4蛋白组学-翻译后修饰
蛋白质修饰鉴定
百泰派克生物科技
蛋白质修饰鉴定
蛋白质修饰及蛋白质翻译后修饰，指蛋白质在翻译中或翻译后经历的一个共价加工过程，在该过程中，蛋白质的1个或几个氨基酸残基可以共价结合不同的修饰基团而改变原来蛋白质的性质和功能。
目前已发现300多种不同的翻译后修饰，主要形式包括磷酸化、糖基化、甲基化、乙酰化、泛素化、羟基化、核糖基化和二硫键的配对等。
蛋白质翻译后修饰对维持机体正常生命活动具有重要作用，调节着蛋白质的活性状态、定位、折叠以及蛋白质与蛋白质之间的交互作用等。
蛋白质翻译后修饰鉴定就是对修饰类型、位点以及修饰水平进行鉴定，其分析鉴定难度远高于蛋白质的鉴定，主要是因为发生翻译后修饰的蛋白质样本量相对较少、发生修饰时形成的共价键很不稳定且处于动态变化中、修饰与未修饰的或多种修饰形式的蛋白质常混合存在。
目前，翻译后修饰蛋白质的分析主要是利用现有的蛋白质组学技术体系，包括电泳、色谱、生物质谱以及生物信息学工具等。
百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Q ExactiveHF质谱平台结合Nano-LC色谱，提供快速高效的蛋白质翻译后修饰鉴定服务技术包裹，您只需要将您的实验目的告诉我们并将您的样品寄给我们，我们会负责项目后续所有事宜，包括蛋白提取、蛋白酶切、修饰肽段富集、肽段分离、质谱分析、质谱原始数据分析、生物信息学分析，欢迎免费咨询。
第六章蛋白质翻译后修饰的鉴定
04
抗体法在蛋白质翻译后修饰鉴定中的应用
抗体法原理及技术流程
原理
抗体法利用特异性抗体与蛋白质翻译 后修饰位点结合的原理，通过免疫学 方法进行检测和鉴定。
技术流程
包括抗原制备、抗体生产、抗体纯化 和特异性验证等步骤。
抗体法鉴定蛋白质翻译后修饰的优势与局限性
优势
高特异性、高灵敏度、可定量分析等。
局限性
化学方法
质谱分析
通过质谱技术检测蛋白质分子的质量和化学 性质，从而鉴定蛋白质的翻译后修饰类型和 位点。
荧光标记
利用荧光标记技术标记特定的修饰位点，通过荧光 信号的强度和分布来鉴定蛋白质的翻译后修饰。
蛋白质芯片技术
将蛋白质固定在芯片表面，利用特定的抗体 或配体检测蛋白质的翻译后修饰类型和位点 。
实例分析
第六章蛋白质翻译后 修饰的鉴定
汇报人：XX
目录
• 蛋白质翻译后修饰概述 • 蛋白质翻译后修饰的鉴定方法 • 质谱法在蛋白质翻译后修饰鉴定中的应用 • 抗体法在蛋白质翻译后修饰鉴定中的应用 • 其他方法在蛋白质翻译后修饰鉴定中的应
用 • 蛋白质翻译后修饰鉴定的挑战与未来发展
01
蛋白质翻译后修饰概述
数据准备
收集已知的蛋白质乙酰化修饰位点数据，包括蛋白质序列、修饰位点 的位置和化学性质等。
特征提取
从蛋白质序列中提取与乙酰化修饰相关的特征，如氨基酸组成、序列 模体、结构域等。
模型训练
利用机器学习或深度学习算法，如支持向量机、神经网络等，训练预 测模型。
预测与验证
将新的蛋白质序列输入到训练好的模型中，预测潜在的乙酰化修饰位 点，并通过实验验证预测结果的准确性。
其他方法
1 2 3
蛋白组学翻译后修饰
先用糖苷内切酶消化，再用蛋白酶消化，通过 分析糖苷酶作用前后MS发生位移的肽段，即 可确定含糖基化的肽段 结合串联质谱，可进一步分析糖基化肽段的氨 基酸序列，从而发现糖基化位点
核糖核酸酶B中糖基化位点的分析
糖苷键酶F作用前
糖苷键酶F作用后 剩一个GlcNAc
氨基酸序列的测定
m/z=4792.23
翻译后化学修饰的生物学效应
泛素化对于细胞分化与凋亡、DNA 修复、免疫应 答和应激反应等生理过程起着重要作用; 磷酸化涉及细胞信号转导、神经活动、肌肉收缩 以及细胞的增殖、发育和分化等生理病理过程; 糖基化在许多生物过程中如免疫保护、病毒的复 制、细胞生长、炎症的产生等起着重要的作用; 脂基化对于生物体内的信号转导过程起着非常关 键的作用; 组蛋白上的甲基化和乙酰化与转录调节有关。
TSAASSSNYCNQM
RQHMDSSTSAASSSNYCNQ MMKSRNLTKDRCKPVNTF VHE
糖基化类型的分析
糖蛋白进行蛋白酶切，得到含糖肽段，对肽段直接 进行ESI-MS/MS，以及MALDI-TOF-MS的PSD， 可以直接得到单糖碎片，从而确定糖链结构。
凝集素在糖蛋白研究中的作用
真核生物的Ser，Thr，Tyr 残基. 原核生物的His，Asp，Glu
蛋白质组学在磷酸化分析中的困难
磷酸化蛋白质在细胞内的蛋白质中是相对较 低丰度的； 即使我们找到一种磷酸化蛋白质，也不能排 除有该蛋白质的其他磷酸化形式存在； 细胞内有很多磷酸酯酶，在样品处理时，这 些酶很容易将磷酸基团脱掉； 磷酸化蛋白质酶解后的磷酸化肽段，因为其 化学性质的负电性，在质谱技术中面临着难 以质子化的困难。
翻译后修饰的基因表达调控
翻译后修饰的基因表达调控随着基因组学技术的不断进步，人们对基因的理解也愈发深刻。
在研究基因表达调控中，翻译后修饰逐渐成为重要的研究方向之一。
翻译后修饰是指蛋白质在翻译后发生的化学修饰，通过改变蛋白的化学结构和性质进而影响蛋白的功能和活性。
翻译后修饰可以影响蛋白的稳定性、局部结构、跨膜结构等方面的性质，从而影响到蛋白的功能和调控。
下面将就翻译后修饰在调控基因表达方面的研究进展进行阐述。
一、翻译后修饰对蛋白的稳定性和降解速率的影响蛋白质的稳定性和降解速率是与基因表达调控密切相关的因素之一。
在翻译后修饰方面，泛素化和泛素降解是一个被广泛关注的研究领域。
泛素是一种小分子蛋白，可以通过连接到目标蛋白的氨基酸残基上完成泛素化修饰。
泛素化可以标记蛋白，将其引导至泛素蛋白酶体降解途径，促进蛋白的降解。
研究表明，泛素化这一翻译后修饰方式对于细胞周期调控、DNA修复、细胞信号转导等方面的基因表达调控起到至关重要的作用。
除泛素化外，其他翻译后修饰方式，如磷酸化、甲基化等也可以影响蛋白的稳定性和降解速率。
如磷酸化可以改变蛋白的电荷和空间构型，降低其稳定性；而甲基化能够影响蛋白的叠加和空间结构，进而改变蛋白的稳定性和降解速率。
这些翻译后修饰方式的调控作用为我们深入理解基因表达调控提供了有力的实验依据。
二、翻译后修饰对蛋白的局部结构和功能的影响除了稳定性和降解速率外，局部结构和功能也是翻译后修饰对基因表达调控的影响重要方面。
磷酸化、甲基化等修饰方式可通过改变蛋白的活性位点、空间结构等方面的性质，调控蛋白的功能。
例如，磷酸化可以刺激酶和激酶信号转导途径，改变蛋白的代谢和运输、细胞增殖等功能。
又如，甲基化作为一种基因表达调控方式，可以通过改变DNA合成、RNA合成等方面的生化途径，影响到蛋白的表达和功能。
除特异性修饰方案外，糖基化也是一种影响蛋白局部结构的修饰方式。
糖部分可以结合到特定氨基酸残基上，改变蛋白分子的堆积和跨膜结构，影响蛋白的稳定性和生物学功能。
生物大分子理论201年 硕士生课程 蛋白质翻译后修饰
真核生物蛋白质功能的一种主要调节机制。
特点及其意义
蛋白质翻译后修饰是调节蛋白质生物活性的重 要方式
蛋白质翻译后修饰异常导致人类众多的疾病 蛋白质翻译后修饰是蛋白质组研究的一个重要
内容
1、蛋白质翻译后修饰是调节蛋白生物活性的 重要方式
• MAPK信号通路介导的转录调控
• NF-κB信号通路
• 膜系统-胞核间的信号传导 JAKs and STATs
CREB的转录激活
Protein kinase A and DNA结合蛋白
MAPK信号通路介导的转录调控
MAPK信号通路介导的转录调控
膜系统-胞核间的信号传导 JAKs and STATs
• 组蛋白修饰种类
乙酰化--组蛋白乙酰化能选择性的使某些染色 质区域的结构从紧密变得松散，开放某些基因 的转录，增强其表达水平 。
甲基化-- 发生在H3、H4的 Lys 和 Arg 残基 上，可以与基因抑制有关，也可以与基因的激 活相关，这往往取决于被修饰的位置和程度。
磷酸化-- 发生在Ser 残基，一般与有丝分裂和 凋亡相关。
• 在老年痴呆和其它TAU异常导致的相关疾病中,各种因素(遗传因素、 代谢异常等）导致细胞内信号传导通路异常，磷酸化－去磷酸化之间 的动态平衡被打破，即大脑中某些的磷酸酶如PP2A蛋白水平下调，
继而导致TAU蛋白磷酸化水平升高，称为TAU的超磷酸化 （hyperphosphorylation）；大脑葡萄糖摄取和代谢异常亦可导致
• 全美国约有四百万人被诊断为患有AD 。阿尔茨海默氏病 最常发生在 65 岁以上的人身上；但是，更年轻的人士也 可能患此病。当年龄超过 65 岁后，失智症患者的人数迅 速增加。2019 年，患有中度或重度记忆损伤的人数在 65 至 69 岁人群中为 4%，而在 85 岁以上的老年人中，该比 例则为 36%。在导致 65 岁以上老人死亡的原因中，AD 位居第九。
蛋白翻译后修饰
凋亡,从而最终发展成为癌细胞 .
2.5 磷酸化
DNA新陈代谢的研究中：细胞中DNA损伤可导致人的复制蛋 白 A(RPA)32 kD 亚基 N 端的过度磷酸化, 这有助于调控 DNA 的新陈代谢, 促进DNA 修复. 有数据显示, 过度磷酸化会 导致 RPA 构象改变 , 降低 DNA 复制的活性 , 但不会影响
泛素-蛋白酶系统是存在于所有真核生物细胞的调控
系统。降解过程中需要三种酶的参与: 泛素激活酶(E1)、
泛素结合酶(E2)和泛素蛋白质连接酶(E3)。泛素化降解
蛋白的过程中对蛋白的特异性识别依赖 E3. 由 E2s 和 E3s 介导的泛素化过程可以被去泛素化酶(DUBs)逆转.。
2.4 泛素化
目前发现的 DUBs 可分为两大类 : 泛素碳端水解酶 (ubiquitin C-terminal hydrolases,UCHs)和泛素特异性
DNA 的修复。
2.6 SUMO 化
SUMO为小泛素相关修饰物 (small ubiquitin- related modifier，SUMO)分子，是一种近年发现的泛素样分子，也参与 蛋白质翻译后修饰，但是不介导靶蛋白的蛋白酶体降解， 而 是可逆性修饰靶蛋白，参与靶蛋白的定位及功能调节过程。
3 研究方法及关键技术
蛋白酶 (ubiquitin-spicific processing proteases,
UBPs) ，两者都是半胱氨酸水解酶。泛素化降解蛋白 的过程中对蛋白的特异性识别依赖E3. 由E2s 和E3s 介导的泛素化过程可以被去泛素化酶 (DUBs)逆转通常 情况下, UCHs 主要水解羰基端的酯和泛素的氨基键,
2.3 糖基化
发生在高尔基体上：起始于丝氨酸和苏氨酸羟基 上连接N-乙酰半乳糖胺、N-乙酰葡萄糖胺、甘露糖及
蛋白质组学英语
蛋白质组学英语
蛋白质组学是一种研究生物体内蛋白质的组成、结构和功能的技术和方法，是生物学、生化学、药学等领域的前沿学科。
蛋白质组学的主要研究内容包括蛋白质组分析、蛋白质组测序、蛋白质结构与功能分析等。
在蛋白质组学研究中，英语是必不可少的工具和语言。
因此，掌握蛋白质组学英语是非常重要的。
以下是一些蛋白质组学常用英语词汇：
1. proteome - 蛋白质组
2. protein identification - 蛋白质鉴定
3. protein quantification - 蛋白质定量
4. mass spectrometry - 质谱分析
5. peptide mapping - 肽质谱图分析
6. protein structure analysis - 蛋白质结构分析
7. protein function analysis - 蛋白质功能分析
8. protein-protein interaction - 蛋白质间互作
9. protein modification - 蛋白质修饰
10. post-translational modification - 翻译后修饰
除了以上词汇外，还有许多其他与蛋白质组学相关的英语词汇，需要我们在学习和研究中不断积累和运用。
- 1 -。
翻译后修饰蛋白质组与代谢组整合分析
翻译后修饰蛋白质组与代谢组整合分析蛋白质的翻译后修饰（Post Translational Modifications, PTMs）是蛋白质在翻译中或翻译后经历的一个共价加工过程。
翻译后修饰蛋白质组是指细胞或组织等整体水平上的翻译后修饰蛋白质。
目前，已知的蛋白质翻译后修饰主要包括糖基化、磷酸化、酰化、泛素化、二硫键配对、甲基化和亚硝基化等等。
代谢组是细胞、组织或生物体内的小分子（通常称为代谢物）的整体水平。
翻译后修饰蛋白质可以调节细胞生物过程、影响机体的代谢变化。
影响代谢的翻译后修饰蛋白质不仅包括翻译后修饰转录因子，还包括翻译后修饰代谢酶。
因此，整合分析翻译后修饰蛋白质组和代谢组，比较它们的表达异同，有利于从不同层面解析生物的代谢机制，挖掘差异修饰蛋白质、代谢物、及它们参与的重要通路和相关基因，以进行后续深入研究。
百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合nanoLC-MS/MS纳升色谱，将磷酸化/糖基化/泛素化/乙酰化/甲基化/二硫键/亚硝基化等翻译后修饰鉴定服务，多种样品靶向和非靶向代谢组学分析服务，结合可定制化的生物信息学分析方法进行整合，为广大科研工作者提供基于质谱的翻译后修饰蛋白质组与代谢组整合分析服务。
翻译后修饰蛋白质组与代谢组整合分析流程翻译后修饰蛋白质组与代谢组整合分析流程。
应用领域农林领域：抗逆胁迫机制，物种保护研究等；畜牧业：致病机理研究，肉类及乳制品品质研究等；海洋水产：渔业环境与水产品安全等；微生物：致病机理，耐药机制，病原体-宿主相互作用研究等；生物医药：生物标志物，疾病机理机制，疾病分型，药物开发，个性化治疗等；环境科学：发酵过程优化，生物燃料生产，环境危害风险评估研究等；食品科学：食品储藏及加工条件优化，食品组分及品质鉴定，食品安全监检测等。
中/英文项目报告在技术报告中，百泰派克会为您提供详细的中/英文双语版技术报告，报告包括：1. 实验步骤（中英文）。
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凝集素在糖蛋白研究中的作用
凝集素是一类能和糖结合的蛋白，专一 识别某一特定结构的单糖或寡糖中特定 的糖基序列并结合
由于其专一性，不仅可以用于分离纯化， 还可以用于结构分析
伴刀豆球蛋白（ConA）－N-高甘露糖 麦胚凝集素（WGA）－杂合型N-糖链 兵豆凝集素－核心岩藻糖
PSD－MALDI－TOF－MS
PSD：源后衰变（post-source decay），母离子在飞行中发生断裂，丢 失一个中性分子。磷酸化肽段丢失HPO3或者H3PO4，产生质量数减少 80kD或者98kD的子离子。
磷酸化位点的确定
用串联质谱（MS/MS）对磷酸化肽进行分析。 将磷酸化肽打碎，产生全部碎片离子，根据离子数量推断肽
磷酸化蛋白质酶解后的磷酸化肽段，因为其 化学性质的负电性，在质谱技术中面临着难 以质子化的困难。
磷酸化蛋白质的检测
32P放射性同位素法 抗体免疫印迹法
32P放射性同位素法
-32P-ATP渗入培养 蛋白样品的制备 双向电泳 检测
考染或者银染 放射自显影
差异点分析 检测
真核生物的Ser，Thr，Tyr 残基. 原核生物的His，Asp，Glu
蛋白质组学在磷酸化分析中的困难
磷酸化蛋白质在细胞内的蛋白质中是相对较 低丰度的；
即使我们找到一种磷酸化蛋白质，也不能排 除有该蛋白质的其他磷酸化形式存在；
细胞内有很多磷酸酯酶，在样品处理时，这 些酶很容易将磷酸基团脱掉；
氨基酸序列的测定
m/z=4792.23
TSAASSSNYCNQM
RQHMDSSTSAASSSNYCNQ MMKSRNLTKDRCKPVNTF VHE
糖基化类型的分析
糖蛋白进行蛋白酶切，得到含糖肽段，对肽段直接 进行ESI-MS/MS，以及MALDI-TOF-MS的PSD， 可以直接得到单糖碎片，从而确定糖链结构。
蛋白质组学
浙江大学 生命科学学院
江辉
第五章 蛋白质 翻译后修饰的鉴定
蛋白质的翻译后修饰
很多前体蛋白是没有活性的，常常要进行一个系列 的翻译后加工，才能成为具有功能的成熟蛋白。
加工的类型是多种多样的，一般分为四种：
N-端fMet或Met的切除：原核生物的肽链，其N-端不保 留fMet，大约半数蛋白由脱甲酰酶（deformylase）除去 甲酰基，留下Met作为第一个氨基酸；在原核及真核细 胞中fMet或者Met一般都要被除去
抗体免疫印迹法
优点
灵敏 直观
克服同位素法的局限
无同位素污染，操作相对方便 可检测无磷酸化转换的蛋白 能区分不同残基使用磷酸化蛋白的抗体 IMAC法 磷酸基团亲和取代
磷酸化蛋白的抗体
目前已经开发出针对 特异磷酸化位点的单 克隆抗体，-pTyr， -pSer， -pThr
组蛋白上的甲基化和乙酰化与转录调节有关。
蛋白质组学如何在翻译后 化学修饰中发挥作用？
磷酸化 糖基化
蛋白质磷酸化
磷酸化是通过蛋白质激酶将ATP 的磷酸基转移到蛋 白的特定位点上的过程.
Protein + ATP 激酶 protein-P + ADP
至少有30%的蛋白被磷酸化修饰 大部分蛋白磷酸化是可逆的 磷酸化的作用位点
autoradiography
放射性同位素法
优点
灵敏 直观
局限
同位素污染，操作不方便 若磷酸化转换速率低，则难以检测 不能区分不同残基的磷酸化
抗体免疫印迹法
蛋白样品的制备 双向电泳 检测
考染或者银染 免疫印迹（磷酸化特异抗体）
差异点分析 检测
二硫键的形成 化学修饰 剪切：很多的前体蛋白要经过剪切后方可成为成熟的蛋
白 ，如胰岛素
蛋白质的翻译后化学修饰
蛋白质翻译后修饰在生命体中具有十分重要的作 用，它使蛋白质的结构更为复杂, 功能更为完善， 调节更为精细, 作用更为专一。
化学修饰的类型也很多，包括磷酸化（如核糖体 蛋白的Ser，Tyr和Trp残基常被磷酸化）；糖基化 （如各种糖蛋白）；泛素化（要进入蛋白酶体降 解的蛋白）；甲基化（如组蛋白，肌蛋白），乙 酰化（如组蛋白），羟基化（如胶原蛋白）等。
IMAC
填料－交联剂－金属螯合剂－金属离子
MS MS/MS
磷酸基团亲和取代
将磷酸肽上的磷酸基团用另一种配基取代， 再用亲和纯化的方法分离富集磷酸肽
生物素取代
生物素取代
以-干酪素做测试
磷酸肽的识别
MALDI－TOF－MS结合磷酸酶水解法 磷酸酯酶处理蛋白质的前后，磷酸化肽段的质量数会有变化，比较 前后图谱，寻找质量数变化80或98Da和强度增大的信号就很可能是 磷酸化肽段。 丝氨酸和苏氨酸磷酸化肽段的质量变化可能是80Da，也可能是98Da； 酪氨酸磷酸化肽段只有80Da的质量数变化
息）； 研究糖基化的功能（即功能信息）
蛋白质组学分析糖蛋白
糖含量 糖苷键类型 糖基化位点
糖含量的测定
比较糖苷内切酶作用前后糖蛋白的分子量
糖苷键酶F作用前
糖苷键酶F作用后
糖苷键酶F：切断N-连接 五糖核心最内侧的 GlcNAc-GlcNAc，剩一个 GlcNAc
核糖核酸酶B中糖基含量测定
糖基化类型及其位点的分析
糖苷内切酶和蛋白酶结合的方法
先用糖苷内切酶消化，再用蛋白酶消化，通 过分析糖苷酶作用前后MS发生位移的肽段， 即可确定含糖基化的肽段
结合串联质谱，可进一步分析糖基化肽段的 氨基酸序列，从而发现糖基化位点
核糖核酸酶B中糖基化位点的分析
糖苷键酶F作用前
糖苷键酶F作用后 剩一个GlcNAc
序列和磷酸化位点。 磷酸化位点产生丢失80kD或者98kD的子离子。
糖基化的蛋白质组学研究
糖基化蛋白的生物学意义
在真核细胞中，有一半以上的蛋白质被糖基化 蛋白质糖基化在蛋白质折叠、蛋白质定位和转运、
蛋白质溶解性、抗原性以及细胞与细胞的相互作用 等方面都有着重要的作用 细胞膜的许多蛋白质是以糖蛋白形式存在 糖低聚物在细胞间信号传递中也起了重要的作用 成为免疫系统调控和癌症治疗的最重要的线索之一 糖链比核酸和蛋白质在结构上更具有可变性，复杂 性
翻译后化学修饰的生物学效应
泛素化对于细胞分化与凋亡、DNA 修复、免疫应 答和应激反应等生理过程起着重要作用;
磷酸化涉及细胞信号转导、神经活动、肌肉收缩 以及细胞的增殖、发育和分化等生理病理过程;
糖基化在许多生物过程中如免疫保护、病毒的复 制、细胞生长、炎症的产生等起着重要的作用;
脂基化对于生物体内的信号转导过程起着非常关 键的作用;
利用这些单克隆抗体 进行亲和纯化，可以 分离和富集特定磷酸 化的蛋白
固定金属鳌和亲和层析(Immobilized
metal affinity chromatography ，IMAC)
IMAC技术是用于富集磷酸化的肽段，对磷酸化蛋白质的 富集是无效的。
利用了磷酸基团的负电性，与IMAC柱上的带正电的金属 离子结合，从而起到纯化的作用。
糖苷键类型
N连接：天冬酰胺序列子Asn-X-Thr/Ser O连接:Ser/Thr 糖基磷脂酰肌醇锚 (glycosyl phophotidylinositol, GPI)：通常
是一些细胞膜蛋白或细胞壁蛋白，通过肌醇和细胞膜磷脂层 结合
蛋白质糖基化研究的基本目标
寻找编码糖蛋白的基因（即基因组信息）； 寻找糖基化位点（即糖基化位点信息）； 解析糖链及糖基化肽段的结构（即结构信
IMAC技术对丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸化都有效 IMAC技术使用的金属离子主要是Fe3+、Ga3+ 、Cu2+等 最主要的缺点是特异性不强：IMAC柱上的正电荷位点同
样会与肽段中的天冬氨酸、谷氨酸和组氨酸残基结合
对磷酸化肽段中的酸性残基进行了预先的甲基酯化，封闭了上述 氨基酸的酸性侧链。