重组蛋白质复性
重组包涵体蛋白质复性
邹平
基因工程技术的发展掀开了人类生命科学研究的崭新篇章，开辟了现代生物工业发展的新纪元。重组DNA技术为大规模生产目标蛋白质提供了可能，E.coli以其易于操作、遗传背景清楚、发酵成本低和蛋白表达水平高等优点，是生产重组蛋白的首选表达系统。但外源基因在E.coli中的高表达常常导致包涵体的形成，如何高效地复性包涵体蛋白是基因工程技术面临的一个难题。随着人类基因组计划的完成和蛋白组计划的实施，人们将会更多地面临这一问题的挑战。
一、包涵体蛋白
1、包涵体的形成
包涵体主要是因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，而无法形成正确的次级键等原因形成的；也可能是外源基因合成速度太快，没有足够的时间进行折叠、二硫键不能正确的配对、过多的蛋白间的非特异性结合、蛋白质无法达到足够的溶解度等；重组蛋白质的一级结构也与包涵体形成有关，一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关；重组蛋白所处的环境不适，发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时易形成包涵体。
2、减少包涵体形成的策略
降低重组菌的生长温度，是减少包涵体形成的最常用的方法。低生长温度降低了无活性聚集体形成的速率和疏水相互作用；细菌生长缓慢溶氧水平低，也可减少包涵体的形成。
在培养重组菌中供给丰富的培养基，创造最佳培养条件，如供氧充足、合适pH等，以减少包涵体的形成。
添加可促进重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂，增加细胞的渗透压。
在低的诱导剂条件下培养重组菌，减少重组蛋白表达量，也可减少包涵体的形成。
利用硫氧还蛋白融合表达或与目标蛋白共表达，得到可溶性目的蛋白。筛选合适的宿主菌，使表达的重组蛋白可溶。
3、包涵体破菌、分离、洗涤
常用高压匀化或机械、化学和酶相结合的方法破碎含包涵体的宿主菌细胞 ,再将破碎液通过低速离心或过滤除去可溶蛋白后获得包涵体。包涵体中除了目的蛋白外还含有脂类、脂多糖、核酸和杂蛋白等成分，而这些成分会影响包涵体蛋白的复性，故去折叠前应洗涤包涵体，以去除杂质。
4、包涵体的溶解去折叠
一般用强的变性剂如尿素、盐酸胍，通过离子间的相互作用，打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键，使多肽伸展。盐酸胍优于尿素，因为盐酸胍是较尿素强的变性剂，
尤其在碱性条件下，它能使尿素不能溶解的包涵体溶解，而且尿素分解的异氰酸盐能导致多
肽链的自由氨基甲酰化。高浓度的变性剂会严重破坏蛋白质的二级结构，产生不可逆变性，导致无法复性。包涵体溶解时要采用尽可能低的变性剂浓度。
极端pH和变温被用来溶解包涵体，以替代高浓度的变性剂。但高pH值会降解蛋白质的
N端。
用去垢剂SDS、TritonX-100、Sarkosyl等，破坏蛋白内的疏水键，溶解包涵体蛋白质。
对于含有半胱氨酸的蛋白质，分离的包涵体中通常含有一些链间和链内的非活性二硫键，需加入还原剂，如巯基乙醇、DTT、二硫赤藓糖醇等破坏二硫键。
当蛋白表达量很高时，包涵体的在位溶解是一种非常有效的方法。但在位溶解会引起许
多杂质成分的释放，导致蛋白质复性的收率下降。
二、包涵体蛋白质的复性折叠机制（几种假说）
蛋白质的一级结构完全包含了形成高级结构的全部信息，其组成中的氨基酸本身的特性
是蛋白质高级结构形成的决定因素和结构基础。多肽链的折叠是一个自发的过程，主要取决
于给定氨基酸的序列，然而伸展肽链折叠为天然活性结构的过程还受到周围环境的影响。
多年来，在蛋白质折叠的研究中存在许多假说，最初的假设都认为折叠步骤为：二级结构小片段形成折叠核，此核再形成功能区域，形成“熔球态”，此后，分子立体结构再做一些局部调整，最终形成正确的立体结构。传统的化学动力学的模型集中研究此中间态转换机制。
近年来关于蛋白的折叠过程和机制的研究很多，多维能量观（Multidimensional energy landscape）学说或折叠漏斗（Folding funnel）比较有代表性。
多维能量观和折叠漏斗的模型可以预测蛋白复性的多动力路径，实验证明蛋白复性是远多
于“熔球态”一个折叠路径的。而统计学的研究则侧重于蛋白向复性状态转换的整体能量观。Dill, K.A的观点，认为蛋白复性更像多个球沿轨道滚落，而不是一个球在平面上漫无目的
的滚动。可用能量和适合度的景观来解释，此能量景观把单个的微观行为和宏观的现象联系
起来，涉及折叠动力学的波动平衡，并发展了新型快速的计算方法。
折叠动力学应用微观理论和模型来研究，这个模型展示了蛋白折叠可用漏斗型的能量景
观来描述(如图1)。漏斗的深度代表稳定构像的侧链相互作用的自由能，而宽度代表侧链的熵。在低的位置，能量景观表示能量更低，更接近天然结构，此时构像就越少。漏斗模型可
以模拟大量的变性分子从不同构像如何快速折叠为一个天然结构，但无法说明能量的屏障作用。
图1：此模型说明蛋白复性的能量景观像漏斗型。
还有研究人员从拓扑学的角度来解释蛋白的折叠过程，认为蛋白质折叠是由其拓扑学性质决定的，在无数空间结构中，具有生理活性的蛋白质结构是唯一的，并且此拓扑结构的熵值最小。熵是度量系统无序度的函数，蛋白质的折叠过程是一个熵值不断减小、从无序的松散肽链到有序的活性蛋白质结构的演变过程。这些构像的拓扑学分析中天然型的构像最稳定，热力学稳定性增加。
三、包涵体蛋白体外复性方法
复性是一个非常复杂的过程，与蛋白质复性的过程控制相关，还很大程度上与蛋白质本身的性质有关。
1、传统方法：
稀释复性：直接加入水或缓冲液，放置过夜，缺点是体积增加较大，变性剂稀释速度太快，不易控制。
透析复性：不增加体积，通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度，易形成无活性蛋白质聚体，且不适合大规模操作，耗时长。
超滤复性：处理样品规模较大，易于对透析速度进行控制，缺点是不适合样品量较少的情况，且有些蛋白可能在超滤过程中产生不可逆的变性，在膜上聚集造成污染。
成功的复性方法是能够在高蛋白浓度下仍能得到较高的复性率。一是把变性蛋白缓慢连续或不连续地加入到复性液中。在两次之间，应有足够的时间间隔使蛋白质折叠通过易聚集的中间体阶段。第二种方法是用温度跳跃策略。变性蛋白在低温下复性折叠以减少聚集，直到易聚集的中间体大都转化为不易聚集的后期中间体后，温度快速升高来促进后期中间体快速折叠。第三种方法是复性在中等的变性剂浓度下进行，变性剂浓度应高到足以有效防止聚集，同时又能够引发正确复性。
2、添加辅助剂的复性方法：
在包涵体蛋白质折叠复性过程中，加入辅助剂能大大促进复性效率。其作用为：稳定正确折叠蛋白质的天然结构、改变错误折叠蛋白质的稳定性、增加折叠复性中间体和非折叠蛋白质的溶解性。通常使用的添加剂有：
（1)共溶剂
如PEG6000-20000，通过与中间体特异而形成非聚集的复合物，可以阻止蛋白质分子间的相互碰撞机会，减少蛋白质的聚集沉淀。
（2)去污剂及表面活性剂
如Trition X-100、SDS、CHAPs、Tween、磷脂、磺基甜菜碱等，对蛋白质复性有促进作用，但能与蛋白质结合形成微束，很难去除。
（3)氧化-还原剂
对于含有二硫键的蛋白，复性过程应促使二硫键形成。方法有：空气氧化法、使用氧化交换系统、混合硫化物法等等。
最常用的氧化交换系统是GSH/GSSG，cysteine/cystine、DTT/GSSG、DTE/GSSG等也应用，氧化还原系统促进不正确形成的二硫键快速交换，提高了正确配对的二硫键的产率[61]；常使用1-3mM还原型巯基试剂，还原型和氧化型巯基试剂的比例常为10：1～5：1。Hevehan认为这一比例关系应需随蛋白质浓度作调整。
空气中的氧是很好的二硫键氧化剂，很多包涵体蛋白成功地利用空气中的氧完成复性。金属离子如Cu、Zn等常被用来作为催化剂。
还有一些特殊的氧化剂被用做控制包涵体蛋白的氧化复性，如：用O-iodosobenzoate 来氧化复性IFN-β，IL-2。
（4)小分子的添加剂
小分子自身并不能加速蛋白质的折叠，而是通过破坏错误折叠中间体的稳定性，或增加折叠中间体和未折叠分子的可溶性来提高复性产率。
如盐酸胍或尿素等，可阻止蛋白聚集；蛋白质的辅因子（如Zn2+或Cu2+）、配基或底物亦起到很好的促折叠作用；加入浓度大于0.4 mol/lTris缓冲液可提高包涵体蛋白质的折叠效率；L-Arg能使不正确折叠的蛋白质结构以及不正确连接的二硫键变得不稳定，使折叠朝着正确的方向进行。；NDSBs可促进蛋白复性，它不属于去垢剂，不形成微束，易于去除；肝素具有稳定天然蛋白质的作用；甘油可以增加黏度，减少分子碰撞的机会以提高复性效率；适量的盐可降低某些带电基团间的斥力，利于蛋白质的折叠；短链醇、高渗物等能有效地降低聚集体的形成，稳定蛋白的作用。
（5)添加分子伴侣和折叠酶
分子伴侣GroE家族的研究很多。有些学者已成功地利用分子伴侣在体内和体外辅助蛋白质复性。也有利用固定化分子伴侣，在体外辅助一些蛋白酶的折叠复性。
还有利用“小分子伴侣”对目标蛋白质进行复性。“小分子伴侣”是GroEL的一个片
段，分子较小，更适合于固定化，不需另加复性辅助因子。
与分子伴侣辅助复性的作用机制相似，环糊精分子对去污剂分子有竞争性吸附作用，去污剂分子被剥离下来，从而使多肽链在此过程中正确折叠为活性蛋白质。
（6)单克隆抗体
待折叠复性的蛋白质的抗体可有效协助复性，但只限与抗体相对应的蛋白才能获得明显的助折叠作用。
（7)使用高压力复性蛋白。
3、液相色谱复性法
液相色谱复性的优点是：在进样后可很快地除去变性剂；色谱固定相对变性蛋白质的吸附可明显的减少、甚至完全消除变性蛋白质分子在脱离变性剂环境后的分子聚集；在蛋白质复性的同时，分离目标蛋白质与杂蛋白，达到纯化的目的。
有资料报道，疏水相互作用色谱（HIC）、离子交换色谱（IEC）、凝胶排阻色谱（SEC）、亲和色谱（AFC）已成功地对变性蛋白进行了复性。色谱法中，SEC的分离效果是最差的，盐酸胍会在IEC柱上保留，与蛋白一起洗脱下来，AFC使用范围窄、所需时间长、价格昂贵，HIC是其中较为理想的。
耿信笃研制成功变性蛋白复性及同时纯化装置。谷振宇等提出用脲梯度SEC复性：在SEC柱中预先制成自上而下脲浓度逐渐降低的梯度。
4、反胶束复性法
蛋白质在反胶束内水相中可以保持其构象和活性，运用相转移技术可以将蛋白质分子包于反胶束内，这样使蛋白质相互分离，减少相互聚集，逐渐降低变性剂的浓度和加入氧化-还原剂，使变性蛋白质复性。
5、双水相复性法
使用硫氰化钠、氯化钠、溴化锂与聚乙二醇构成的双水相系统，PEG具有稳定蛋白质构象的作用、高浓度盐则具有去稳定的作用，这样正确折叠的蛋白质会不断从一相进入到另一相中，直到蛋白质的折叠与去折叠达到一个平衡。
目前对包涵体形成和复性过程中发生聚集的机制尚不十分清楚，每种蛋白质都有自己特有的折叠方式和途径，对某种蛋白质的复性必须反复试验，且没有普遍性。只有利用折叠和聚集的知识才能建立相对优化、适合生产规模的蛋白质复性方法。相信随着结构生物学、生物信息学、蛋白质工程学及相关新技术和新设备的发展和完善，在不久的将来，预测和设计最佳复性方案将成为可能。
（作者单位：厦门伯赛基因转录技术有限公司）
综述改性蛋白质的安全性
综述改性蛋白质的安全性 改性方法主要有物理法、化学法、酶法、生物基因工程法等。 1 化学改性 化学改性实质是通过改变蛋白质的结构、静电荷和疏水基团分布，去除抗营养因子，从而改善大豆蛋白的性质。蛋白质的化学改性可分为两大类，一类是蛋白质分子的特定基团与改性试剂以共价键相连接，即化学衍生化反应，另一类则不存在蛋白质与改性试剂之间的共价键，主要包括亲油化、酸、碱处理等。 最常用的食品蛋白质化学改性方法：乙酸酐和琥珀酸酐作为酰化试剂的酰化作用。它们的作用机理是酰化试剂一般与赖氨酸ε-氨基作用，带正电的氨基被一个中性的酰基残基取代。酰化作用的功能：提高蛋白质的溶解度和水合作用和改进蛋白质的乳化性质。酰化蛋白质的特点：较低的等电点、较高的正极电迁移率、较好的起泡能力、较差的泡沫稳定性、结构较无序、电荷推斥、热稳定性高（主要由前两个决定）。决定酰化蛋白质营养质量的因素：蛋白质的种类、改性的程度、所采用的酰化剂。其他改性方法，如化学磷酸化—利用并入的高亲水性的磷酸基，提高蛋白质在水中的溶解度；温和酸处理—增加蛋白质表面的负电荷、导致蛋白质结构的展开、疏水性残基的暴露—具有较好的溶解度、乳化性质、起泡性质。 化学变化的危害方面需要考虑因素有两个①改性蛋白质和它的消化产物的毒性；②使用的化学试剂以及在蛋白质中任何残留物的毒性。 蛋白质的磷酸化作用是无机磷酸(Pi) 与蛋白质上特定的氧原子(Ser 、Thr 、Tyr 的-OH) 或氮原子(Lys 的ε-氨基、His 咪唑环1 ,3 位N、Arg 的胍基末端N) 形成-C-O-Pi 或-C -N -Pi 的酯化反应。 蛋白质的磷酸化改性可通过化学方法或酶法予以实现。化学磷酸化试剂：磷酰氯(POCl3)、磷酸(H3PO4)、P2O5/ H3PO4、三聚磷酸钠(STP)。 用于蛋白质磷酸化的酶称为蛋白激酶. 蛋白激酶家族包括有约1001 种酶. 蛋白激酶能对蛋白质进行磷酸化修饰,是很有潜力和前途的食品蛋白质改性的工具。常用到的蛋白激酶有依赖于CAMP 激活的蛋白激酶(CAMPdPK)，酪蛋白激酶Ⅱ(CK- Ⅱ)。 磷酸化改性后的蛋白中,由于引进了大量的磷酸根基团,从而增加了蛋白质体系的电负性,提高了蛋白质分子之间的静电斥力,使之在食品体系中更易分散,相互排斥,因而提高了溶解度,聚结稳定性,降低了等电点,而且其净负电荷只有在相当低的pH 环境中才会被中和,故其可有效地拓宽在食品中的应用范围。用三聚磷酸钠改性大豆蛋白的实验结果充分验证了这一结论。但用磷酰氯改性蛋白时其蛋白溶解度反而下降,这是因为用磷酰氯作磷酸化试剂会导致蛋白质分子之间发生交联,这些交联键的存在是导致蛋白水溶解性降低的原因。但用磷酰氯改性蛋白可显著提高蛋白的粘度及胶凝性。磷酸化改性蛋白中由于负电荷的引入大大降低了乳化液的表面张力,使之更易形成乳状液滴,同时也增加了液滴之间的斥力,从而更易分散,因此改性蛋白的乳化能力及乳化稳定性都有较大改善。 从毒理学的观点看,因为没有一种生物可以合成磷酸根离子,而磷酸根离子为所有生物代谢所必需,必须由膳食中取得,所以蛋白质的磷酸化改性是一种较实用、有效的方法。 化学改性也存在很多的限制因素：(1)产品安全性，化学衍生化可定向地改变蛋白质的功能特性，然而这一技术在食品方面的应用却很少，毒性(或安全性)
蛋白质的生物和化学改性
文章编号:1003 7969(2000)06 0181 05 蛋白质的生物和化学改性 周瑞宝1,周 兵2 (1 郑州工程学院食品科学与工程系,450052郑州市嵩山南路140号; 2 郑州油脂化学集团公司,450053郑州市黄河路;第一作者:男,59岁,教授) 摘要:生物酶或化学法改性食品蛋白质,是提高食品功能特性的重要途径。生物酶有酶源易于得到,应用更安全,并且可将蛋白质改性到所期望的功能值;化学法的乙酰化、磷酸化、糖基化、交联反应,在改变结构和功能性方面,对提高蛋白质功能特性比酶法更有效。 关键词:蛋白质;生物酶;化学法;改性 中图分类号:TQ645 9+9 文献标识码:A 1 蛋白质的酶法改性 蛋白质的改性就是用化学因素(如化学试剂、酶制剂等)或物理因素(如热、高频电场、射线、机械振荡等),使氨基酸残基和多钛链发生某种变化,引起蛋白大分子空间结构和理化性质改变,从而获得较好的功能性和营养特性。 用于水解大豆蛋白的酶,包括植物来源的木瓜酶(Papain)、微生物蛋白酶(Alcalase、Neutrase、Ther mitase)和动物蛋白酶(Pepsin、Chymotrypsin)等,都可以用于蛋白质的改性。 1 1 大豆蛋白的部分水解及其功能特性 大量文献列举了蛋白质水解对功能特性的影响,其中包括:植物蛋白的大豆蛋白[1]、蚕豆蛋白、小麦谷朊粉、玉米蛋白、燕麦粉(蛋白)、棉籽蛋白、葵花籽和菜籽蛋白;以及动物蛋白的酪蛋白,都可以进行蛋白酶水解,又称蛋白生物酶改性。 大豆蛋白酶改性[2],对于提高蛋白质的溶解性具有特殊重要性,甚至对于在水中难于分散的谷类蛋白,也是如此。只有使蛋白水解之后,才能显示它的改性意义。玉米蛋白是一种玉米储存蛋白,在pH2~5,具有很高的不溶性,当用胰蛋白酶处理水解使1 9%的肽键断裂时,在同样的pH范围内,溶解度可达30%~50%。而小麦谷朊粉用此法处理,在pH7时,达到9 8%水解度(D H)时,溶解度从7%增加到50%。燕麦粉经Alcalase 或Neutrase酶处理,在等电点(pH5.0)条件下溶解度提高3~4倍[3]。在一定的酶与底物比例条件下,增加水解度(3 8%~ 10 4%),溶解度也同时增加。用Alcalase在pH8,或Neutrase在pH7条件下,使大豆分离蛋白进行有限的蛋白酶水解,会改变它的pH值与溶解曲线图。用Thermitase酶处理蚕豆分离蛋白,使水解度达到8 3%时,在等电的pH值下,溶解度增加高达40%。用Ttaphyloc occus aureus V8蛋白酶水解酪蛋白,水解度达到2%和6 7%时,溶解度增加25%和50%。 大豆蛋白生物改性,可以提高水解蛋白的吸水和结合水的能力。这是由于蛋白水解过程中释放出氨基和羧基,离子基团数量增加。甚至大豆分离蛋白在84%的相对湿度的室温下,其吸水性随酶处理程度成比例增加。酸 沉大豆蛋白和11S大豆球蛋白,用菠萝蛋白酶进行有限蛋白水解后,吸水能力增加2~2 5倍。运用Alcalase或Teutrase处理燕麦粉,随水解度(DH)的升高,吸水能力增加。大豆蛋白质酶改性对蛋白质的乳化能力很敏感。使用木瓜蛋白酶对大豆蛋白进行短时水解,会增加乳化能力,然而,当继续水解时,乳化能力减少。有人发现大豆分离蛋白在水解度(DH)为5%时,乳化特性最佳。蛋白酶改性,也能改善花生蛋白的乳化特性。 用胰蛋白酶部分水解由大豆和蚕豆得到的11S 球蛋白,其中高分子量的水解产物大豆球蛋白 T 和豆球蛋白 T,分别对乳化能力和乳化稳定性,起着关键作用。随着豆蛋白 T的生成,其乳化能力和乳化稳定性增加,当豆蛋白 T被胰酶进一步水解时,乳化能力和乳化稳定性降低。 蛋白酶部分水解时,乳化能力和乳化稳定性的有益作用可能是由于暴露了分子内部掩蔽的疏水基团,改善亲水 疏水平衡,从而提高乳化能力。蛋白质表面失去亲水肽,导致表面疏水作用增加,而有利于表面吸附。过度消化的不利影响,使其失去球状 收稿日期:2000 09 15
蛋白质复性方法
包涵体表达的蛋白的复性 摘要综述了包涵体形成、包涵体分离和溶解、包涵体折叠复性的方法、复性产率低下的主要因素以及通过分子伴侣、低分子量添加物等的应用而提高了蛋白质复性产率。 关键词包涵体蛋白质复性 Abstract Strategies for decreasing the formation of inclusion bodies, isolation and resolution of inclusion bodies, refolding of inclusion body proteins and the cause of decreased refolding yields were included. Renaturation yield of recombinant protein have been improved by using some additives, such as molecular chaperone, small molecules. Key words inclusion body , protein , renaturation 外源基因在大肠杆菌中的高表达常常导致包涵体的形成，虽然包涵体具有富集目标蛋白质、抗蛋白酶、对宿主毒性小等优点，但包涵体蛋白质的复性率一般都很低,而分子伴侣、低分子量添加物等在复性过程中的应用及新的复性方法的建立都大大提高了重组蛋白质复性产率。
一、包涵体： 包涵体的定义、组成与特性： 包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为，具有很高的密度（约ml），无定形，呈非水溶性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。NMR 等新技术的应用表明包涵体具有一定量的二级结构，他们可能在复性的启动阶段中具有一定的作用。[1] 包涵体的形成： 主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。 1.2.1、基因工程菌的表达产率过高，超过了细菌正常的代谢水平，由于细菌的δ因子的蛋白水解能力达到饱和，使之表达产物积累起来。研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快，以
蛋白质复性方法及其注意事项
蛋白质复性方法及其注意事项 蛋白前期准备 (1)査阅U标蛋白相关文献，了解其等电点，标签等注意点。 (2)如果日标蛋白易降解，可在纯化时加l-2mMDTT,全程低温，及时处理. (3 )透析Buffer得选择可参考文献。 蛋白复性 包涵体：在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊得生物大分子，它们 致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性得结构称 为包涵体(Indus! on Bod i es? I B)。 在E、co li中累积得重组蛋白会迅速地以包涵体形式被沉淀出来，这些包 涵体蛋白就是丧失生物活性得不可溶得错误折叠蛋白得聚集体. 包涵体得处理一般包括这么儿步:包涵体得洗涤、溶解、纯化及复性。 如果过表达蛋0在包涵体中，那么通常有两个选择可以考虑：(2)退一步/尤化 表达条件；(2)接受包涵体并采取策略来将蛋白溶解以及复性?这里主要考虑第二 种方案。 包涵体得洗涤 破碎细胞都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物 降解，导致天然物质量得减少,加入蛋0酶抑制剂等，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于U得物质得提取。 2mM EDTA, 2mM D 洗涤Buf f e r :50mM T r i s -H CI (pH8、0), TJr 1 5 0 mM NaCI, l%Tn t on X—1 0 0, Img/ml Lwupe p t in^ Img/ml P epstat in, ImM TCER 超声时用40— 6 0 ml裂解液'因为我们得超声仪很适合用1 0 0 ml小烧 杯，装4 0-60m I裂解液，这样能让超声头离液面不高不低，不会洒出来、菌 多就延长超声时间(全程冰浴)? 包涵体得溶解 I、对于尿素与盐酸M得选择: 尿素与盐酸属中强度变性剂，易经透析与超滤除去。它们对包涵体氢键有
蛋白质改性研究与应用进度
蛋白质改性研究与应用进度 宋英皓江南大学食品与科学学院 摘要:介绍蛋白质的功能特性,以及物理、化学、摘要介绍蛋白质的功能特性, 以及物理、化学、酶法等各种改性方法及其对蛋白质功能特性和营养安全性的影响,展望蛋白质改性的应用前景. Abstract Various protein modification methods including physical chemical，enzymatic methods and the effect of modification to its functional properties Nutritional value and safety were studied. The prospect application was also predicted. Keyword Functional properties Modification Nutritional value Safety Application 蛋白质具有营养功能,添加到食品中可以有效地提高产品的营养价值,更重要的是蛋白质在食品中可以体现出不同的功能特性,影响食品的感官特性,而且对食品在制造、加工或保藏中的物理化学性质起着重要的作用。因此蛋白质广泛用于食品加工的各个领域。但是,不少天然蛋白质的这些特性尚不突出,不能满足现代食品开发与加工的需要,往往通过特定的方法来提高其功能特性,使其应用领域更广阔。 1蛋白质的功能特性 蛋白质的功能性质主要分三类:(l)水化性质,包括水吸收及保留、湿润性、溶胀、粘着性、分散性、溶解度和粘度。由蛋白质肤链骨架上的极性基团与水分子发生水化作用。(2)与蛋白质一蛋白质相互作用有关的性质,包括产生沉淀作用、凝胶作用和形成各种其它结构(如蛋白质面团和纤维)。蛋白质分子受热舒展,内部的疏水基团暴露出来,通过疏水作用(高温能提高此类作用)、静电作用(通过ca,·和其它二价离子桥接的)、氢键(冷却能提高此类作用)或二硫交联形 成空间网状结构。(3)表面活性,包括表面张力、乳化作用和泡沫特征。蛋白质结构中既有亲水基又有亲油基,能够吸附在油一水或空气一水界面上,一旦被界面吸附,蛋白质 形成一层膜,可阻止小液滴或气泡聚集,有 助于稳定乳化液和气泡。这些功能特性 在食品中常被应用。蛋白质的功能特性与其结构有关,即氨基酸组成、排列顺序、构象、分子的形状和大小、电荷分布以及分子内和分子间键的作用。高比例的极性残基影响肤链间相互作用、水化作用、溶解性和表面活性,疏水性相互作用在蛋白质三级折叠中相当重要,它影响乳化作用、起泡性和风味结合能力。带电氨基酸能增强静力相互作用,起到稳定球蛋白,结合水分的作用,以及水 化作用、溶解度、凝胶作用和表面活性。琉基(SH)能被氧化形成二硫键,硫醇和二硫化物的相互转化会影响流变性。共价键和非共价键的性质和数量决定了蛋白质的大小、形状、表面电荷“,。所有这些性质又受PH、温度等环境因素及加工处理的影响。 2蛋白质改性 2.1物理改性 改变蛋白质功能特性的物理方法有机械处理、挤压、冷冻等。蛋白质粉末或浓缩物彻底干磨后会产生小粒子和大表面的粉末,与未研磨的试样相比,水吸收、蛋白质的溶解度、脂肪吸收和起泡性质都得到了改进;在乳的均质过程中,蛋白质悬浊液受到强烈剪切力使蛋白质聚集体(胶束)碎裂成亚基, 从而提高蛋白质的乳化能力川。挤压处理时蛋白质在高温高压下受定向力的作用而定 向排烈压力的释放,水分的瞬时蒸发,形成 具有耐嚼性和良好口感的纤维状蛋白质。将蛋白质溶液以一定速率冷却,会产生垂直于冷却表面的冰晶,使蛋白质定向排列并在冰晶空隙中被浓缩,移去水分可得到结构完整的蛋白质。 2.2化学改性 2.2.1酸、碱、盐作用下的改性 蛋白质经酸、碱部分水解可改进其功能特性,如溶解性、乳化能力、起泡性等,并能钝化酶活力,破坏毒素、酶抑制剂和过敏原,但往往会造成营养价值下降。P-乳球蛋白和乳清蛋白在酸性或微碱性中热展开,提高了它的增稠、凝胶、起泡和乳化性质。在适当pH
蛋白质介绍
[本次授课内容] 第6章蛋白质 6.4食品加工贮藏中蛋白质的变化与蛋白质的改性 ＃ 6.5食品蛋白质含量的测定 重点：加工对营养及功能特性的影响、改善营养及功能特性的方法 6.4 食品加工贮藏中蛋白质的变化 6.4.1 食品加工贮藏中蛋白质的变化 6.4.1.1 热处理中的变化 热处理是许多食品，尤其是蛋白食品的加工常用的杀菌方法，也是一些食品加工中所必须的工艺步骤。多数食品蛋白质只能在窄狭的温度范围内（60-90℃，1h或更短时间）才具有生物活性或功能性。 ○加热对蛋白质理化性质的直接影响：蛋白质结构变得松散、某些次级键的断裂、变性失活等。而加热的程度（温度、时间）及其它因素的协同作用、蛋白质的种类等又是蛋白质变性程度的决定因素，其中有些变化有利于营养、功能特性的提高，另一些变化则属于劣变。 （1）有利变化始终保持适度热处理，既不会破坏共价键也不至于形成新的共价键，不影响蛋白质的一级结构。从营养学的观点讲，蛋白质对温和热处理所产生的变化一般是有利的。 ①大多数蛋白质在加热后营养价值得到提高。因为适宜的加热使蛋白质变性后，原有的紧密结构变得松散、伸展，进入人体易为消化酶所水解，从而提高消化率，营养价值也相应提高。 ②某些植物蛋白所含的抗营养因子－蛋白酶抑制剂（胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶）、凝集素（致血红细胞凝集）等在加热中被钝化失活。从而提高蛋白质食品的安全性和营养价值，如豆科植物蛋白的热加工处理。 ③热处理是常用的杀菌方法。微生物的机体蛋白因热处理变性失活，达到杀菌目的，可防止微生物引起的食品腐败变质。 33
34 ④ 热处理还可钝化食品中存在的某些可能引起食品的色泽、质地、风味等发生非需宜改变的酶。如，酶促褐变、引起豆腥味的LOX ），从而保持良好的风味及外观品质。 （2）不利变化 A 、过度加热会导致氨基酸特别是必需氨基酸（蛋与胱、赖AA ）的损失。因蛋白质因热分解或聚合致使营养价值下降。 ① 脱硫：T-115℃～27h ，某些AA 残基（胱氨酸与蛋氨酸——含硫EAA ），会有一半以上的 胱氨酸发生脱硫化氢反应。既损害营养，也引起功能性质的改变； ② 脱酰胺：T>100℃，蛋白质中Gln ，Asn 残基脱除酰胺基-NH 2。尽管不损害营养，但环境 中-NH 2会导致蛋白质电荷和功能性质的改变； ③ 异构化：T>200℃，色氨酸发生异构化，生成环状衍生物。其中包括致突变物质，某些氨 基酸由L-型转变为D-型而失去营养价值，甚至具有毒性； ④ 交联反应：T>150℃，蛋白质中赖氨酸的ε－NH 2参与形成新的肽键-交联肽键。如Lys 与 Asp 、Glu 反应，失去赖氨酸的营养价值，新生成的肽链可能对人体有毒； NH CH CO (CH 2)4NH CO (CH )22CH CO ε-N （γ-谷氨酰基）-L-赖氨酰基 ⑤ 羰氨反应：当还原糖存在时，在普通条件下即可发生的羰氨反应，因加热可加速进行。色、 精、苏、组等均易发生，Lys 中ε－NH 2更易发生该反应，形成不易为酶消化水解的希夫碱，失去EAA 的营养价值并同时导致外观褐变，遇有蔗糖水解、脂肪氧化产物均可提供羰基发生该反应；当然，同时可对面粉焙烤食品起到需宜性的呈色效果。 ⑥ 热分解：T>200℃以上时（如烧烤食品表面温度），蛋白质发生热分解。可能产生诱变化合CH 3 2NH N N N N CH 3N N CH 3NH 23CH CH 32NH N N N
重组蛋白包含体的复性
重组蛋白包含体的复性 [摘要]：重组蛋白在大肠杆菌中的高表达往往导致形成包含体。不可溶、无生物活性的包含体必须经过体外变复性才可得到生物活性蛋白。变复性实验是建立在蛋白质体外折叠机制的基础上的。近年来，随着对蛋白质折叠机制的认识，发展了不少促进蛋白折叠和二硫键氧化来提高活性蛋白产率的复性办法。 [关键词]：蛋白折叠、包含体、复性、二硫键形成 Abstract：Expression of recombinant proteins in Escherichia coli often results in the formation of insoluble inclusion bodies. Active protein can be recovered by solubilization of inclusion bodies followed by renaturation of the solubilized protein. The process of renaturation is established in the understanding to the mechanism of protein folding in vitro. In recent years, With the understanding of mechanisms of protein folding, many renaturation methods were developed, which can increase the yield of active proteins. Key word: protein folding、inclusion body 、renaturation 、the forming of disulfide bond 大肠杆菌表达系统以其操作简便，遗传背景清楚，大规模发酵成本低成为目前最常用的外源蛋白表达系统。它为许多具有药用和工业应用价值的真核生物蛋白质的获得提供了方便。但是，重组蛋白的高表达往往导致形成不溶的、没有生物活性的包含体（如人生长激素、人胰岛素和尿激酶）。 包含体的形成意味可溶性重组蛋白质的重大损失，必须经过体外变复性才能得到生物活性蛋白。如果能解决包含体的复性问题，它将是大量生产重组蛋白的最有效的途径之一。近年来对蛋白质折叠过程的深入研究使重组蛋白的体外复性取得了一系列的新进展。文章中，我们在蛋白质折叠机制的基础上，简述了重组蛋白体外复性的研究进展。 1. 蛋白质的体内折叠 细胞内的新生肽链的折叠是分阶段的，从相邻氨基酸的相互作用开始，多肽链的出现引起二级结构的形成，最后形成三级结构。Baldwin综述了蛋白质折叠起始的三种可能因素：疏水作用，二级结构及某些特殊作用力(如二硫键)[1]。实验证明，细胞内二硫键的形成速度要明显快于细胞外，而且在翻译结束之前二硫键也能够形成[2]。 近年来的一些研究表明，很多真核蛋白质的折叠和装配受到其他蛋白或酶的严格调控。在真核细胞中，蛋白可能与分子伴侣（chaperon）或折叠酶（foldase）共表达且表达量很低；也可能进行翻译后修饰分泌出去。现在已知的参与新生肽链折叠的蛋白有两类：一类是催化蛋白特定异构化的酶，限制蛋白质折叠的速度，如催化正确二硫键形成的二硫键异构酶（PDI蛋白）[3]、催化脯氨酸异构反应的脯氨酸顺反异构酶（PPI）[4]等，它们称为折叠酶，另一类辅助蛋白能与多肽链短暂暴露疏水区结合，从而防止不正确的聚集作用和错误的装配，称为分子伴侣。 重组蛋白在大肠杆菌中的折叠环境迥异于它们的天然环境－－真核细胞。蛋白酶、氧化还原电位、PH和蛋白浓度等性质都不同[5]，而且，原核细胞不具备糖基化的功能，也没有
蛋白质、包涵体复性
目录 一、脲和盐酸胍在包涵体蛋白质纯化中的作用 二、包涵体变复性 三、包涵体洗涤纯化——7~10 四、包涵体提出、纯化和复性
一、
二、包涵体变复性 包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等。 基本信息 中文名称 包涵体变复性 复性方法 稀释复性 原因 基因工程菌的表达产率过高 包涵体变性 破菌洗涤溶解 目录 1包涵体 2包涵体变性 3包涵体复性 包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1μm，具有很高的密度(约1.3mg/mL)，无定形，呈非水溶性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。NMR等新技术的应用表明包涵体具有一定量的二级结构，他们可能在复性的启动阶段中具有一定的作用。 包涵体的形成原因 主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。 1.基因工程菌的表达产率过高，超过了细菌正常的代谢水平，由于细菌的δ因子的蛋白水解能力达到饱和，使之表达产物积累起来。研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。 2.重组蛋白的氨基酸组成:一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。 3.重组蛋白所处的环境:发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。 4.重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类和辅助因子，如折叠酶和分子伴侣等，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。
蛋白质的改性论文
蛋白质的改性 摘要：介绍蛋白质的功能特性，以及物理、化学、摘要介绍蛋白质的功能特性，以及物理、化学、酶法等各种改性方法及其对蛋白质功能特性和营养安全性的影响，展望蛋白质改性的应用前景。 0 前言 蛋白质具有营养功能，添加到食品中可以有效地提高产品的营养价值，更重要的是蛋白质在食品中可以体现出不同的功能特性，影响食品的感官特性，而且对食品在制造、加工或保藏中的物理化学性质起着重要的作用。因此蛋白质广泛用于食品加工的各个领域。但是，不少天然蛋白质的这些特性尚不突出，不能满足现代食品开发与加工的需要，往往通过特定的方法来提高其功能特性，使其应用领域更广阔。 1 蛋白质的功能特性 蛋白质的功能性质主要分三类: (l)水化性质，包括水吸收及保留、湿润性、溶胀、粘着性、分散性、溶解度和粘度。由蛋白质肤链骨架上的极性基团与水分子发生水化作用。 (2)与蛋白质一蛋白质相互作用有关的性质，包括产生沉淀作用、凝胶作用和形成各种其它结构(如蛋白质面团和纤维)。蛋白质分子受热舒展，内部的疏水基团暴露出来，通过疏水作用(高温能提高此类作用)、静电作用(通过ca和其它二价离子桥接的)、氢键(冷却能提高此类作用)或二硫交联形成空间网状结构。 (3)表面活性，包括表面张力、乳化作用和泡沫特征。蛋白质结构中既有亲水基又有亲油基，能够吸附在油一水或空气一水界面上，一旦被界面吸附，蛋白质形成一层膜，可阻止小液滴或气泡聚集，有助于稳定乳化液和气泡。这些功能特性在食品中常被应用。 (4)蛋白质的功能特性与其结构有关，即氨基酸组成、排列顺序、构象、分子的形状和大小、电荷分布以及分子内和分子间键的作用。高比例的极性残基影响肤链间相互作用、水化作用、溶解性和表面活性，疏水性相互作用在蛋白质三级折叠中相当重要，它影响乳化作用、起泡性和风味结合能力。带电氨基酸能增强静力相互作用，起到稳定球蛋白，结合水分的作用，以及水化作用、溶解度、凝胶作用和表面活性。琉基(SH)能被氧化形成二硫键，硫醇和二硫化物的相互转化会影响流变性。共价键和非共价键的性质和数量决定了蛋白质的大小、形状、表面电荷。所有这些性质又受PH、温度等环境因素及加工处理的影响。 2蛋白质改性 2.1物理改性 所谓蛋白质物理改性是指利用热、机械振荡、电磁场、射线等物理作用形式改变蛋白质的高级结构和分子间的聚集方式, 一般不涉及蛋白质的一级结构。如蒸煮、搅打等均属于物理改性技术。
蛋白质变复性
变复性的过程 E.coli 中表达的蛋白常常以包涵体的形式沉积于细胞内,表现为无活性的不溶性聚集物。 生产研究中为了得到较高的目的蛋白的表达量，通常会采用较强的启动子(如λPL 、T7 或串联启动子) ,使外源基因可在胞内获得高效表达,一般占细菌总蛋白的10 %～50 %. 然而胞内表达的最大问题是产物形成不溶性的包涵体,虽然这可为后续的分离纯化带来方便,但包涵体必须经过体外复性才有可能获得生物活性 .绝大部分高表达的重组蛋白质往往聚集成不溶的、无活性的包涵体形式, 极大地影响到后续的结构分析和活性研究工作, 开展对这些包涵体的复性工作已成为一个重要的研究方向。 包涵体是由蛋白质折叠中间体的聚集而形成的,任何影响中间体稳定的因素(如pH 值、离子强度、温度等) 都可导致包涵体的形成. 包涵体形成原因 1. 表达量过高，研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。 2. 重组蛋白的氨基酸组成，一般说来含硫氨基酸越多越容易形成包涵体。 3. 重组蛋白所处的环境，发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。 4. 重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺少真核生物中翻译后修饰所需酶类，致使中间 体大量积累，容易形成包涵体沉淀。 5. 有报道认为，丰富的培养基有利于活性蛋白质的表达，当培养条件不佳时，容易形成包涵体。 蛋白复性的必要性 细胞中的生物学活性蛋白质常以可融性或分子复合物的形式存在，功能性的蛋白质总是折叠成特定的三维结构型。包涵体内的蛋白是非折叠状态的聚集体，不具有生物学活性，因此要获得具有生物学活性的蛋白质必须将包涵体溶解，释放出其中的蛋白质，并进行蛋白质的复性。复性过程是变性蛋白的重折叠过程。 对包涵体蛋白复性,应先对包涵体进行分离纯化及去折叠（即变性溶解) ,然后采用合适的复性方法促进变性，蛋白再折叠进而恢复活性. 一．包涵体的分离纯化 ①含包涵体的宿主菌细胞的破碎； ②将破碎液离心除去可溶蛋白（9000r 15min 4℃），获得包涵体； ③洗涤包涵体,以除去包涵体上粘附的杂质，如膜蛋白或核酸，应用洗涤液洗涤包涵体，通常用低浓度的变性剂,过高浓度的尿素或盐酸胍会使包涵体溶解，如2M尿素在50mM Tris pH7.0-8.5左右,1mM EDTA中洗涤，温和去垢剂TritonX-100等洗涤包涵体,然后离心（12000r 5min 4℃）取上清洗涤后包涵体的主要成分为聚合态的目的蛋白。
蛋白质变性机理
蛋白质变性机理 1、蛋白质介绍 2、蛋白质变性结果 1)活性丧失 蛋白质的生物活性是指蛋白质所具有的酶、激素、毒素、抗原与抗体、血红蛋白的载氧能力等生物学功能。生物活性丧失是蛋白质变性的主要特征。有时蛋白质的空间结构只要轻微变化即可引起生物活性的丧失。 2）某些理化性质的改变 蛋白质变性后理化性质发生改变，如溶解度降低而产生沉淀，因为有些原来在分子内部的疏水基团由于结构松散而暴露出来, 分子的不对称性增加，因此粘度增加，扩散系数降低 蛋白质分子凝聚从溶液中析出
3）生物化学性质的改变 蛋白质变性后，分子结构松散，不能形成结晶，易被蛋白酶水解。蛋白质的变性作用主要是由于蛋白质分子内部的结构被破坏。天然蛋白质的空间结构是通过氢键等次级键维持的，而变性后次级键被破坏，蛋白质分子就从原来有序的卷曲的紧密结构变为无序的松散的伸展状结构（但一级结构并未改变）。所以，原来处于分子内部的疏水基团大量暴露在分子表面，而亲水基团在表面的分布则相对减少，至使蛋白质颗粒不能与水相溶而失去水膜，很容易引起分子间相互碰撞而聚集沉淀。 4）致变因素 引起蛋白质变性的原因可分为物理和化学因素两类。物理因素可以是加热、加压、脱水、搅拌、振荡、紫外线照射、超声波的作用等；化学因素有强酸、强碱、尿素、重金属盐、十二烷基磺酸钠(SDS)等。在临床医学上，变性因素常被应用于消毒及灭菌。 反之，注意防止蛋白质变性就能有效地保存蛋白质制剂。蛋白质的变性很复杂，要判断变性是物理变化还是化学变化，要视是物理变化 加热、紫外线照射、剧烈振荡等物理方法使蛋白质变性，主要是破坏蛋白质分子中的氢键，在变化过程中也没有化学键的断裂和生成，没有新物质生成，因此是物理变化。 否则，鸡蛋煮熟后就不是蛋白质了。而我们知道，熟鸡蛋依然有营养价值，其中的蛋白质反而更易为人体消化系统所分解吸收。 5）复性
蛋白质结构与功能的关系
蛋白质结构与功能的关系 专业：植物学 摘要：蛋白质特定的功能都是由其特定的构象所决定的，各种蛋白质特定的构象又与其一级结构密切相关。天然蛋白质的构象一旦发生变化，必然会影响到它的生物活性。由于蛋白质的构象的变化引起蛋白质功能变化，可能导致蛋白质构象紊乱症，当然也能引起生物体对环境的适应性增强。而分子模拟技术为蛋白质的研究提供了一种崭新的手段。在理论上解决了结构预测和功能分析以及蛋白质工程实施方面所面临的难题。它在蛋白质的结构预测和模建工作中占有举足轻重的地位，实现了生物技术与计算机技术的完美结合。 关键词：蛋白质的结构、功能；折叠/功能关系；蛋白质构象紊乱症；分子模拟技术；同源建模 RNase是由124个氨基酸残基组成的单肽链，分子中 8 个Cys的-SH构成4对二硫键，形成具有一定空间构象的蛋白质分子。在蛋白质变性剂和一些还原剂存在下，酶分子中的二硫键全部被还原，酶的空间结构破坏，肽链完全伸展，酶的催化活性完全丧失。当用透析的方法除去变性剂和巯基乙醇后，发现酶大部分活性恢复，所有的二硫键准确无误地恢复原来状态。若用其他的方法改变分子中二硫键的配对方式，酶完全丧失活性。这个实验表明，蛋白质的一级结构决定它的空间结构，而特定的空间结构是蛋白质具有生物活性的保证。前体与活性蛋白质一级结构的关系，由108个氨基酸残基构成的前胰岛素原，在合成的时候完全没有活性，当切去N-端的24个氨基酸信号肽，形成84个氨基酸的胰岛素原，胰岛素原也没活性，在包装分泌时，A、B链之间的33个氨基酸残基被切除，才形成具有活性的胰岛素。 功能不同的蛋白质总是有着不同的序列；种属来源不同而功能相同的蛋白质的一级结构，可能有某些差异，但与功能相关的结构也总是相同。若一级结构变化，蛋白质的功能可能发生很大的变化。蛋白质特定的功能都是由其特定的构象所决定的，各种蛋白质特定的构象又与其一级结构密切相关。天然蛋白质的构象一旦发生变化，必然会影响到它的生物活性。由于蛋白质的构象的变化引起蛋白质功能变化，可能导致蛋白质构象紊乱症，当然也能引起生物体对环境的适应性增强。 虽然蛋白质结构与生物功能的关系比序列与功能的关系更加紧密，但结构与功能的这种关联亦若隐若现，并不能排除折叠差别悬殊的蛋白质执行相似的功能，折叠相似的蛋白质执行差别悬殊功能的现象的存在。无奈，该领域仍不得不将100多年前Fisher提出的“锁一钥
包涵体的复性
外源基因在大肠杆菌中的高表达常常导致包涵体的形成，虽然包涵体具有富集目标蛋白质、抗蛋白酶、对宿主毒性小等优点，但包涵体蛋白质的复性率一般都很低,而分子伴侣、低分子量添加物等在复性过程中的应用及新的复性方法的建立都大大提高了重组蛋白质复性产率。 一、包涵体： 1.1包涵体的定义、组成与特性： 包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，具有很高的密度（约1.3mg/ml），无定形，呈非水溶性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。NMR等新技术的应用表明包涵体具有一定量的二级结构，他们可能在复性的启动阶段中具有一定的作用。[1] 1.2包涵体的形成： 主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。 1.2.1、基因工程菌的表达产率过高，超过了细菌正常的代谢水平，由于细菌的δ因子的蛋白水解能力达到饱和，使之表达产物积累起来。研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。 1.2.2、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。 1.2.3、重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。 1.2.4、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类和辅助因子，如折叠酶和分子伴侣等，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。 1.2.5、蛋白质在合成之后，于中性pH或接近中性pH的环境下，其本身固有的溶解度对于包涵体的形成比较关键，即是说，有的表达产率很高，如Aspartase和Cyanase,表达产率达菌体蛋白的30%,也不形成包涵体，而以可溶形式出现。[2] 1.2.6、在细菌分泌的某个阶段，蛋白质分子间的离子键、疏水键或共价键等化学作用导致了包涵体的形成。 1.3包涵体破菌、分离、洗涤及溶解 1.3.1基因工程菌发酵液，经离心浓缩后，可用：机械破碎、超声破碎：单纯超声破碎，在小规模下且菌量较少的情况下效果较好，由于能量传递和局部产热等原因，很难用于大体积细胞悬液的破碎，这样部分未破碎细胞与包涵体混在一起，给后期纯化带来困难。因此，在较大规模纯化时先用溶菌酶破碎细菌的细胞膜，再结合超声破碎方法，可显著提高包涵体的纯度和回收率。以及化学方法破碎使细菌裂解,然后以5000-20000g 15min离心，可使大多数包涵体沉淀，与可溶性蛋白分离。 1.3.2洗涤：为了除去包涵体上粘附的杂质，如膜蛋白或核酸，应用洗涤液洗涤包涵体，通常用低浓度的变性剂,过高浓度的尿素或盐酸胍会使包涵体溶解，如2M尿素在50mM Tris pH7.0-8.5左右,1mM EDTA中洗涤。此外可以用温和去垢剂TritonX-100洗涤去除膜碎片和膜蛋白。[3] 1.3.3溶解：一般用强的变性剂如尿素（6-8M）、盐酸胍（GdnHCl 6M），通过离子间的相互作用，打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键，使多肽伸展，一般来讲，盐酸胍优于尿素，因为盐酸胍是较尿素强的变性剂，它能使尿素不能溶解的包涵体溶解，而且尿素分解的异氰酸盐能导致多肽链的自由氨基甲酰化，特别是在碱性pH值下长期保温时。或用去垢剂，如SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物、Sarkosyl等，可以破坏蛋白内的疏水键，也可溶解一些包涵体蛋白质。Kandula Suntha等人用TritonX-100来溶解Zymononas mobilis levansucrase包涵体蛋白。另外，
重组蛋白质复性
重组包涵体蛋白质复性 邹平 基因工程技术的发展掀开了人类生命科学研究的崭新篇章，开辟了现代生物工业发展的新纪元。重组DNA技术为大规模生产目标蛋白质提供了可能，E.coli以其易于操作、遗传背景清楚、发酵成本低和蛋白表达水平高等优点，是生产重组蛋白的首选表达系统。但外源基因在E.coli中的高表达常常导致包涵体的形成，如何高效地复性包涵体蛋白是基因工程技术面临的一个难题。随着人类基因组计划的完成和蛋白组计划的实施，人们将会更多地面临这一问题的挑战。 一、包涵体蛋白 1、包涵体的形成 包涵体主要是因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，而无法形成正确的次级键等原因形成的；也可能是外源基因合成速度太快，没有足够的时间进行折叠、二硫键不能正确的配对、过多的蛋白间的非特异性结合、蛋白质无法达到足够的溶解度等；重组蛋白质的一级结构也与包涵体形成有关，一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关；重组蛋白所处的环境不适，发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时易形成包涵体。 2、减少包涵体形成的策略 降低重组菌的生长温度，是减少包涵体形成的最常用的方法。低生长温度降低了无活性聚集体形成的速率和疏水相互作用；细菌生长缓慢溶氧水平低，也可减少包涵体的形成。 在培养重组菌中供给丰富的培养基，创造最佳培养条件，如供氧充足、合适pH等，以减少包涵体的形成。 添加可促进重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂，增加细胞的渗透压。 在低的诱导剂条件下培养重组菌，减少重组蛋白表达量，也可减少包涵体的形成。 利用硫氧还蛋白融合表达或与目标蛋白共表达，得到可溶性目的蛋白。筛选合适的宿主菌，使表达的重组蛋白可溶。 3、包涵体破菌、分离、洗涤 常用高压匀化或机械、化学和酶相结合的方法破碎含包涵体的宿主菌细胞 ,再将破碎液通过低速离心或过滤除去可溶蛋白后获得包涵体。包涵体中除了目的蛋白外还含有脂类、脂多糖、核酸和杂蛋白等成分，而这些成分会影响包涵体蛋白的复性，故去折叠前应洗涤包涵体，以去除杂质。 4、包涵体的溶解去折叠 一般用强的变性剂如尿素、盐酸胍，通过离子间的相互作用，打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键，使多肽伸展。盐酸胍优于尿素，因为盐酸胍是较尿素强的变性剂，
包涵体蛋白溶解和纯化复性
IFN-α重组蛋白包涵体溶解和蛋白纯化复性 一、表达产物处理 1、表达菌液8000rpm 4℃离心10min 2、菌体沉淀按10:1（菌重5g，加50ml）裂解缓冲液，冰上超声至清亮（250W，超声5s，间歇5s，功率35%） 3、取样取100ul 超声菌液并离心，标记超声上清，超声沉淀 4、12000g 4℃离心15min，上清备用，标记超声上清 5、超声沉淀用含2M 尿素的裂解缓冲液，以20:1 比例重悬，继续超声5min 6、12000g 4℃离心20min 7、超声沉淀用含1% Triton X-100 的裂解缓冲液重悬，4℃放置10min 8、12000g 4℃离心15min，获得包涵体 9、获得包涵体用Binding Bufer 重悬，4℃放置过夜 二、包涵体的纯化 1、放置过夜包涵体4℃高速离心，收集上清备用 2、取样取离心上清，标记柱前 3、使用Ni-NTA 基质进行纯化，用Binding Buffer 平衡Ni 柱，柱子平衡后低流速上样，整个上样过程使样品处于冰上，上样后用3~5 个柱体积的Wash Buffer 进行漂洗，最后用Elution Buffer 洗脱 4、取样取柱后，标记柱后 三、包涵体复性 1、透析袋处理方法：把透析袋剪成适当长度（10~20cm）小段，在大体积的2% （W/V）NaHCO 3 和1mM EDTA (PH8.0)中将透析袋煮沸10min。用蒸馏水彻底清洗透析袋。放在1mM EDTA(PH8.0)中将之煮沸10min。冷却后存放于4℃，必须确保透析袋始终浸没在溶液内。从此时起取用透析袋时必须戴手套保持清洁，用前在透析袋内装满水然后排出，将之清洗干净 2、复性采用梯度透析法，纯化后包涵体用含4M 尿素的透析缓冲液稀释蛋白浓度至约
重组蛋白的表达
重组蛋白的概述 1.概述 分离纯化组成了基因工程的下游处理（downstream processing）阶段，这一过程又和上游过程紧密相联系，上游过程的诸方面影响到下游的分离纯化，所以在进行目标蛋白质表达纯化时要统一考虑和整体设计，并充分考虑上游因素对下游的影响，如是否带有亲和标签，是否进行分泌表达。目前应用最广泛的表达系统有三大类，分别是大肠杆菌表达系统、酵母表达系统和CHO细胞表达系统，不同的表达系统和培养方法显著影响下游的处理过程，目标蛋白表达是否形成包涵体，目标蛋白表达的定位（胞内、细胞内膜、周质空间和胞外），蛋白表达的量都依赖于所选择的表达系统。选择将所表达的蛋白分泌到细胞外或周质空间可以避免破碎细胞的步骤，并且由于蛋白质种类少，目标蛋白容易纯化；而在细胞质内表达蛋白，可能是可溶性表达，可能形成包涵体，可溶性的蛋白往往需要复杂的纯化步骤，而包涵体易于分离，纯度较高，但回收具有生物活性的蛋白却变的相当困难，需要对聚集的蛋白进行变复性，通常活性蛋白的得率比较低，表1列出了不同策略对表达、纯化的影响，对于其中的有些缺点可以通过一定的方法进行克服和避免，如利用DNA重组技术给外源蛋白加上一个亲和纯化的标签，有助于可溶性外源蛋白的选择性纯化，并能保护目标蛋白不被降解（96）。 表 1 重组蛋白不同表达策略的优点和缺点 表达策略优点缺点 分泌表达至细胞外增强正确二硫键的形成 降低蛋白酶对表达蛋白的降解 可获得确定的N末端 显著减少杂蛋白水平，简化纯化 不需要细胞破碎 表达水平低 多数蛋白不能进行分泌表达表达蛋白需要进行浓缩 细胞周质空间表达增强正确二硫键的形成 可获得确定的N末端 显著减少杂蛋白水平，简化纯化好些蛋白不能分泌进入周质空间没有大规模选择性的释放周质空 间蛋白的技术 周质蛋白酶可引起重组蛋白酶解 胞内包涵体表达包涵体易于分离 保护蛋白质不被降解 蛋白质不具有活性对宿主细胞生 长没有大的影响，通常可获得高的 表达水平需要体外的折叠和溶解，得率较低具有不确定N末端 胞内可溶性蛋白表达不需要体外溶解和折叠 一般具有正确的结构和功能高水平的表达常难以得到需要复杂的纯化 可发生蛋白质的酶解具有不确定的N末端 在细胞的提取物中，除了目标蛋白外，还含有其它各种性质的蛋白、核酸、多糖等。在这样一个混合体系中，蛋白质纯化要求将目标蛋白与其它的成分分离，得到一定的量，达到一定的纯度，同时要尽可能保留蛋白的生物活性，并使蛋白保持完整。所以蛋白质的分离纯化可以看作是一系列的分部收集过程，总是希望目标蛋白富集于其中的一个收集部位，而大量的杂蛋白存在于其它的收集部位。当然对目标蛋白纯度的要求要根据纯化蛋白的用途而定，对于治疗性的蛋白要求有大于99%的纯度，并对处方有活性和稳定性的要求，对于某些酶的纯度则要求较低，需要在纯度和得率之间进行一个平衡，所以下游的工艺流程取决于最终对目标蛋白的要求。 蛋白质的功能依赖于蛋白质的结构，对于有生物活性的蛋白质，在分离纯化过程中必须根据目标蛋白的特点，采用合适的操作条件和方法，保证目标蛋白的活性尽量不损失。除了在分离纯化的