各种细胞用快速支原体检测试剂盒和方法优缺点比较
肺炎支原体抗体三种血清学检测方法的对比分析
20192019年6月第9卷第11期·检验医学·肺炎支原体抗体三种血清学检测方法的对比分析谢文俊厦门市海沧医院检验科，福建厦门 361026[摘要] 目的 比较电化学发光方法（CLIA）、间接免疫荧光抗体法（IFA）和被动凝集法（PPA）在肺炎支原体感染早期检测中的应用价值。
方法 选取我院2017年6月～2018年3月可疑肺炎支原体感染的患者153例，分别采用电化学发光方法、间接免疫荧光法和被动凝集法检测患者血清中的肺炎支原体抗体，比较这三种检测方法阳性检出率的差异，以协助临床早期诊断肺炎支原体感染。
结果 PA法检测出（IgM+IgG）阳性标本和阴性标本数分别为60（39.22%）和93（60.78%）；CLIA检测出（IgM）阳性标本和阴性标本数分别为57（37.25%）和96（62.75%）；IFA检测出（IgM）阳性标本和阴性标本数分别为54（35.29%）和99（64.71%）；以上三种检测方法的阳性检出率差异均无统计学意义（P＞0.05）。
对IFA/PA、IFA/CLIA和CLIA/PA进行一致性分析，CLIA/PA组、CLIA/IFA组和IFA/PA组的Kappa值分别0.903、0.929和0.867，三种检测方法一致性好（Kappa系数均＞0.75）。
结论 电化学发光方法（CLIA）、间接免疫荧光抗体法（IFA）和被动凝集法（PPA）均在检测肺炎支原体中有着较高的一致性，均可用于肺炎支原体抗体的检测，且CLIA法由于检测MP分型抗体具备精密度高、用时短、操作自动化等优势，有望替代IFA法和PA法应用于临床。
[关键词] 肺炎支原体；化学发光免疫分析法；间接免疫荧光抗体法；被动凝集法[中图分类号] R446.6 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2019）11-90-03Comparative analysis of three serological detection methods for mycoplasma pneumoniae antibodyXIE WenjunDepartment of Clinical Laboratory,Xiamen Haicang Hospital,Fujian,Xiamen 361026,China[Abstract] Objective To compare the application values of electrochemiluminescence immunoassay(CLIA),indirect immunofluorescence antibody method(IFA)and particle agglutination(PPA)in the early detection of mycoplasma pneumoniae infection. Methods 153 patients with suspected mycoplasma pneumoniae infection who were admitted to our hospital from June 2017 to March 2018 were selected and they were respectively given electrochemiluminescence immunoassay,indirect immunofluorescence antibody method and particle agglutination to detect mycoplasma pneumoniae antibody in the serum.The differences in the positive detection rates of these three methods were compared to assist the early diagnosis of mycoplasma pneumoniae infection. Results The number of positive and negative samples of IgM and IgG detected by PA method were 60(39.22%)and 93(60.78%),respectively.The number of positive and negative IgM samples detected by CLIA was 57(37.25%)and 96(62.75%),respectively.The number of positive and negative IgM samples detected by IFA was 54(35.29%)and 99(64.71%),respectively.There was no significant difference in the positive detection rate of the above three methods(all P＞0.05).Consistency analysis was conducted for IFA/PA,IFA/CLIA and CLIA/PA.The Kappa values of CLIA/PA group,CLIA/IFA group and IFA/PA group were 0.903,0.929 and 0.867 respectively.The consistency of the three detection methods was good(Kappa coefficient＞0.75). Conclusion Electrochemiluminescence immunoassay(CLIA),indirect immunofluorescence antibody method(IFA)and particle agglutination(PPA)all have high consistency in the detection of mycoplasma pneumoniae,which can be used for the detection of mycoplasma pneumoniae antibodies.In addition,CLIA method is expected to replace IFA method and PA method in clinical application because of its advantages of high precision,short time and automatic operation in the detection of MP typing antibody.[Key words]Mycoplasma pneumoniae;Electrochemiluminescence immunoassay;Indirect immunofluorescence antibody method;Particle agglutination肺炎支原体（mycoplasm apneumonia，MP）是学龄儿童和青少年呼吸道感染的主要原因，是继肺炎链球菌之后的第二大社区获得性肺炎的病原体[1-4]。
支原体污染的检测方法
本产品仅供科学研究使用！请勿用于临床、诊断、食品、化妆品检测等用途！
细胞被支原体污染后，不论从外观上有无变化，均会严重的影响各种实验的结果。被支 原体感染的细胞其正常的生长和代谢会受到影响。部分细胞虽然表面变化不十分明显，实际 上潜伏着多方面的危险。而细胞重组表达的蛋白质，其活性也会受到影响，甚至完全失去活 性。支原体可以通过消耗培养基中的精氨酸，抑制细胞 DNA、RNA 的合成，降低细胞的抵抗 力。支原体感染会对细胞造成的影响是多方面的：包括代谢、免疫或生化特性、生长状况、 酶的作用途径、细胞膜的组成、染色体结构、转染效率、以及细胞存活等多方面的改变。因 此，支原体污染会对培养细胞的分子水平研究带来偏差或假阳性的实验结果。
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电话：021-33921235 邮箱：bestbio@ 传真：021-60853530
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产品说明书
菌群）、培养基的污染、污染支原体的细胞造成的交叉污染、实验器材带来的污染和用来制 备细胞的原始组织或器官的污染。支原体污染细胞后，特别是重要的细胞株，有必要清除支 原体。
贝博支原体检测试剂盒为预防或清除细胞培养过程中支原体污染而精心研发的一个高 效的支原体检测产品。该产品能快速检测细胞是否有支原体污染。本产品可以为科研、生产 中的细胞培养工作提供有力的安全保障，防止和解决细胞污染带来的各种成本浪费。
支原体感染的检测方法及其准确性
支原体感染的检测方法及其准确性支原体是一种常见的细菌感染引起的疾病，包括支原体肺炎、尿道炎、阴道炎和结膜炎等。
早期诊断和准确的检测方法对于及时治疗和预防传染至关重要。
本文将介绍支原体感染的检测方法以及其准确性。
一、支原体感染的常见检测方法1. 核酸扩增技术（Nucleic Acid Amplification Techniques，简称NAATs）核酸扩增技术是目前最敏感、最准确的检测方法之一。
常见的核酸扩增技术包括聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）、实时荧光定量PCR（Real-time Quantitative PCR，简称qPCR）和测序技术等。
这些技术可以通过扩增和检测支原体的特定DNA或RNA序列来确定感染是否存在。
2. 细胞培养方法细胞培养方法是传统的支原体检测方法之一。
通过将临床样本（如痰液、尿液或阴道分泌物）接种到特定的培养基中，培养并检测支原体的生长。
细胞培养方法虽然能够提供活体支原体，并确定感染的类型，但是时间周期较长，容易受到培养条件的影响，有一定的局限性。
3. 免疫学方法免疫学方法通过检测宿主机体对支原体感染产生的免疫反应来确定感染的存在。
常见的免疫学方法包括酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，简称ELISA）、免疫荧光染色和免疫组织化学等。
这些方法具有快速、简便的特点，但其准确性受到感染阶段和宿主个体免疫状态等因素的影响。
二、支原体感染检测方法的准确性评估支原体感染的准确性评估主要包括敏感性、特异性和阳性预测值等指标。
1. 敏感性敏感性是指检测方法能够正确识别存在的感染比例。
核酸扩增技术通常具有较高的敏感性，可以检测到低至几十个拷贝的病原体核酸，具有较高的检出率。
2. 特异性特异性是指检测方法能够正确识别无感染的比例。
核酸扩增技术通常具有较高的特异性，可以通过特定的引物和探针来检测目标病原体的特异性序列，减少误报率。
支原体试检测剂盒使用说明书(中文版)
支原体检测试剂盒使用说明书1.试剂：支原体检测试剂盒由武汉源深生物科技有限公司提供。
2.实验方法:巢式PCR的方法检测支原体污染：A.待检细胞汇合率在90％以上时取100 µL细胞上清液到离心管内B.95o C孵育5分钟C.短暂高速离心15秒钟左右D.试剂盒里的组份：引物混合物(Primer Mix) 20 µL阳性对照DNA (Positive Control DNA) 15 µL阴性对照(Internal Control DNA) 20 µL巢式PCR一共需要做2轮PCR，本检测方法不受其他来源（如所培养细胞）DNA的影响，不但提高了检测的灵敏度，同时也提高了特异性。
(1)第一轮PCR:PCR 混合物：向0.2 mL PCR薄壁管中依次加入以下组分，盖紧管盖，轻弹管壁混匀，稍加离心。
E.热循环程序：将准备好的PCR管放入PCR仪，运行如下程序。
PCR 混合物：向0.2 mL PCR薄壁管中依次加入以下组分，盖紧管盖，轻弹管壁混匀，稍加离心。
F. 热循环程序：将准备好的PCR 管放入PCR 仪，运行如下程序。
试验结果：2％ 琼脂糖凝胶电泳，TBE 缓冲液，PCR 产物及Marker 均点样10µL ，于50V 下电泳1hr ，EB 染色15min ，紫外灯下观察。
电泳结果见下图：图中泳道M 为DNA Marker ，1和2为待检测细胞系的第一轮PCR 产物 (1st )，3和4为待检测细胞系的第二轮PCR 产物 (2nd ), 其中1、3为阳性对照管PCR 产物，2、4为阴性对照PCR 产物。
阳性对照管在200bp 左右，和300-400 bp 处各有一条带，证明本次实验准确可靠 (不同的支原体Mycoplasma, such as M. fermentans, M. hyorhinis, M. arginini, M. orale, M. hominis, M. arthritidis, M. hyopneumoniae and Acholeplasma laidlawii 的保守区的片段长度不一，大概在200-400 bp 之间)。
探针法支原体检测试剂盒说明书
《探针法支原体检测试剂盒》（含内参）说明书（版本20230112）【本说明书会不定期更新，每次收到新的产品时，请到本公司网站重新下载最新版本！】货号QM016包装规格50次/盒储存条件该产品在常温或随冰袋运输，收到产品后，请立即放-20 ℃冰箱低温避光保存。
该条件下，至少5年内有效。
产品用途《探针法支原体检测试剂盒》（qPCR Mycoplasma Detection Kit with Probe）采用支原体特异性引物和支原体特异性荧光探针（报告基因为FAM），用于对样品的支原体基因组DNA进行荧光定量PCR扩增检测。
试剂盒内同时含有内参对照质粒mycoIC2和相应的引物和荧光探针（报告基因为VIC），用于监控支原体DNA 提取和qPCR扩增的效率。
本试剂盒可用于检测一切可能含支原体的样品，比如：（1）体外细胞培养的上清；（2）血清；（3）各种体液，如唾液、尿液、鼻腔分泌物等；（4）别的液体样品。
本产品仅供研究使用。
产品简介哺乳动物细胞的培养，支原体（Mycoplasma）污染是个世界性的问题。
支原体污染几乎可以改变细胞的所有参数，导致实验结果的不准确、甚至完全错误（支原体污染对细胞的详细危害，请参考本公司的网站：）。
从2013年开始，《Nature》期刊已正式要求投稿的文章，如涉及细胞培养都要进行支原体检测。
相信会有越来越多的高水平期刊将做出同样的支原体检测要求。
培养法是相对可靠的支原体检测技术，但是该方法非常耗时的，需要数周，不适合作为细胞培养液中支原体污染的快速检测。
此外，通过固体培养法无法检测污染细胞的一种最常见的支原体，即猪鼻支原体（M.Hyorhinis）。
这是因为猪鼻支原体无法在支原体固体培养基上形成可见的菌落。
而猪鼻支原体约占所有支原体污染的20-50%。
有的实验室使用荧光染色法检测支原体，但是该方法灵敏度太低，当检测成阳性时，细胞经常已经严重污染。
培养法和荧光染色法虽然是我国药典收录的支原体检测方法，但是因为其各自都有明显的缺点，不适合作为支原体快速检测的方法。
快速检测试剂盒
快速检测试剂盒快速检测试剂盒是一种能够快速、准确地检测样本中特定成分的化学试剂盒。
它具有操作简便、便携、适用范围广等特点，在医疗、食品安全、环境监测等领域得到广泛应用。
检测原理快速检测试剂盒通常采用免疫学和生物学的原理。
它通过检测样本中特定成分与试剂之间的化学反应，来确定被测物的存在与否。
以单克隆抗体为例，对于待测样品中特定的抗原物质，试剂盒中预先涂有与之相应的单克隆抗体，加入样品后，如果样品中含有特定的抗原物质，那么它就会与试剂盒中的抗体结合，形成复合物。
这时，再加入检测剂，如果检测剂可以与复合物特异性结合，那么检测结果就会呈现出颜色变化。
适用范围快速检测试剂盒适用于多种业务领域，包括但不限于：•医疗–快速检测病原菌、炎症、肿瘤标志物等–临床用药监测•食品安全–检测食品中的生物毒素、重金属等–检测水产品中的渔药残留•环境监测–检测大气、水质污染物快速检测与传统检测的比较与传统的化学检测手段相比，快速检测试剂盒具有以下优势：•更省时省力：传统检测通常需要样品的预处理和长时间的化验过程，而快速检测试剂盒的使用只需要数分钟到数小时的时间；•更便携：快速检测试剂盒体积小，重量轻，可携带性强，实验可以在实验室外进行，适用范围更广；•更经济：传统检测通常需要昂贵的仪器设备和化学试剂，而使用快速检测试剂盒成本更低，更易于推广应用。
虽然快速检测试剂盒有许多优点，但也存在一些限制。
它的检测灵敏度和检测范围相对有限，需要严格的操作规程和较高的实验技能。
此外，因为试剂盒的主要应用范围是定性检测，无法测量成分的精确浓度。
结论随着现代科技的飞速发展和人们健康意识的不断提高，快速检测试剂盒在治疗和预防疾病、保障食品安全、环境监测等方面的应用前景越来越广阔。
在未来的发展中，快速检测技术有望在实时监控、个性化诊断等方面展现更广阔的应用前景。
细胞支原体污染常用支原体检测方法和试剂盒介绍
细胞支原体污染常用支原体检测方法和试剂盒介绍（2016年10月16日）哺乳动物细胞的培养，支原体（Mycoplasma）污染是个世界性的问题。
支原体污染几乎可以改变细胞的所有参数，导致实验结果的不准确、甚至完全错误。
从2013年开始，《Nature》期刊已正式要求投稿的文章，如涉及细胞培养都要进行支原体检测。
相信会有越来越多的高水平期刊将做出同样的支原体检测要求。
目前，细胞支原体污染常用的支原体检测方法主要有：一、培养法●原理：将待检测样品先接种到支原体液体培养基中大量繁殖，然后再转接种到支原体固体培养基中，培养一段时间后（大约一个月），如果固体培养中，出现典型的支原体菌落，则说明待测样品有支原体污染。
●优点：支原体培养法是相对可靠的支原体检测技术，也是我国药典认可的方法之一。
●缺点：（1）培养法非常耗时的，需要数周，不适合作为细胞培养液中支原体污染的快速检测；（2）通过固体培养法无法检测污染细胞的一种最常见的支原体，即猪鼻支原体（M.Hyorhinis）。
这是因为猪鼻支原体无法在支原体固体培养基上形成可见的菌落。
而猪鼻支原体约占所有细胞支原体污染的20-50%。
●《培养法支原体检测试剂盒》》主要厂家：读者可以根据《中国药典》中收录的培养法支原体检测方法进行操作。
二、荧光染色法●原理：将待检测样品接种到专门的指示细胞（如：Vero细胞）中，培养一段时间后，用DNA荧光染料（如：Hoechst 33258，DAPI）进行染色，如果除了细胞核被染色外，细胞质也有大量的絮状核酸物质被荧光染料染色，那么这些处于细胞质的核酸物质就是支原体DNA。
●优点：荧光染色法也是我国药典认可的方法之一。
●缺点：（1）该方法灵敏度太低，当检测成阳性时，细胞经常已经严重污染；（2）需要用到专门的指示细胞（如：Vero细胞），如果不用指示细胞而直接对目标细胞进行荧光染色，由于每种细胞繁殖和吸附支原体的能力差异极大，检测的准确性将比用Vero等指示细胞进行检测要低得多；（3）该方法严重依赖实验人员的经验，可重复性较差。
三种快速支原体检测试剂盒检测原理与优缺点比较
三种快速支原体检测试剂盒检测原理与优缺点比较在细胞培养，特别是传代细胞培养中，支原体污染率达到15-35%。
支原体的侵染会引起细胞功能和基因表达的严重改变，并造成持续危害。
由于支原体污染会严重影响实验结果的可靠性、重复性和一致性，对支原体的常规检测非常重要。
传统的支原体检测方法很耗费时间，通常需要一天至数周，而且操作比较繁琐，准确度不高。
中国药典给定的支原体标准检测方法有两种：培养法和DNA染色法。
培养法方法简单，假阳性率低，但样品需要量高，耗时20天左右，时间漫长。
DNA染色法结果直观，假阳性率低，但需要荧光显微设备，实验操作复杂。
能否找到一种省时、省力且准确性高的方法检测支原体污染呢？目前，市场上具有多款支原体快速检测试剂盒，我们选取了其中3种品牌的快速支原体检测试剂盒，就其检测原理与优缺点进行一下比较。
一、美国CLARK Bioscience品牌一步法检测试剂盒美国CLARK Bioscience公司研发的一步法支原体检测试剂盒One-step Quickcolor Mycoplasma Detection Kit，利用等温扩增的方法，可检测7种常见支原体的基因。
该检测方法与PCR方法类似，检测过程中，只需取少量细胞培养上清，及一个能控制温度的水浴锅或恒温金属浴，其扩增产物的颜色可通过肉眼直接观察判断，整个过程需要1小时左右。
该方法对仪器的要求比较低，理论上灵敏度比较高。
缺点在于检测的支原体种类太少，目前已发现的近200种支原体，只能检测其中的7种，检测范围太窄，也不符合国家药典的规定。
而且肉眼观察结果比较主观，有可能不同的实验人员判读的结果不一致。
二、美国Lonza品牌生物发光法检测试剂盒美国Lonza品牌的MycoAlertTM 和升级的MycoAlertTM PLUS支原体检测试剂盒，采用生物发光的方法，检测支原体酶活性。
其检测的支原体酶广泛存在于180多种支原体中，而不存在于真核细胞中。
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各种细胞用快速支原体检测试剂盒和方法优缺点比较
（2016年10月16日）
具体选购步骤：
首先，您应该根据自己实验室的仪器情况，进行选择。
如果您实验室拥有发光检测仪（Luminometer）或者具有发光检测功能的多功能酶标仪以及-80 ℃低温冰箱，我们强烈建议您选购《发光法支原体检测试剂盒》。
《发光法支原体检测试剂盒》具有检测时间短、支原体检出率高、不会产生假阳性和假阴性、可以区分死活支原体等优点。
如果您的实验室没有上述条件，您只能选择《一步法恒温支原体检测试剂盒》或者《PCR法支原体检测试剂盒》。
其次，您可以根据检测时间长短、产品价格、支原体识别率、假阳性和假阴性概率、样品是否需要前处理等进行
综合选择。
最后，作为支原体检测领域的共识：单独使用目前市面上的任何一种支原体检测试剂盒，都无法做到100%正确，既不会漏检（假阴性），也不会多检（假阳性）。
严格的支原体检测，至少需要使用两种，最好使用三种不同原理的支原体检测方法同时进行检测，才能使检测结果接近100%正确。
如果您想得到100%正确的支原体检测结果（比如，开展细胞治疗的客户，进行干细胞培养的客户，生产血清、胰酶、培养液的客户，出售各种原代培养细胞系和肿瘤细胞系的客户等），任选上海易色《一步法恒温支原体检测试剂盒》、《PCR 法支原体检测试剂盒》和《发光法支原体检测试剂盒》中的两种进行检测，将会得到比较满意的结果，检测的正确率应该在99.9%以上。
如果同时使用这三种试剂盒进行检测，检测的正确率应该在99.99%以上。