Miller培养基
甜瓜作为葫芦科植物中的一种重要的园艺作物
甜瓜作为葫芦科植物中的一种重要的园艺作物，是全世界普遍栽培的重要水果，具有较高的商品价值和经济价值。
随着植物细胞工程和基因工程技术的迅速发展，应用组织培养、基因转化等技术手段进行甜瓜品质改良、提高抗逆性、创造新种质，已成为甜瓜育种快速有效的新方法。
甜瓜基因工程是利用分子克隆技术，分离、提取或人工合成具有抗病、抗虫、提高品质等某一特性的基因片段，并利用根癌农杆菌介导或基因枪等技术转入甜瓜植株，可获得前所未有的甜瓜新种质，这是进行甜瓜遗传育种、品种改良，拓宽种质资源范围的一条有效途径。
目前，转基因甜瓜研究主要集中在抗病、抗虫与提高果实品质和控制果实成热等方面，现就上述研究做一综述。
1 甜瓜组织培养研究进展随着基因工程技术在农作物育种中的研究与应用，甜瓜组织培养技术的开展为分子育种奠定了良好的基础。
建立高效的甜瓜再生体系是甜瓜基因工程中的关键性基础工作。
甜瓜组织培养工作起步较晚，自唐定台等首次报道了植物激素在甜瓜再生过程起作用之后，有关甜瓜的组织培养的报道相继出现。
Dirks等通过真叶、侯喜林等通过下胚轴、马国斌等通过生长点、尹俊等通过胚、钟俐等通过子叶节、于喜艳等通过子叶等多种外植体方式获得甜瓜再生植株。
甜瓜组织培养过程中受到的影响因素很多，主要如下。
1.1 外植体基因型基因型对甜瓜不定芽发生和植株再生具有决定性作用，选择不同甜瓜品种进行组织培养研究，外植体基因型差异对再生率影响明显，繁殖系数差异较大。
主要表现在不同品种间不定芽的发生和植株再生能力的不同。
于为常等研究证明，S-24和网纹香两甜瓜品种各种外植体中内源IAA含量很高，超过一般植物的数倍，并以胚轴中含量最高而且愈伤组织中的IAA的含量超过各种外植体，这可能是导致不同品种甜瓜外植体不定芽诱导效果不同及愈伤组织不易分化的缘故。
根据资料显示，甜瓜组织培养过程中不定芽发生能力是一种受基因型控制的数量性状，并有可能存在基因间的互补作用。
蔡润等对引进杂交种和农家品种进行的子叶培养结果表明，杂交种的不定芽诱导率高于当地品种。
如何配制MS培养基
▲
水
二 、
无机盐
培 养
有机物
基
成
植物激素
分
培养体支持材料
辅助性物质
▲
一、无 机 盐
▲
氮 枝叶生长需要氮素，缺氮老叶先发黄； 氮过量，枝叶过度茂盛 。 磷 缺磷，植株生长缓慢，老叶暗紫色。 钾 促进花卉生长健壮，增强抗性，茎秆
受高温影响小，可高温消毒
等 电 点 PH=6.0， 碱 性 溶 液 中 易变质，光能加速变质 对光、空气、热稳定是转氨酶 的辅酶 受高温影响小，可高温消毒， 参与丝氨酸转变为甘氨酸过程
123.11 极易溶于水、乙醇 对空气、光、热、PH值稳定
244.31 441.40 176.12 180.16
溶于水、乙醇 易溶于乙酸、 NaOH、微溶于水 极易溶于水
VB3
与植物代谢和胚的发育有关系
▲
氨基酸：甘氨酸、精氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬 氨酸、 天冬酰胺、丙氨酸等等。因培养基的种类不同， 其种类和浓度不同。 肌醇：又称环己六醇，在糖类的转化中起作用
常见糖和维生素及其主要性质
名称 蔗糖 山梨糖 葡萄糖 果糖 盐酸硫胺素（VB1） 核黄素（VB2） 盐酸吡哆素（VB6） 钴胺素（VB12） 烟酸（VPP） 生物素（VH） 叶酸（VM） 抗坏血酸（VC） 肌醇
又称环己六醇在糖类的转化中起作用名称分子量溶解性质性质蔗糖34230溶于水乙醇无变旋现象山梨糖18016溶于水甜味与蔗糖相似葡萄糖18016溶于水有变旋现象以游离态或磷酯形式存在果糖18016溶于水乙醇有变旋现象甜度高于蔗糖盐酸硫胺素vb133728溶于水乙醇甘受高温影响小可高温消毒核黄素vb237637溶于无水乙醇微溶于水等电点ph60碱性溶液中易变质光能加速变质盐酸吡哆素vb620564溶于水乙醇对光空气热稳定是转氨酶的辅酶钴胺素vb12135542溶于水乙醇受高温影响小可高温消毒参与丝氨酸转变为甘氨酸过程烟酸vpp12311极易溶于水乙醇对空气光热ph值稳定生物素vh24431溶于水乙醇对空气温度稳定叶酸vm44140易溶于乙酸naoh微溶于水参与生物甲基化作用抗坏血酸vc17612极易溶于水有较强的还原能力可做抗氧化剂用参与酪氨酸代谢及色氨酸的羟基化作用18016易溶于水植物中广泛存在可能与iaa的代谢有关常见糖和维生素及其主要性质椰乳
植物细胞工程技术原理
▪ 太大，培养基过硬；太小，培养基不易凝固。
▪ 吸附剂：活性碳，适用于培养中容易形成不利于
生长的分泌物的培养物。
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pH 变动
▪ 高中化学：无机盐溶液酸碱性的判断依据是，该盐是否发生水 解。强酸强碱盐如NaCl中性；强酸弱碱盐如NH4Cl酸性；强 碱弱酸盐如Na2CO3碱性。
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4、培养
▪ 温度：24℃左右 一般材料20~30℃
▪ 光照：初期弱光，后期强光；光周期一般 12~16小时
▪ 气体调节（O2）：
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二、外植体的选取及接种培养
▪ 1、外植体（explant）的选取
▪ 外植体：是指用于离体培养的活的植物组织、器官等材 料。
▪ 用于外植体分离的母体植物材料一般有三种来源：
一是生长在自然环境下的植物；
二是有目的地培育在温室控制环境条件下生长的植物；
三是无菌环境下已经过离体培养的植物。
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2、培养基的分类
▪ 按性质分：
基本培养基 完全培养基：基本培养基加激素
▪ 按状态分
固体培养基
液体培养基
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2、培养基的分类
▪ 基本培养基按照组成成分又可分为很多种，常见的 如MS、Miller、B5、N6、T、LS、H、KM8P等。 根据其盐浓度大致可分为四类：
▪ 富盐平衡培养基： MS
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2、外 植 体 灭 菌
▪ 灭菌程序及筛选
外植体
清洗整理 准备室
杀菌剂灭菌 超净台上
BD培养基目录BD培养基
BD培养基⽬录BD培养基BD培养基⽬录BD培养基-分⼦⽣物学⽤YNB⽆氨基酸酵母氮源BD291920-2kg3,868.00YNB⽆氨基酸酵母氮源BD291920-500g1,280.00YNB⽆氨基酸酵母氮源BD291920-100g350 Yeast Nitrogen Base酵母氮源BD239210-100g546 Yeast Extract TechnicalBD288610-10kg4,591.00Yeast Extract Technical BD288620-500g511Yeast Extract酵母粉BD BD212720-2kg2,011.00如果您对上述产品感兴趣，请致电183********或QQ：3259632176，上海⾦畔⽣物科技有限公司进⼀步了解详情。
Yeast Extract酵母粉BD BD212750-500g591 Tryptose Broth胰蛋⽩⽰⾁汤BD262200-500g848Tryptose胰蛋⽩⽰BD BD211713-500g1,574.00Tryptone胰蛋⽩胨BD BD211699-2kg3,381.00Tryptone胰蛋⽩胨BD BD211705-500g955 Tryptic Soy Broth(TSB)胰酶⼤⾖⾁汤BD BD211822-2kg2,076.00Tryptic Soy Broth(TSB)胰酶⼤⾖⾁汤BD BD211825-500g495Tryptic Soy Agar（TSA）胰酶⼤⾖琼脂BD236920-2kg2,634.00Tryptic Soy Agar（TSA）胰酶⼤⾖琼脂BD236940-100g601 Tetrathionate Broth Base BD210430-500g421TAT Broth Base BD298410-500g1,008.00 Sabouraud Dextrose agar沙⽒葡糖琼脂BD BD211661-2kg1,850.00 Sabouraud Dextrose agar沙⽒葡糖琼脂BD210950-500g531R2A Agar R2A琼脂BD218261-2kg4,323.00如果您对上述产品感兴趣，请致电183********或QQ：3259632176，上海⾦畔⽣物科技有限公司进⼀步了解详情。
培养基的成分
常见糖和维生素及其主要性质
名称 蔗糖 山梨糖 葡萄糖 果糖 盐酸硫胺素（VB1） 核黄素（VB2） 盐酸吡哆素（VB6） 钴胺素（VB12） 分子量 342.30 180.16 180.16 180.16 337.28 376.37 205.64 1355.42 溶解性质 溶于水、乙醇 溶于水 溶于水 溶于水、乙醇 溶于水、乙醇、甘 油 溶于无水乙醇、微 溶于水 溶于水、乙醇 溶于水、乙醇 性质
氮 枝叶生长需要氮素，缺氮老叶先发黄； 氮过量，枝叶过度茂盛 。 磷 缺磷，植株生长缓慢，老叶暗紫色。 钾 促进花卉生长健壮，增强抗性，茎秆 挺拔。缺钾，叶尖、叶缘枯焦，叶片呈 皱曲状，老叶发黄或火烧状。 钴 缺钴，叶片失绿而卷曲，整个叶片向 上弯曲凋枯。
碳水化合物
二、 维 生 素 有 机 天然复合物 物
培养基
一、掌握培养基的种类及其特点
三、掌握培养基的组成和其适宜剂量
二、掌握MS培养基配制 四、理解培养基筛选方法
目 的 要 求 ：
第一节
培养基的种类和成分
一、培养基种类▼ 二、培养基成分▼
第二节 培养基制备
一、母液配制和保存
▼
二、培养基配制、分装和灭菌▼
第三节 培养基的选择▼
一、单因子试验 二、多因子试验
肌 氨 基 醇 酸
椰子汁（CM）
酵母浸出液（YE) 马铃薯汁液 水解酪蛋白（CH)
其
它
▲
碳水化合物
• 选用种类：蔗糖（或葡萄糖、果糖）等 • 蔗糖浓度：2%～3%，胚培养为4%～15% • 大生产时可用白糖
▲
糖在培养基的作用： 1）为细胞提供合成新物质的碳骨架 2）为细胞的呼吸代谢提供底物和能量
MS培养基
常 用 培 养 基 种 类
植物组培复习资料
1、愈伤组织：原指植物在受伤之后于伤口表面形成的一团薄壁细胞，在组培中则指人工培养基上由外植体长出来的一团无序生长的薄壁细胞。
2、植物细胞全能性：任何具有完整细胞核的植物细胞，都拥有形成一个完整植珠所必须的全部遗传信息和发育成完整植株的能力。
3、胚状体：是指在组织培养中起源于一个非合子细胞，经过胚胎发生和胚胎发育过程形成的具有双极性的胚状结构。
4、体细胞杂交：完全不经过有性过程，只通过体细胞融合制造杂种的方法称为体细胞杂交。
快速繁殖(微繁殖)：用组织培养的方法，使植物的部分器官、组织迅速扩大培养，并移到温室或农田繁殖出大量幼苗的繁殖方法。
6、再分化：愈伤组织形成不定芽或不定根或胚状体。
7、原生质体融合（体细胞杂交）：就是使分离下来的不同亲本的原生质体，在离体条件下通过诱导发生的质膜融合进而细胞核融合，像性细胞受精作用那样互相融合成一体的现象。
8、脱毒苗：是指不含该种植物的主要危害病毒，即经检测主要病毒在植物内的存在表现阴性反应的苗木。
9、愈伤组织培养:是指将母体植株上的外植体，接种到无菌的培养基上，进行愈伤组织诱导、生长和发育的一门技术。
10、外植体：在植物组织培养过程中，由植物体上切取的根、茎、叶、花、果、种子等器官以及各种组织、细胞或原生质体等统称为外植体。
11、热处理脱毒：利用病毒和植物细胞对高温忍耐性不同，选择适当的高温处理染病植株，使植株体内的病毒部分或全部失活，而植株本身仍然存活。
12、平板培养法：是把单细胞悬浮液与融化的琼脂培养基均匀混合，平铺一薄层在培养基底上的培养方法。
13、消毒：指杀死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再发生危害作用。
14、玻璃化现象：在长期的离体培养繁殖时，有些试管苗的嫩茎、叶片呈现半透明水渍状，这种现象称为玻璃化。
15、初代培养基：是指用来第一次接种外植体的培养基。
16、脱分化：一个已停止分裂的成熟细胞转变为分生状态，并形成未分化的愈伤组织的现象。
17、液体培养：指在进行培养时，培养基中不加琼脂等凝固剂，一般需要通过振荡等方法解决培养基的通气情况。
培养基成分及配制课件
2
硼酸
3
硫酸锰
4
硫酸锌
5
钼酸钠
6
硫酸铜
7
氯化钾
KI H3BO3 MnSO4.4H2O ZnSO4.7H2O Na2MoO4.2H2O CuSO4.5H2O CoCL2.6H2O
用量（mg/L)
0.83 6.2 22.3 8.6 0.25 0.025 0.025
培养基成分及配制课件
1.大量元素
2021/8/25 培养基成分及配制课件
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2021/8/25 培养基成分及配制课件
3. 肌醇（环己六醇）
促进糖类物质的相互转化和活性物质作用的发挥 促进愈伤组织生长以及胚状体和芽的形成 对组织细胞繁殖、分化的促进作用 使用浓度100 mg/L
注：用量过多则促褐变
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2021/8/25 培养基成分及配制课件
4. 氨基酸
是很好的有机氮源，可直接被细胞吸收利用。 培养基中最常用的氨基酸是甘氨酸，其他的如精氨酸、
在离体培养条件下，不同种植物的组织对营养有不 同的要求，甚至同一种植物不同部位的组织对营养 的要求也不相同，只有满足了它们各自的特殊要求， 它们才能很好地生长。因此，没有一种培养基能够 适合一切类型的植物组织或器官。
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2021/8/25 培养基成分及配制课件
在建立一项新的培养系统时，首先必须找 到一合适的培养基，培养才有可能成功。在植 物组织培养历史进程中，事实上也紧密地伴随 着培养基的研制史。
谷氨酸、谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等也常 用。
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2021/8/25 培养基成分及配制课件
5. 天然复合物
为了特殊的培养目的，在一部分培养基中还添加了 一些特殊成分，如水解酪蛋白，水解乳蛋白，酵母提取 物，胰蛋白胨，椰乳，西红柿汁，香蕉粉，橘子汁，可 可汁等天然复合物以及活性炭，渗透调节剂等。
β-半乳糖苷酶活性测定方法
β-半乳糖苷酶活性测定（β-galactosidase assays）1、将过夜培养的菌液按1%接种量到新鲜培养基中培养，待OD600至0.6时取出，放置于冰上；（或可检测不同OD600时，菌的酶活性）2、取50-100μl 菌液至1.5 ml 的离心管中，加370-420μl Z buffer；3、加20 μl 氯仿和10 μl 0.1% SDS，振荡混匀，裂解细胞，放置于冰上30分钟；4、向离心管中加入100 μl 浓度4 mg/ml 的ONPG，混匀后立即置于30℃反应30-60分钟；5、待颜色变黄后，加入250 μl 1 M Na2CO3中止反应，准确记录变色反应的时间；6、取200μl上清，测定420 nm 和550 nm 处的吸光度；7、计算β-半乳糖苷酶酶活力：Miller Units = 1,000×[(OD420－1.75×OD550)] / (t×V×OD600)，其中，OD420和OD550----显色后的反应液读数；OD600----用于显色分析的培养液的细菌密度；t ----显色反应时间(单位min)；V ----用于显色分析的培养液体积(单位ml)。
Z buffer (总体积100 ml)：Na2HPO4·12H2O 100mM 3.5814 gNaH2PO4·H2O 40mM 0.624gKCl 10mM 0.07455gMgSO4·7H2O1mM 0.0246gβ-mercaptoethanol 5.4μl / ml 540μl加水到总体积90 ml，待试剂溶解后调pH 至7.0，最后定容到100 ml，4℃储存。
Substrate solution(总体积10ml)----现用现配Na2HPO4·12H2O 60mM 0.215 gNaH2PO4·H2O 40mM 0.0624gONPG 4mg/ml 0.04g终止液（100ml）：Na2CO3 1M 10.6g。
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北京雷根生物技术有限公司
Miller 培养基
简介：
植物组织培养技术即植物无菌培养技术，又称离体培养技术，是根据植物细胞具有全能性的理论，利用植物体离体的器官(如根、茎、叶、花、茎尖、果实等)、组织(如形成层、表皮、表层、髓部细胞、胚乳等)或细胞(大孢子、小孢子、体细胞等)以及原生质体，在细菌和适宜的人工培养基及环境条件下，能够诱导出愈伤组织、不定芽、不定根、最后形成完整菌株的技术。
Leagene Miller 培养基主要由硝酸钾、硝酸钙、硫酸镁、磷酸盐等组成，硝酸钾工作浓度为1000mg/L 、硝酸铵工作浓度为1000mg/L 。
该试剂特点是硝酸盐含量较高，经高压灭菌，为无菌溶液。
该试剂仅用于科研领域，不用于临床诊断或治疗。
产品组成：
操作步骤(仅供参考)：
1、 根据实验需求操作。
注意事项：
1、 要根据不同的材料、不同的物种，选择合适的培养基，最好通过实验获得。
2、 如需严格无菌，可再次于121℃高压灭菌15-20min 。
有效期： 6个月有效。
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