Woody Plants，Edited by James，W. Hanover ct al，1988：243～249. [3] Binns A N. Agrobacterium-mediated gene delivery and the biology of host range limition[J]. Physiol Plant，1990，79：135～139. [4] 许智宏，卫志明. 植物原生质体培养和遗传操作[M]. 上海：上海科学技术出版社，1997. [5] 李卫，陈亮，蔡得田，等. 柑桔基因转化新方法的研究[J]. 植物学报，1997，39（8）：782～784. [6] Huang Y. Agrobacterium rhizgenes mediated genetic transformation and in Votro regeneration of a conifer Larix deciduas[J].In Vitro Plant，1991，27（4）：201～207. [7] 饶红宇，陈英，黄敏仁，等.杨树NL-80106转Bt基因植株的获得及抗虫性[J]. 植物资源与环境学报，2000，9（2）：1～5. [8] 郑均宝，梁海永，高宝嘉，等. 转双抗虫基因741毛白杨的选择及抗虫性[J]. 林业科学，2000，36（2）：13～ 19. [9] 王深柱，钦俊德. 植物蛋白酶抑制素抗虫作用的研究进展[J]. 昆虫学报，1997，40（2）：212～218. [10] 伍宁丰，孙芹，姚斌，等. 抗虫的AalT基因杨树的获得[J]. 生物工程学报，2000，16（2）：129～133