非蛋白氮的定量检验
常用饲料原料的掺假及其鉴别
湖南饲料!""#年第!期常用饲料原料的掺假及其鉴别湖南省兽药饲料监察所陈福华随着饲料工业和畜牧业的发展，对饲料原料的需求量越来越大，而某些不法商人，为谋取不正当的利益，在饲料原料中掺杂使假。
现阶段，在饲料原料中的制假、掺假过程中，不仅仅是简单的添加非原有成分，而呈现出知识化、科技化、专业化的趋势，扰乱了饲料市场的正常秩序。
为此，现提供几种饲料原料的鉴别方法，以飨读者。
一、植物性饲料原料的掺假及鉴别在植物性的饲料原料中（如次粉、豆粕、麦麸），添加滑石粉、碳酸盐，以次充好，或是用这些掺假物质，辅以统糠，经加工、着色制成相似的物质，以次充好。
对于这种掺假方式，可以采用以下方法进行鉴别：$、显微镜检验：利用显微镜，可以直观地看到，有大量白色的物质，呈圆形。
用锐形物夹，容易碎。
变换不同的倍数和焦距，物体没有什么变化。
如果添加有用统糠加碳酸盐或滑石粉制成的添加物，显微镜下可见大量有统糠特征的物质。
!、手感：如添加有这类物质，手感细腻，较滑。
如果是用统糠加碳酸盐或滑石粉制成的添加物，手感比较粗糙。
%、灼烧：由于碳酸盐和滑石粉都是耐灼烧物质，对这些植物性原料进行灼烧，如含有大量的灼烧残渣，说明其中有许多无机物，可能含有上述物质。
&、化学反应：如果上述原料中含有碳酸盐，可滴加盐酸。
如产生大量气泡，说明其中有碳酸盐。
’、水浸泡：如果其中含有由统糠加碳酸盐或滑石粉制成的掺假物，可取样约$"克，加$""毫升水，充分浸泡，搅拌。
如有上述合成物，上层可见大量统糠，底层可见大量无机物。
如果是豆粕，也可能有由麦麸加碳酸盐或滑石粉制成的这类物质，可用这种方法加以鉴别。
#、在豆粕中，有时为了掺假，同时保证粗蛋白的含量，在掺入上述合成掺假物的同时，往往加入一些非蛋白氮，如尿素、碳酸氢铵、醛聚合物。
对于这类掺假物，除进行上述检验外，可以进行水溶性蛋白测定。
如果水溶性蛋白含量特别高，说明掺有这些非蛋白含氮物。
生化检验总和
感染，自身免疫性疾病等组织损伤如创伤，手术，心梗肿瘤等侵害，诱导炎症，使单核巨噬系统释放紧急反应性细胞因子TNF，IL-1等经血液循环刺激肝细胞产生触珠蛋白，铜蓝蛋白，C-反应蛋白等使血中浓度显著升高，而血浆前清蛋白，清蛋白，转铁蛋白浓度相应下降的过程。
该过程中出现的蛋白称为急性时相蛋白。
◆血浆蛋白浓度增加超过25%称为正相app，而降低25%以上称为负相app。
前者包括首先升高的C-反应蛋白，α1-抗胰蛋白酶（AA T），触珠蛋白(CRP)，C4，纤维蛋白原最后为C3和铜蓝蛋白（Cp）后者包括前清蛋白（PA），清蛋白（Alb），转铁蛋白（Tf）。
◆肾病综合症血清蛋白电泳图谱：清蛋白下降，α2和β球蛋白显著升高，γ球蛋白不变或相对下降。
肝硬化图谱则是Alb下降，γ球蛋白明显升高，典型β和γ带融合出现β-γ桥。
◆前清蛋白PA属于负性app，为运载蛋白和组织修补蛋白，作为营养不良的指标（400-200-150-100-50mg/l 正常，轻度中度严重缺乏），为肝功能不全的指标。
清蛋白和转铁蛋白亦可做二项指标，只是PA半寿期短而更具敏感性。
◆清蛋白Alb，血浆中最多的蛋白，占总蛋白57-68%。
◆α1-抗胰蛋白酶AAT,蛋白酶抑制物，在α区占90%。
AA T缺陷与肺气肿：当吸入尘埃和细菌引起肺部多形核白细胞吞噬活跃时，溶酶体弹性蛋白酶释放，如果M型AA T蛋白酶缺乏，蛋白水解酶可作用于肺泡壁的弹性纤维而导致肺气肿的发生。
低血浆AA T还可见胎儿呼吸窘迫综合征。
◆α1-酸性糖蛋白（AAG）血浆内含糖量最高蛋白，作为APR指标，并是反映溃疡性结肠炎活动性最可靠指标之一。
糖皮质激素增加可引起血浆AAG升高而雌激素可减少。
◆触珠蛋白Hp，主要能与红细胞中释放出的游离血红蛋白结合，一分子可结合二分子Hb，从而防止从肾丢失而为机体有效保留铁并避免Hb对肾脏的损伤。
◆α2-巨球蛋白AMG，血浆最大蛋白质，属于蛋白酶抑制剂，不属于APP。
牛奶中蛋白质含量的测定
牛奶中蛋白质含量的测定摘要：通过国标牛奶中蛋白质的测定找出它的不足之处，用新的方法进行蛋白质的测定。
关键词：蛋白质测定凯氏定氮法微波消解—凯式定氮法 Bradford法甲醛值滴定法牛奶是一种营养丰富而全面的理想食品,是人体所需蛋白质的重要来源,蛋白质是牛奶中的主要营养指标。
因此，牛奶中蛋白质的测定是一件非常重要的事，也是大家非常关注的事。
用凯氏定氮的方法检测蛋白质含量。
蛋白质测定的国标规定方法——凯氏定氮法介绍【GB/T 5009.5—1985】食品中蛋白质的测定方法本标准适用于各类食品中蛋白质的测定。
1 原理蛋白质是含氮的有机化合物。
食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。
然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质含量。
2 试剂所有试剂均用不含氨的蒸馏水配制。
2.1 硫酸铜。
2.2 硫酸钾。
2.3 硫酸。
2.4 2%硼酸溶液。
2.5 混合指示液：1份0.1%甲基红乙醇溶液与5份0.1%溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合。
也可用2份0.1%甲基红乙醇溶液与1份0.1%次甲基蓝乙醇溶液临用时混合。
2.6 40%氢氧化钠溶液。
2.7 0.05N硫酸标准溶液或0.05N盐酸标准溶液。
3 仪器定氮蒸馏装置：如图所示。
（图略）4 操作方法4.1 样品处理：精密称取0.2～2.0g固体样品或2～5g半固体样品或吸取10～20ml液体样品(约相当氮30～40mg)，移入干燥的 100ml或500ml定氮瓶中，加入0.2g硫酸铜，3g硫酸钾及20ml硫酸，稍摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45°角斜支于有小孔的石棉网上。
小心加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热0.5h。
取下放冷，小心加20ml 水。
放冷后，移入100ml容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。
即时检验(POCT)的技术原理及分类
即时检验（POCT）的技术原理及分类POCT（即时检验）主要得益于一些新技术的应用。
POCT技术的基本原理大致可分为四类：（1）把传统方法中的相关液体试剂浸润于滤纸和各种微孔膜的吸水材料内，成为整合的干燥试剂块，然后将其固定于硬质型基质上，成为各种形式的诊断试剂条。
（2）把传统分析仪器微型化，操作方法简单化，使之成为便携式和手掌式的设备。
（3）把上述二者整合为统一的系统。
（4）应用生物感应技术，利用生物感应器检测待测物。
有关POCT的技术学分类见下表：目前应用的具体技术归纳起来主要有：一、干化学技术干化学技术是将多种反应试剂，干燥在纸片上，用被测样品中所存在的液体作反应介质，被测成分直接与固化于载体上的干试剂进行反应。
加上检验标本后产生颜色反应，用眼观定性或仪器检测（半定量）。
适用于全血，血清，血浆，尿液等各类样品。
例如：前降钙素（PCT）的半定量检测就是使用此种方法。
尿液蛋白质、葡萄糖等一般化学检查也都属于此范畴。
近几年，干化学尿液分析取得了很大的进展，各型尿沉渣分析仪相继问世，为临床提供一个简便、快速的筛选方法，即将完全正常的标本通过干化学尿液分析仪筛选出去，有利于对异常的标本进行规范性检查。
中华医学会经过三次专家研讨会，制定了筛选标准，即在干化学尿试带全部为阴性时，可以免去对红细胞和白细胞的显微镜检查，如果有一项阳性结果，必须同时进行显微镜检查。
换句话说，迄今为止无一台仪器检查能完全替代显微镜检查，尿沉渣显微镜检查以它特有临床价值仍是尿液分析中不可缺少的检查手段。
二、多层涂膜技术多层涂膜技术是从感光胶片制作技术移植而来。
将多种反应试剂依次涂布在片基上，制成干片。
采用多层涂膜技术制成的干片，比干化学纸片平整均匀，用仪器检测，可以准确定量，如目前临床使用的干板化学分析系统，可用于大多数血液化学成分，如蛋白质、糖类、脂类、酶、电解质、非蛋白氮类及一些血药浓度的监测，可供检测的项目达数十项，几乎覆盖了常做的临床生化检验项目。
生化检验项目
生化检验项目引言概述：生化检验项目是医学检验中的一项重要内容，通过对生物体内的生化物质进行定量或定性分析，可以帮助医生评估患者的健康状况、诊断疾病、监测治疗效果等。
本文将从四个方面详细介绍生化检验项目的内容。
一、血常规检验项目1.1 血红蛋白测定：血红蛋白是红细胞中的重要成分，可以反映机体的贫血程度。
通过血红蛋白测定可以判断贫血的类型和程度，为临床诊断提供重要依据。
1.2 白细胞计数：白细胞是机体的免疫细胞，对于感染、炎症等疾病具有重要意义。
白细胞计数可以帮助医生判断机体免疫功能的状态，以及是否存在感染等问题。
1.3 血小板计数：血小板是血液中的重要细胞成分，参与止血过程。
通过血小板计数可以了解机体的止血功能是否正常，判断是否存在出血倾向。
二、肝功能检验项目2.1 谷丙转氨酶测定：谷丙转氨酶是肝脏细胞内的一种酶，其测定可以反映肝细胞的损伤程度。
谷丙转氨酶升高可以提示肝细胞损伤，有助于判断肝炎、肝硬化等疾病的活动程度。
2.2 谷草转氨酶测定：谷草转氨酶也是肝脏细胞内的一种酶，其测定可以反映肝细胞的代谢功能。
谷草转氨酶升高可以提示肝细胞代谢异常，有助于评估肝脏病变的情况。
2.3 总胆红素测定：总胆红素是胆红素的总和，其测定可以反映肝脏和胆道系统的功能状态。
总胆红素升高可以提示肝胆系统的疾病，如黄疸、胆结石等。
三、肾功能检验项目3.1 血尿素氮测定：血尿素氮是血液中尿素的含量，其测定可以反映肾脏的排泄功能。
血尿素氮升高可以提示肾功能异常，有助于评估肾脏疾病的程度。
3.2 肌酐测定：肌酐是肌肉代谢产物，其测定可以反映肾小球滤过功能。
肌酐升高可以提示肾小球滤过率下降，有助于判断肾脏疾病的进展情况。
3.3 尿常规检查：尿常规检查包括尿液的外观、pH值、比重、蛋白质、糖、红细胞、白细胞等指标的检测。
尿常规检查可以帮助医生评估肾脏的功能状态，判断是否存在尿路感染、肾小球疾病等问题。
四、血脂检验项目4.1 总胆固醇测定：总胆固醇是血液中的一种脂质物质，其测定可以反映血液中胆固醇的总量。
食品分析与检验考点
饲料原料掺假检验
饲料原料掺假检验1.鱼粉掺假检测及真蛋白质的测定1物理方法：1.1感官检查法根据鱼粉成分的形状、结构、颜色、质地、光泽度、透明度、颗粒度等特征来检查。
①标准鱼粉一般为颗粒大小均匀一致、稍显油腻的粉状物，可见到大量疏松呈粉末的鱼肌纤维及少量的骨刺、鱼鳞、鱼眼等物；颜色均一，呈浅黄、黄棕或黄褐色；手握有疏松感，不结块，不发粘，不成团；有浓郁的烤鱼味，略有鱼腥味。
②鱼粉色泽随鱼种而异，墨罕敦鱼粉呈淡黄色或淡褐色，沙丁鱼粉呈红褐色，白鱼粉为淡黄或灰白色。
加热过度或含油脂高者，颜色加深。
如果鱼粉色深偏黑红，外观失去光泽，闻之有焦糊味，为储藏不当引起自燃的烧焦鱼粉。
如果鱼粉表面深褐色，有油臭味，是脂肪氧化的结果。
如果鱼粉有氨臭味，可能是贮藏中脂肪变性。
如果色泽灰白或灰黄，腥味较浓，光泽不强，纤维状物较多，粗看似灰渣，易结块，粉状颗粒较细且多成小团，触摸易粉碎，不见或少见鱼肌纤维，则为掺假鱼粉，需要进一步检。
1.2漂浮法取少许样品放入洁净的玻璃杯子中，加入１０倍体积的水，剧烈搅拌后静置。
观察水面漂浮物和水底沉淀物，如果水面有羽毛碎片或植物性物质（稻壳粉、花生壳粉、麦麸等）或水底有沙石等矿物质，说明鱼粉中掺入该类物质。
1.3气味测试法根据样品燃烧时产生的气味判别是否掺入植物性物质。
真品燃烧时是毛发燃烧的气味，如果出现谷物干炒的芳香味，说明掺入植物性物质。
另外还可以根据气味辨别是否掺入尿素。
只需取样品20克放入小烧瓶中，加20克生大豆粉和适量水，加塞后加热15--20分钟，去掉塞子后如果能闻到氨气味，说明掺入尿素。
1.4气泡鉴别法取少量样品放入烧杯中，加入适量稀盐酸或白醋，如果出现大量气泡并发出吱吱声，说明掺有石粉、贝壳粉、蟹壳粉等物。
1.5显微镜检法显微镜检法是最常用的一种方法，可以识别出大多数掺假物，但因为需要使用立体显微镜，故一般常用于大中型饲料企业或养殖物。
使用显微镜检法需要熟悉一些常见掺假物的典型显微特征。
常见检验正常值及意义
血常规正常值1．血细胞：成人每立方毫米5000～10000；1～5岁儿童约为8000～11000。
2．红细胞：成人男性每立方毫米400～500万；成人女性350～450万；新生儿600～700万；两岁后逐渐下降。
3．血红蛋白；成人男性13.5～15克％；女性12～14.5克％。
4．血沉：A、长管法，每小时儿童12毫米以下；成人男性15毫米以下；成人女性20毫米以下。
B、短管法，每小时儿童2～10毫米，成人男性0～8毫米，成人女性0～10毫米。
5．血小板：每立方毫米10～30万。
6．出血时间：1～5分钟。
7．凝血时间：A、试管法4～12分钟；B、毛细血管2～4分钟；玻片法2～8分钟。
8．蛋白质：总量6～7.5克％；白蛋白3.5～4.8克％；球蛋白2～3克％；白蛋白／球蛋白3.8～4.8克％。
9．葡萄糖：成人80～120毫克％；儿童80～100毫克％。
10．总胆固醇：成人100～230毫克％；6岁以上儿童130～200毫克％。
11．甘油三酯：比色法＜5.45毫当量／升或40～150毫克％。
12．谷丙转氨酶：定量法2～40卡门氏单位。
13．肝功能：黄疸指数2～6单位；总胆红素0.1～1毫克％；麝香草酚浊度0～6 单位；硫酸锌浊度2～12单位血常规（二）白细胞分类（DC）白细胞分为粒细胞、单核细胞和淋巴细胞。
正常值：中性杆状核粒细胞（N）：1％～5％；中性分叶核粒细胞（N）：50％～70％；嗜酸性粒细胞（E）：0.5％～5％；嗜碱性粒细胞（B）：0％～1％。
单核细胞（M）：3％～8％。
淋巴细胞（L）：20％～40％。
中性粒细胞减少常见于某些血液病及放疗、化疗后，增多常见于感染炎症及组织损伤。
嗜酸性粒细胞减少常见于应用某些激素；增多常见于某些血液病和某些变态反应病，如药物过敏、荨麻疹等。
嗜碱性粒细胞减少无临床意义，增多常见于某些类型白血玻淋巴细胞减少常见于接触了放射物或应用了激素；增多则常见于某些传染病和白血玻单核细胞减少无临床意义，增多常见于某些感染和血液玻血小板计数（PLT）正常值：100～300×109／L（或10万～30万／mm3）。
蛋白质定量分析的十种方法(上)
蛋白质定量分析的十种方法（上）1、凯氏定氮及分光光度法蛋白质定量分析利用蛋白质含氮量进行检测的经典方法，定量精准，但操作繁琐，仅用于标定蛋白质标准品和校正其他测定方法。
凯氏定氮法有半微量法、微量法及全量法。
样品与H2SO4一同加热消化，分析有机物，释放出的NH3与结合，碱化蒸馏使氮游离，硫酸吸收，HCI或H2SO4标准溶液滴定，从而计算蛋白质的含量。
该方法是以Hantzsch反应为原理所建立的一种测试蛋白质含量的新分光光度法。
适用于各类食品中蛋白质的测定，且不需要特殊的凯氏定氮装置。
取样少，消化时间短，精密度高准确度好，适用于大批样品同时测定，亦适用于微量蛋白质分析，是一种蛋白质快速、准确定量的新途径。
2、双缩脲法蛋白质定量分析双缩脲法简便易行，但检测灵敏度相对较低，最低测定值100ug。
必须在测定前先使蛋白完全沉淀，除去干扰物质，才能得到较准确的结果。
除三氯乙酸作沉淀剂外，还可用钨酸、磷钨酸和Tsuchiya试剂，双缩脲法优点是对白、红蛋白产生颜色反应相近、干扰物质少，不受温度的影响。
但灵敏度低，0.01吸光度相当于166.7ug蛋白，且操作复杂，很难用于自动化仪器分析。
3、Lowry法蛋白质定量分析结合双缩脲法中铜盐反应与Folin-ciocalteau试剂反应的特点，通过芳香族氨基酸残基Tyr和Try的迅速反应与肽链、极性侧链或两者的铜络合物较慢的反应。
而把磷钼酸发色团还原成暗蓝色，在波长750nm处测定Amax.4、BCA法蛋白质定量分析BCA法的灵敏度为0.5-10ug/ml，其最低测定值与反应温度有关。
有37摄氏度和60摄氏度2种反应温度：在37摄氏度时，一般适用于浓度较高的样品，但是色氨酸、络氨酸和肽键在此温度下得不到彻底的氧化；在60摄氏度时，一般适用于浓度较低的样品，色氨酸、络氨酸和肽键在此温度下能得到充分氧化，因此能大大提高检测灵敏度。
资料来源：网络平台分享，由百泰派克生物科技整理百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Q ExactiveHF质谱平台，Orbitrap Fusion质谱平台，Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，为广大科研工作者提供生物蛋白质定量分析服务，欢迎咨询！。
兽医临床生化检验 第二章 蛋白质测定
二、血清白蛋白（ALB）测定的临床意义
真性升高：未见。 白蛋白↑ 假性升高：机体明显失水，休克。总蛋白含量
相对升高，A/G几乎不变。
白蛋白↓
①摄入不足：长期低蛋白质饮食或慢性胃肠道疾病所 引起的消化吸收不良，使体内缺乏合成蛋白质的原 料。
②合成障碍：当肝功能严重受损时，蛋白质合成减少， 见于各种慢性肝病。
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2、电泳测定：
电泳
组成图谱
半定量
3、定量化学测定TPr，Alb 染料结合法，UV法，折光法等
定量
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第一节 血清总蛋白（TP）测定
假设： １、 纯多肽链，含氮量平均为16% ２、各种蛋白质与化学试剂反应性一致，仅为相对定量
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测定依据：蛋白质测定一般利用蛋白质以下的结构或性质
1、元素组成测定：含N稳定； 2、重复的肽链结构：具有多个肽键； 3、酪氨酸和色氨酸与Folin-酚试剂反应显色 4、 酪氨酸和色氨酸UV 吸收； 5、与色素结合的能力：与染料以离子键或共价键连接； 6、沉淀后借浊度测定：光度计测定； 7、光折射测定：折射仪测定。
缺点：灵敏度较差，对蛋白质含量低的体液标本不适 合。
应用：常规推荐方法。手工或上机使用。
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三、酚试剂法（理解） 原理：
蛋白质分子中的酪氨酸残基和色氨酸残基能够和酚试剂 中的磷钨酸-磷钼酸反应生成蓝色化合物，
Lowry改良法：在酚试剂中加入Cu2+（75%呈色），提高了 呈色的灵敏度，为双缩脲法的100倍左右。
评价及应用：
优点：简便不需特殊仪器。 缺点：浊度形成的干扰因素多（加试剂方法，反应温度，蛋 白絮状沉淀等）
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五、染料结合法（理解）
原理：
在酸性环境下，带正电的蛋白质（-NH3+)与染料的阴离子 产生颜色反应，使染料的吸收峰改变，可既而用分光光度法 比色测定。
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非蛋白氮的定量检验在非蛋白氮定量的检测方法中，比较常用的方法是硫酸铜沉淀法和氨基酸测定法。
除此之外，本文根据非蛋白氮的组成结构的不同，采用水解蒸馏法对样品中的非蛋白氮进行检验。
一、硫酸铜沉淀法根据非蛋白氮的化学性质来看，大部分溶于水，一部分在常温下不溶水，但在沸水中溶解。
根据此种性质，可以先将样品煮沸，用硫酸铜将样品中的蛋白质沉淀下来，由于非蛋白氮已经溶于水，故可用过滤方法将其与样品中的蛋白质分离。
在过滤时，水的温度一定不能太低，否则象双缩脲一类的物质会因为不溶于常温水而不能被过滤掉。
用此种方法测定出的蛋白质含量称为样品的真蛋白质。
但实际上，此种方法有很大的局限性。
如果非蛋白氮不溶于沸水，或者将一般的非蛋白氮微囊化，此种方法测出的结果会与样品中的实际真蛋白有很大的差异。
二、氨基酸测定法为了真正能够判定样品中是否掺有非蛋白氮，需测定样品中的氨基酸含量。
无论采用经典的氨基酸自动分析仪分析（柱后衍生），还是采用比较快捷的HPLC分析（往前衍生），将所测定的氨基酸总量相加得到一个总氨基酸数值，然后将此数值乘以6.25为M，和用凯氏定氮法测定的粗蛋白质N相比较，M至少为N的85％（M可能略大于N）。
如果低于此数值，则可以判定该样品中掺有非蛋白氮。
三、水解蒸馏法1、原理：非蛋白氮主要包括五类：尿素及其衍生物类、氨态氮类、铵类、肽类及其衍生物、动物粪便及其它废弃物类。
如果在原料中掺有氨态氮类、铵类和粪便比较容易判断（可采用硫酸铜沉淀法加镜检），一般很少将肽类及其衍生物掺入其中，剩下比较难鉴别的就是尿素及其衍生物。
尿素和尿素衍生物经过强酸或强碱水解为氨盐或氨和其它的物质，在强碱的条件下可以蒸馏出氨气，原料中的蛋白质经过水解成氨基酸盐，氨基酸盐在强碱条件下稳定，从而可将非蛋白氮和真蛋白氮进行分离。
2、仪器和设备：酒精喷灯，试管和其它常用的仪器。
3、试剂与溶液：6mol/l 的盐酸溶液和其它常用的试剂。
4、测定方法：本文只列出用酸水解的方法。
采集有代表性样品约100g ，混匀后用四分法缩分出209左右，将其粉碎，使其全部通过60目样品筛。
精确称取0.3000g 的样品，置于容积为60ml 的试管底部（注意样品勿沾在管壁上），加入30ml 6mol/l 的盐酸溶液，将试管在距试管口1～2cm 处用喷灯加热并封口。
将封好的试管置于干燥箱内，于110℃下水解24h 。
冷却后打开试管，将水解液过滤至100ml 容量瓶中，用蒸馏水反复多次冲洗试管和滤纸，然后定容至刻度。
用10ml 移液管移取10ml 样液移入半微量式定氮仪的反应室中，加入20ml 1∶1的氢氧化钠溶液蒸馏10 min ，余下的步骤按照测定粗蛋白的方法进行操作，得出样品所消耗的盐酸的体积为V 1（ml ）。
同时作空白滴定可得消耗的盐酸的体积为V 0，设所称样品的质量为M （g ）。
5、非蛋白氮的粗蛋白质计算公式CP(%)＝（V 1-V 0）×C×O.14×6.25/M非蛋白氮的概述和检测方法文章来源：饲料工业 更新时间：2002-11-7 点击数： 1230曾 俊 苏俊黎1 非蛋白氮的概述非蛋白氮大致可以分为以下几类，①尿素及其衍生物类，如缩二脲、羟甲基尿素等；②氨态氮类，如液氨、氨水等；③铵类，如硫酸铵、氯化铵等；④肽类及其衍生物，包括氨基酸、酰胺、胺等；⑤动物粪便及其它废弃物类。
以下是几种常见的非蛋白氮的介绍：1．l 双缩脲又称缩二脲，是一种尿素缩合产品，其含氮量在35％上，蛋白质当量为219％。
缩二脲难溶于水，一般的定量检验方法为紫红色配位化合物比色法（原理：鱼粉中的双缩脲经抽提后，在酒石酸钠的碱性溶液中与硫酸铜生成紫红色配位化合物，在550nm波长下比色从而测出其含量）。
1．2 尿素是氮和二氧化碳在高温高压下化合而成。
纯尿素的含氮量为47％，折合蛋白当量为293．75％。
易潮解，易溶于水，一般的定量检验方法有二种：一种为二甲基氨基苯甲醛显色法；另一种为二嗪衍生物显色法。
但以上两种方法只能测定游离性尿素而不能测定其衍生物。
1．3 尿素甲醛聚合物是由尿素和甲醛聚合而成，其含氮量为38.89％，折合蛋白当量为243．06％。
该聚合物难溶于水。
1．4 硫酸铵俗称肥田粉，其含氮量为20％左右，折合蛋白当量为125％。
硫酸铵的工业品一般为白色或微带黄色的结晶，易溶于水，其分子式为（NH4）2SO4。
1．5 异亚丁基二脲又名二脲异丁烷，简称IBDU，为尿素和异丁醛在催化剂的作用下综合反应生成。
IBDU为一种子的白色粉末或颗粒，总含氮量为32．18％，折合蛋白当量为201.13％，吸湿度远低于尿素。
以上是比较常见的非蛋白氮物质。
随着科技的发展，还会有越来越多的非蛋白氮物质被合成出来，从而使反刍动物所用的非蛋白氮使用广泛，而掺假者很容易将此物质掺入饲料原料中以提高原料的粗蛋白质。
2 非蛋白氮的检验2．l 非蛋白氮的定性检验在对原料样品的检测中，一般有定性检测和定量检测。
在定性检测中，使用的比较多的为显微镜检，包括直接镜检、分层镜检（用四氯化碳或三氯甲烷分层）、反应剂镜检（用化学物质和样品中的某些物质反应而在显微下区分）、染色镜检等。
在使用的过程中，往往使用一项或多项镜检方法对样品中的物质进行判定。
对于非蛋白氮的检验，显微镜检是一种比较有效的方法。
在对样品的检测中，一般使用的是生物显微镜，其放大的倍数在36～400倍之间，为了获得更好的显微效果，可以根据实际情况作出具体的调整。
以下是镜检使用过程中的一些技巧：2.1.l 直接镜检直接镜检一般所用的倍数比较小，通过对样品不同的物理特征，如颜色、透明度、表面组织、形状等物理性状进行判定。
特别的要与典型的样品进行比较，以便能够更好区分样品与杂质的不同。
在直接镜检中，用不同的滤光片有时可以起到比较明显的效果。
虽然直接镜检比较方便和直观，但有时对于样品中的物质很难区分时，可以用其它的检验方法。
2.1.2 分层镜检将样品用四氯化碳进行脱脂和比重分离之后，样品与其它物质的区分会更加容易。
对样品中的有机物和无机物分层之后，需在常温下干燥后再进行镜检。
非蛋白氮一类的物质与原料的很多外观性质很不一样，通过两者的特异性之间的观察，可以对样品中是否掺有非蛋白氮一类的物质作出一个大概的判断。
2．1．3 反应剂镜检用反应剂和样品进行反应，非蛋白氮一类的物质的化学性质和样品不一样，通过此种方法可以对样品中的非蛋白氮进行鉴别。
经过四氯化碳分层之后，再与反应剂反应是比较好的一种方法。
而镜检时在样品中加一滴或数滴浓硫酸，观察样品与浓硫酸反应的情况是一种比较直观的鉴别方法。
因为无论动物蛋白还是植物蛋白，其与浓硫酸的反应速度和产生的现象比较明显。
2.1.4 染色镜检用染色剂对样品进行染色，使样品中的植物或动物细胞染成不同的颜色，而非蛋白氮一类的物质则和样品的染色后的表现不同，通过此种方法使两者区分开来从而加以鉴别。
以下是比较常用的染色方法：对植物细胞的染色方法：番红——固绿染色法。
取适量脱胎（视样品脂肪多少而定，可以用四氯化碳，也可以用丙酮，对于脂肪少的也可以不用脱脂）样品于烧杯中，用1％的番红水溶液浸泡l～3h 水洗（去多余的染料）。
将样品涂在玻片上，稍晾干。
滴加 0．l％的固绿（溶剂用 95％乙醇）。
过 15s 后滴加 95％的乙醇，冲去多余固绿染料。
待乙醇稍挥发后，加甘油液（甘油:水＝1:1）浸润，加盖玻片。
用生物显微镜检查。
染色结果：细胞核，木质化细胞壁呈鲜红色，纤维素细胞壁、细胞质呈绿色。
因为非蛋白氮没有细胞核、细胞质等结构，所以只要能够较好的掌握染色技巧，其对比效果比较明显。
当然，不能从染色效果判断其一定为非蛋白氮。
对动物细胞的染色方法：苏木精——曙红对染法。
取适量的脱脂样品于烧杯中，加入埃利希苏木精染色液浸泡3～5min，水洗数次（用5min左右）。
将样品涂在玻片上，滴加氨水。
3～4s后立即满加水，洗l min，稍晾一下，加 0.2％曙红水溶液浸润 3min，滴加 95％的乙醇，洗去多余曙红染料。
再稍晾一下，加甘油浸润，加盖玻片，用生物显微镜观察。
其染色的结果为：细胞核呈蓝色，细胞质呈淡红色。
通过此种方法染色，一般能够很容易的区分样品和非蛋白氮一类的物质。
为了能够更清晰的在显微镜下区分样品与杂质，也可采用以下方法（对于检验鱼粉一类的物质比较有效）：先用四氯化碳或三氯甲烷对样品分层，除去无机物，必要时再用丙酮进行脱脂，再取一定量的样品置入蒸馏水中，搅拌，除去溶于水的物质，再用60目或80目的样品筛过滤，将样品放入50～60℃的烘箱中进行烘干（时间不能过长，以保持样品原来的状态），然后在显微镜下进行检验或再对其进行处理后镜检。
在显微镜检中，只能对非蛋白氮作初步判断。
若要进一步的分析判断，还需进行定量分析检验。
2.2 非蛋白氮的定量检验在非蛋白氮定量的检测方法中，比较常用的方法是硫酸铜沉淀法和氨基酸测定法。
除此之外，本文根据非蛋白氮的组成结构的不同，采用水解蒸馏法对样品中的非蛋白氮进行检验。
2.2.l 硫酸铜沉淀法根据非蛋白氮的化学性质来看，大部分溶于水，一部分在常温下不溶水，但在沸水中溶解。
根据此种性质，可以先将样品煮沸，用硫酸铜将样品中的蛋白质沉淀下来，由于非蛋白氮已经溶于水，故可用过滤方法将其与样品中的蛋白质分离。
在过滤时，水的温度一定不能太低，否则象双缩脲一类的物质会因为不溶于常温水而不能被过滤掉。
用此种方法测定出的蛋白质含量称为样品的真蛋白质。
但实际上，此种方法有很大的局限性。
如果非蛋白氮不溶于沸水，或者将一般的非蛋白氮微囊化，此种方法测出的结果会与样品中的实际真蛋白有很大的差异。
2.2.2 氨基酸测定法为了真正能够判定样品中是否掺有非蛋白氮，需测定样品中的氨基酸含量。
无论采用经典的氨基酸自动分析仪分析（柱后衍生），还是采用比较快捷的HPLC分析（往前衍生），将所测定的氨基酸总量相加得到一个总氨基酸数值，然后将此数值乘以6.25为M，和用凯氏定氮法测定的粗蛋白质N相比较，M至少为N的85％（M可能略大于N）。
如果低于此数值，则可以判定该样品中掺有非蛋白氮。
2.2.3 水解蒸馏法原理非蛋白氮主要包括以下五类：尿素及其衍生物类、氨态氮类、铵类、肽类及其衍生物、动物粪便及其它废弃物类。
如果在原料中掺有氨态氮类、铵类和粪便比较容易判断（可采用硫酸铜沉淀法加镜检），一般很少将肽类及其衍生物掺入其中，剩下比较难鉴别的就是尿素及其衍生物。
尿素和尿素衍生物经过强酸或强碱水解为氨盐或氨和其它的物质，在强碱的条件下可以蒸馏出氨气，原料中的蛋白质经过水解成氨基酸盐，氨基酸盐在强碱条件下稳定，从而可将非蛋白氮和真蛋白氮进行分离。
仪器和设备：酒精喷灯，试管和其它常用的仪器。
试剂与溶液：6mol／1的盐酸溶液和其它常用的试剂。