慢病毒载体的miRNA载体构建实验服务
miR-TH克隆及慢病毒载体的构建
连 接 ， 建 慢 病 毒 表 达载 体 ｐ ｅ ｔ ／５ Ｄ Ｓ 一 Ｈ， 脂 质 体 ２０ （ｐｆｅ ｍｉ ｏ ｏ将 慢 病 毒 载 体 以及 包 装 质 粒 （Ｌ １ 构 Ｌｎｉ Ｖ 一 Ｅ Ｔ－ 用 ６ Ｔ ０ ０１ ｏｅｔ ｎ ２ ｏ ） ｉ ａ ｅ ｐＰ ，
ｐＰ Ｌ ２和 ｐ Ｐ Ｖ Ｖ ） 转 染 Ｈ Ｋ ２ ３ Ｔ细 胞 ， 集 上 清 ， 染 ２ ３ Ｌ／ Ｓ Ｇ共 Ｅ 一９ Ｆ 收 感 ９ Ｔ细 胞 株 进 行 滴 度 鉴 定 。 结果 ： 序 结 果 表 明， 测 ４对 ｐＤ ＡＭ ．一 Ｗ／ ｍ Ｆ — ｉ — Ｈ 表 达 载 体 序 列 与 参 考 序 列 一 致 ， 建 出来 的慢 病 毒 载 体 在 ２ ３ ｒ细 胞 中 包 装 成 功 ， ｃ Ｎ Ｔ ６２ Ｇ Ｅ Ｇ Ｐ ｍ Ｒ Ｔ 构 ９Ｆ 并通过 ２３ ９ Ｔ细 胞 测 得慢 病 毒 滴 度 为 ５ １＇ Ｕｍｌ 论 ： 功 构建 了 Ｔ 的慢 病 毒 干 扰 载体 ｐ ｅｔ ／ ５ Ｄ Ｓ — Ｈ， ｘ ０ Ｔ ／ 。结 成 Ｈ Ｌ ｎｉ Ｖ － Ｅ Ｔ Ｔ 为利 ６ 一 用 Ｒ Ａ干 扰技 术进 一 步 研 究 Ｔ Ｎ Ｈ基 因 的功 能 和 作 用 奠 定 了基 础 。
并 合 成 ４对 微 小 Ｒ Ａｍ Ｒ Ａ 的 ＯｉｏＤ Ａ， 火 形 成 双 链 后 与 ｐ Ｄ Ａ Ｍ ．－ Ｗ／ｍ Ｆ — ｉ Ｎ 载 体 相 连 ， Ｇ ｔ ａ Ｎ （ｉ Ｎ ） ｌ Ｎ 退 ｇ ｃ Ｎ Ｔ ６２－ Ｅ Ｇ Ｐ ｍ Ｒ Ａ － Ｇ 用 ａｅ ｙ ｗ 技 术 将 构 建 好 的 ＤＤ Ａ￣ ．－ Ｗ／ ｍＧ Ｐ一 Ｒ Ｔ 载 体先 后 与 中 间 载 体 ｐ Ｏ Ｒ￣２ 、 病 毒 载 体 ｐ ｅｔ ／ ５ Ｄ Ｓ ｃ Ｎ ａ ２－ ６ ． Ｇ Ｅ Ｆ －ｍｉ— Ｈ Ｄ Ｎ ｒ １慢 ｅ ２ Ｌ ｎｉ Ｖ 一 Ｅ Ｔ ６
MiR-218慢病毒表达载体的构建及鉴定
MiR-218慢病毒表达载体的构建及鉴定石晓磊;胡凤蓉;胡思隽;王为忠【期刊名称】《科学技术与工程》【年(卷),期】2011(011)013【摘要】To construct a lentiviral vector expressing Hsa-pre-mir-218-2 and make a foundation on studying of the functions and mechanisms of miR-218. partially complementary forward and reverse primers were designed based on the hsa-pre-mir-218-2 sequence. The primer dimers were generated by primer annealing method. These primer dimers were amplified by PCR and were inserted into enzyme-digested and linearized pGCSIL-GFP lentiviral vectors. The recombinant plasmid pGCSIL-GFP-mir-218-2 was identified by double enzyme digestion and then was packed with lentiviral packaging systems, and viral titer was determined. Human gastric cancer cells MKN-28 were infected with the constructed lentiviral vectors. The expression of miR-218 in MKN-28 cells was determined by qPCR. The double enzyme digestion and DNA sequencing analyses of the recombinant plasmid revealed that insertion element was correctly cloned into the vector. The qPCR demonstrated that the expression level of miR-218 in the lentivirus infected MKN-28 cells was increased significantly. It can effectively infect gastric cancer cells. The lentiviral vector with hsa-pre-mir-218-2 is constructed successfully and laid an experimental basis on the studies of the functions and mechanisms of miR-218.%构建人mir-218-2,pre-miRNA慢病毒表达载体,为研究miR-218在人体的功能及作用机制打下基础.以人hsa-mir-218-2前体序列,设计部分互补的正反向引物,进行引物退火,形成引物二聚体.PCR扩增引物二聚体,酶切后插入到线性化pGCSIL-GFP慢病毒表达载体中,对重组质粒进行双酶切鉴定,并进行慢病毒的包装与滴度检测.用构建好的慢病毒表达载体感染人胃癌细胞MKN-28,qPCR检测细胞内miR-218表达.结果显示,重组质粒经双酶切分析及转化菌液测序,插入序列正确,慢病毒表达载体感染人胃癌细胞后qPCR检测显示能显著增高miR-218的表达.说明本实验成功构建了hsa-mir-218-2慢病毒表达载体,感染人胃癌细胞后能有效提高miR-218的表达.为进一步研究miR-218在人体的功能及作用机制建立了实验基础.【总页数】5页(P2888-2892)【作者】石晓磊;胡凤蓉;胡思隽;王为忠【作者单位】第四军医大学西京消化病医院肿瘤生物学国家重点实验室,西安,710032;第四军医大学西京消化病医院肿瘤生物学国家重点实验室,西安,710032;第四军医大学西京消化病医院肿瘤生物学国家重点实验室,西安,710032;第四军医大学西京消化病医院肿瘤生物学国家重点实验室,西安,710032【正文语种】中文【中图分类】R372【相关文献】1.Lv-shRNA-Hsa-microRNA-691慢病毒表达载体的构建与鉴定 [J], 何燕浙;唐德军2.LOX-shRNA慢病毒表达载体的构建与鉴定 [J], 周蒨;吴慧恒;陈信良;董晓燕3.VASP基因RNA干扰慢病毒表达载体的构建与鉴定 [J], 王静;魏蕾;邱堃4.长链非编码RNA BRE-AS1慢病毒表达载体的构建与鉴定 [J], 周辉;余淦;徐华;叶章群5.长链非编码RNA-GAS5慢病毒表达载体构建及其转染效率鉴定 [J], 郑东颖;侯悦;李媛媛;杨云;乔宠因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
TIEG特异的siRNA慢病毒载体的构建及鉴定
TIEG特异的siRNA慢病毒载体的构建及鉴定叶礼红;舒晓春;邬伟民;鲁红云;孟晓军;孙辽【期刊名称】《中国现代医学杂志》【年(卷),期】2009(19)17【摘要】目的构建TIEG基因siRNA慢病毒载体.方法针对已经筛选确定的TIEG 基因siRNA有效靶序列.合成靶序列的Oligo DNA退火形成双链DNA与经BamH Ⅰ和EcoRl酶切后的PshRNA-copGFP-lendvector慢病毒载体[含H1启动子和绿色荧光蛋白(GFP)]连接产生psiRNA-TIEG慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆.测序鉴定,用psiRNA-TIEG和病毒包装系统共转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度;用包装病毒颗粒注射大鼠,通过RealTime-PCK检测大鼠肾组织TIEG mRNA的表达水平.结果 PCR和测序证实,成功构建TIEG siRNA慢病毒栽体psiRNA-TIEG,包装慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为1×10<'5>ifu/μL;实验组大鼠TIEGmRNA的表达水平明显低于对照组(50.7%).结论成功构建大鼠TIEG基因siRNA慢病毒栽体psiRNA-TIEG.【总页数】5页(P2568-2572)【作者】叶礼红;舒晓春;邬伟民;鲁红云;孟晓军;孙辽【作者单位】中山大学附属第五医院内分泌科,广东,珠海,519000;中山大学附属第五医院内分泌科,广东,珠海,519000;中山大学附属第五医院内分泌科,广东,珠海,519000;中山大学附属第五医院内分泌科,广东,珠海,519000;中山大学附属第五医院内分泌科,广东,珠海,519000;中山大学附属第五医院内分泌科,广东,珠海,519000【正文语种】中文【中图分类】Q782【相关文献】1.表达HBsAg特异性siRNA的重组腺相关病毒载体的构建 [J], 胡斌;杨燕;刘嘉;马智勇;黄红平;余源;刘慎沛;杨东亮2.C-erbB-2特异性siRNA逆转录病毒载体的构建与鉴定 [J], 陈敏;冯定庆;祝怀平;凌斌;周颖;朱园园;高婷;程志祥;沈国栋;赵卫东3.SMO特异性siRNA慢病毒载体的筛选构建 [J], 杨波;陈卫华;温机灵;华咏;王跃闽4.ABCE1特异性siRNA慢病毒载体的构建与鉴定 [J], 任翼;刘永煜;郭微;田大力5.大鼠NgR特异性siRNA慢病毒载体的构建与鉴定 [J], 林如英;王玮因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
慢病毒载体构建原理
慢病毒载体构建原理
慢病毒（lentivirus）是一类病毒，属于反转录病毒的一种。
慢病毒可以作为基因转移的工具，被广泛应用于基因治疗、基因编辑、干细胞研究等领域。
慢病毒载体构建是利用慢病毒作为基因传递的载体，将外源基因导入慢病毒基因组中，并通过慢病毒的复制和转录机制，将外源基因稳定地表达在宿主细胞中的过程。
慢病毒载体构建的原理主要包括以下几个步骤：
1. 选择适当的慢病毒载体，慢病毒载体通常由慢病毒的基因组和外源基因组成。
在构建慢病毒载体时，需要选择适当的慢病毒载体，通常选择已经经过改造的慢病毒载体作为基础，然后将需要表达的外源基因插入到载体中。
2. 插入外源基因，将需要表达的外源基因插入到慢病毒载体的适当位置。
通常采用限制性内切酶切割和连接酶连接的方法，将外源基因与慢病毒载体连接起来，形成重组的慢病毒载体。
3. 构建重组慢病毒载体，将插入了外源基因的慢病毒载体导入到适当的宿主细胞中，利用宿主细胞的复制和转录机制，使重组慢
病毒载体在宿主细胞中稳定复制和表达外源基因。
4. 验证慢病毒载体的稳定性和表达效果，对构建的重组慢病毒
载体进行验证，包括验证慢病毒载体在宿主细胞中的稳定性和外源
基因的表达效果。
通常采用PCR、Western blot等方法对慢病毒载
体进行验证。
总之，慢病毒载体构建是利用慢病毒作为基因传递的载体，将
外源基因导入慢病毒基因组中，并通过慢病毒的复制和转录机制，
使外源基因稳定地表达在宿主细胞中的过程。
这一技术在基因治疗、基因编辑、干细胞研究等领域具有重要的应用前景，对于疾病治疗
和生命科学研究具有重要意义。
USP22 ShRNA慢病毒载体的构建及鉴定
USP22 ShRNA慢病毒载体的构建及鉴定目的构建并鉴定USP22基因ShRNA慢病毒载体，为进一步研究USP22基因在鼻咽癌中的作用机制奠定基础。
方法针对USP22基因的编码序列设计并合成2条特异性干扰序列，序列两端含有限制性内切酶位点HpaⅠ和XhoⅠ。
寡核苷酸链退火生成寡核苷酸双链，5′端磷酸化后将含有酶切位点的寡核苷酸双链克隆到pLL3.7慢病毒表达载体。
连接产物经转化、培养，提取其质粒，提取出来的质粒经HpaⅠ和XhoⅠ酶切电泳鉴定，鉴定正确的质粒进行测序。
构建成功的慢病毒表达载体pLL-USP22-shRNA與包装载体质粒混匀共转染于293T细胞。
通过荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白（GFP）情况，对病毒滴度和感染效率进行检测。
结果成功构建慢病毒表达载体pLL-USP22-shRNA。
与包装载体质粒共转染293T细胞后测定慢病毒滴度为4×107 TU/ml。
结论本实验应用相关技术成功构建USP22 ShRNA慢病毒载体，为进一步研究USP22基因的生物学功能奠定了基础。
标签：USP22；慢病毒载体；构建；鉴定肿瘤细胞中基因表达具有组织特异性，USP22泛素水解酶属去泛素化酶DUB基因家族成员，其普遍表达表明其功能的保守性，因此，USP22被归类为肿瘤干细胞的标记基因而引起高度关注[1]。
国内外学者研究发现，USP22基因过表达与结直肠癌[2]、肺癌[3]、胃癌[4]、食管癌[5]、乳腺癌[6]等恶性肿瘤的浸润、转移和预后差高度相关。
沉默USP22基因表达，能显著抑制膀胱癌[7]、结直肠癌[8]细胞增殖，由此推测USP22基因可能成为肿瘤治疗的一个新靶点。
本研究通过基因工程技术构建USP22 ShRNA慢病毒载体，为进一步研究USP22基因在人鼻咽癌细胞中的作用机制提供实验基础。
1 材料与方法1.1 实验材料、试剂及仪器pLL3.7慢病毒表达载体及包装载体质粒购自广州永诺生物科技有限公司。
慢病毒载体的构建及其在基因治疗方面的应用
慢病毒载体的构建及其在基因治疗方面的应用摘要：慢病毒属于逆转录病毒科，为RNA病毒。
经改造的慢病毒作为外源基因载体，具有其独特的特点和优势。
基因治疗成功的关键是选择合适的载体系统，慢病毒载体作为一种特殊的逆转录病毒载体，具有可感染分裂细胞及非分裂细胞、转移基因片段容量较大、目的基因表达时间长、不易诱发宿主免疫反应等优点，已成为当前基因治疗载体研究的热点。
近年来对其基础生物学特性、载体改造及其应用等研究均取得了较大进展，笔者对慢病毒载体的构建以及其在人类疾病基因治疗方面的应用做简单的介绍。
关键词：慢病毒载体；载体构建；基因治疗基因治疗是向靶细胞或组织中引入外源基因DNA或RNA片段，以纠正或补偿基因的缺陷，关闭或抑制异常表达的基因，从而达到治疗的目的。
其关键问题之一是如何将目的基因导入靶细胞，得到稳定、高效表达。
理想的基因载体应具备：靶向特异性；高度稳定、易制备、可浓缩和纯化；无毒性；有利于基因高效转移和长期表达；容量大，易人工合成，缺乏自动复制载体自身的能力［１］。
由于病毒基因组结构简单、分子背景比较清楚、易于改造和操作、感染效率高、有较高靶细胞特异性，这些都是其他载体系统无法比拟的，而慢病毒载体由于其对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力且转染效率高、靶向性好和持久性表达等特点，病毒载体系统就显得格外引人注目。
1 慢病毒及其载体的简介慢病毒属于逆转录病毒科，为RNA病毒。
慢病毒除了具有一般逆转录病毒gag、pol和env3个基本结构基因外，还包含4个辅助基因vif、vpr、nef、vpu 和2个调节基因tat和rev［２］。
慢病毒载体（Lentiviral vector，LV）作为外源基因载体，其产生均包括一个遗传割裂基因表达的设计。
病毒元件要符合以下条件：①慢病毒组装辅助蛋白至少含有gag-pol基因；②慢病毒转基因载体RNA 包括转基因表达盒；③异质糖蛋白。
目前使用不同种属来源的慢病毒载体，包括来源于人类（HIV-1和HIV-2）以及猿猴（SIV）、猫（FIV）等其它物种［３］。
人ERRα基因小分子干扰RNA慢病毒载体构建及鉴定
人ERRα基因小分子干扰RNA慢病毒载体构建及鉴定孙蓬明;毛晓丹;林芬;蔡良知;吴齐斌;宋一一【期刊名称】《福建医药杂志》【年(卷),期】2011(33)4【摘要】目的构建并鉴定靶向人ERRα基因的小分子干扰RNA的慢病毒载体.方法针对ERRα mRNA设计了4条siRNA,并构建pGCSIL-GFP-siERRα慢病毒质粒,PCR扩增阳性克隆并测序鉴定.用pGCSIL-GFP-siERRα、pHelperl.0和pHelper2.0质粒共转染293T细胞包装产生慢病毒,测定病毒滴度.将慢病毒干扰RNA及含有ERRα过表达载体共转染293T细胞,Western-blot检测ERRα表达,观察蛋白表达抑制效果.结果 PCR和测序结果与设计的干扰序列一致,病毒滴度达2×109TU/ml.转染细胞中ERRα蛋白表达显著降低.结论成功构建高表达、高效率的人ERRα基因小分子干扰RNA慢病毒载体,为进一步研究ERRα在细胞核内转导中的作用机制和靶向ERRα治疗奠定基础.【总页数】4页(P1-4)【作者】孙蓬明;毛晓丹;林芬;蔡良知;吴齐斌;宋一一【作者单位】福建省妇幼保健院妇科肿瘤研究室,福州,350001;福建省妇幼保健院妇科肿瘤研究室,福州,350001;福建省妇幼保健院妇科肿瘤研究室,福州,350001;福建省妇幼保健院妇科肿瘤研究室,福州,350001;福建省妇幼保健院妇科肿瘤研究室,福州,350001;福建省妇幼保健院妇科肿瘤研究室,福州,350001【正文语种】中文【中图分类】R329.2+3;R737.3【相关文献】1.DREAM基因小分子干扰RNA重组腺相关病毒载体的构建与鉴定 [J], 陈敏;项红兵;田玉科2.制备转基因模型小鼠的基础：人白细胞抗原A＊0206基因慢病毒载体构建及鉴定 [J], 张修彦;詹纯列;张晓玉;3.人SET基因小分子干扰RNA重组腺病毒载体的构建与鉴定 [J], 许波群;李瑛;薛凯;李梅;马翔;刁飞扬;崔毓桂;刘嘉茵4.小鼠NR4A1基因小分子干扰RNA重组腺病毒载体的构建与鉴定 [J], 薛凯;李梅;刁飞扬;凌静;崔毓桂;刘嘉茵5.人ClC-2基因小分子干扰RNA真核表达载体的构建和鉴定 [J], 杨翔云;张勇;赖小刚;裴建明;杨安钢;胡玉珍;周士胜因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
hsa-miR-381过表达慢病毒载体的构建、转染和表达
hsa-miR-381过表达慢病毒载体的构建、转染和表达周苏娜;叶文广;崔耀友;梁军;张明鑫【摘要】Objective To construct hsa-miR-381-over-expressed lentivirus vector,and to investigate the regulation effect of miR-381 in esophageal squamous cell carcinoma TE10 cells after transfection.Methods The miR-381 sequence was obtained by PCR amplification,and then inserted into the lentiviral vector LV3 with Green&Puro.The miR-381 sequence was confirmed by double-enzyme cleavage and DNA sequencing and extracted.The recombinant lentivirus plasmid and packaging plasmid pGag/Pol,pRev,and pVSV-G were co-transfected into 293T cells by liposomes.The viral yielded by 293T cell was transfected into TE10 cells.The status of transfection was observed by fluorescence microscope,and the expression of miR-381 was detected by real-time quantitative PCR before and after transfection.Results Restriction enzyme digestion and sequencing results showed that recombinant plasmid was successfully constructed and packaged to lentivirus.The miR-381 sequence was confirmed by restriction enzyme digestion and DNA sequencing,and successfully inserted into the vector.The viral titer was 2 × 108 TU/ml.After transfection,the expression of miR-381 was significantly up-regulated in TE10 cells,and the expression abundance of hsa-miR-381 in TE10-381 increased by 456.05 times.Conclusion The LV3-has-miR-381 lentiviral vector is successfully constructed,and it could significantly increase the miR-381 expression in TE10 cell.%目的构建hsa-miR-381过表达慢病毒载体病毒载体,并对其在食管鳞癌TE10细胞中miR-381表达调节效果进行鉴定. 方法利用PCR法扩增miR-381基因序列,将目的基因miR-381克隆到携带Green&Puro的慢病毒载体LV3中,经双酶切及测序鉴定后大量抽提;利用脂质体将含目的基因的重组质粒和包装质粒pGag/Pol、pRev、pVSV-G共转染293T细胞;用得到的慢病毒转染TE10细胞,通过荧光显微镜观察转染状况,实时荧光定量PCR 分析转染前后miR-381的表达. 结果酶切与测序结果证明成功构建重组质粒,并成功包装成慢病毒,实验组病毒滴度为2×108 TU/ml,空白阴性对照组病毒滴度为2×108 TU/ml.TE10细胞转染过表达慢病毒后miR-381的表达升高,TE10-381组has-miR-381的表达丰度是TE10组的456.05倍. 结论 LV3-hsa-miR-381慢病毒载体构建成功,并能明显增加TE10细胞中miR-381的表达量.【期刊名称】《山西医科大学学报》【年(卷),期】2017(048)003【总页数】5页(P241-245)【关键词】miR-381;慢病毒载体;食管鳞癌;基因转染【作者】周苏娜;叶文广;崔耀友;梁军;张明鑫【作者单位】第四军医大学唐都医院放疗科,西安710061;第四军医大学肿瘤研究所;第四军医大学肿瘤研究所;第四军医大学唐都医院放疗科,西安710061;第四军医大学唐都医院放疗科,西安710061;第四军医大学肿瘤研究所【正文语种】中文【中图分类】Q78食管癌的发病率和致死率在常见肿瘤中分别占第八和第六位，其中食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)在东亚地区占主要地位，约50%的ESCC病例发生在中国[1]。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
慢病毒载体的miRNA载体构建实验服务
1.miRNA是一种21－25nt长的单链小分子RNA, 是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成，miRNA具有高度的保守性、时序性和组织特异性.而且这种特异性和时序性，决定了组织和细胞的功能特异性，表明miRNA在细胞生长和发育过程的调节过程中起多种作用，因此miRNA的研究受到了生物学家的广泛关注。
2.本公司可以将客户研究的miRNA构建到慢病毒载体，生产的病毒颗粒可以直接用于感染细胞或者动物实验。
可以选择将Pri-miRNA或者PremiRNA构建到载体，构建中也可以根据实验需要选用不同的Flank.【晶莱生物】
特点：
1．可以稳定长期的表达miRNA，可以用于筛选稳定细胞模型用于长期的研究和观察。
2．感染效率高而且可以感染绝大部分细胞种类。
3．可以直接用于动物实验或者感染细胞后回输到动物体内。
服务流程：
1.客户提供背景资料，我们共同探讨服务的可行性和技术路线。
2. 实验结束，按合同内容交付结果。
结果交付：
1. 目的基因慢病毒质粒测序文件,测序图谱,质粒结构图,序列比对文件
2. 目的基因慢病毒质粒构建、包装、纯化实验报告
3. 病毒滴度检测报告（病毒滴度≥1 X 108 TU/ml）
4. 功能检测的相关实验报告
注：报告未能详尽的实验相关数据，本公司在能力范围内予以补充
做实验，找晶莱！您的科研生涯，我们一路相伴！
【平台项目开展范围】慢病毒，腺病毒，RNAi类，分子生物实验，病理实验，免疫学实验，细胞实验，动物实验，蛋白组学实验，芯片类实验，并为广大客户朋友们提供课题设计指导、基金申请指导、SCI、核心期刊等服务。