酶底物法(科立得)检测总大肠菌和大肠埃希 菌(或粪大肠菌)技术参数
酶底物法检测水中总大肠菌群的方法确认
摘 要 ：目的 通过 比较酶底物法与多管发酵法测定水 中总大肠菌群 的一致性 ，判定在某 实验 室条件下 能否用酶底 物法 替代 多管发酵法测定水 中总大肠菌群 。方 法 利用加 标实 验检测 方法 ，比较 酶底物 法和多 管发 酵法检测 结果 的一致 性 。结果 酶底 物法 与多 管发 酵法 用 于水 中大 肠 菌 群检 测 结果 具 有 一致 性 ，差 异无 统计 学 意义 （ｔ：０．８９，Ｐ＞ ０．０５）。结论 酶底物法具有快速简便 的特 点 ，可以作 为评价水质微生物污染的标准方法 。 关键 词 ：酶底 物法 ；总大肠 菌群 ；方 法确认 中图分类号 ：Ｒ１２３．１ 文献标识码 ：Ｂ 文章编 号 ：１００３—６２４５ （２０１５）０５—０５０９—０２
ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｈａｓ ｎｏ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙ ｓｉｇｎｉｆ ｉｃａｎｔ（ｔ＝０．８９，Ｐ＞０．０５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ Ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｔｅｃｈ—
ｎｉｑｕｅ ｉｓ ａ ｒａｐｉｄ ｍｅｔｈｏｄ，ａｎｄ ｉｔ ｃａｎ ｂｅ ｕｓｅｄ ａｓ ａ ｓｔａｎｄａｒｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｗａｔｅｒ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓａｆｅｔｙ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｅｎｚｙｍｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ；Ｔ ｏ ｔａｌ ｃｏｌｉ ｆｏｒｍ ｂａｃｔｅｒｉａ；Ｍｅｔｈｏｄ ｃｏｎｆｉｒ ｍ ａｔｉｏｎ
酶底 物 法 （ｅｎｚｙｍｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ） 的 原 理 是 ：利 用 大 肠 菌 群 细 菌 能 产 生 ｐ２ 半 乳 糖 苷 酶 （ Ｂ２Ｄ２ｇａ１ａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ） 分 解 ＯＮＰＧ （ Ｏｒｔｈｏ２ ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙ１２￣２Ｄ２ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ），使 培 养 液 呈 黄 色 ，检测水样 中是否含有大肠菌群。利用大肠埃希氏 菌 产 生 Ｂ２葡 萄 糖 醛 酸 酶 （１３２ｇｌｕｅｕｒｏｎｉｄａｓｅ） 分 解 ＭＵＧ （４２ ｍ￣ｔｈｒ＇１２ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙ１２￣２Ｄ２ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅ），使
粪大肠菌群检测标准
粪大肠菌群的检测标准根据不同的国家和地区以及不同的应用场景可能会有所不同。
一般来说，粪大肠菌群的检测标准通常是以每克或每毫升样品中的大肠菌群数量来表示的，常用的单位有CFU/g或CFU/mL。
在某些国家或地区，对于饮用水、食品等相关行业的检测标准可能会更加严格。
例如，某些国家可能规定饮用水中不得检出大肠菌群，而在某些食品中则可能规定每克样品中大肠菌群的数量不得超过一定数值。
需要注意的是，粪大肠菌群并非单一菌种，而是一组菌群的统称。
因此，在检测过程中需要针对这一组菌群进行检测，而非单一菌种。
同时，为了确保检测结果的准确性，检测过程需要严格遵守相关操作规范，避免交叉污染等因素的影响。
酶底物法测定水中总大肠菌群和大肠埃希氏菌综合试卷解析及答案
一、填空题1．采用固定底物技术酶底物法定性测定总大肠菌群和大肠埃希氏菌(粪大肠菌群)时，需要取 ml水样，在±℃培养 h。
①②答案：100 36 1 242．采用固定底物技术酶底物法定性测定总大肠菌群，水样加入培养基后经过适当温度及时间培养后，呈现色为阳性。
①答案：黄3．采用固定底物技术酶底物法定性测定大肠埃希氏菌，水样加入培养基后经过适当温度及时间培养后，将呈现——色的水样在暗处用波长为__ ___nm的紫外灯光照射，如果有产生则表示有大肠埃希氏菌存在。
②答案：黄 366 蓝色荧光4．采用固定底物技术酶底物法定量测定总大肠菌群和大肠埃希氏菌时，水样加入培养基摇匀后，需倒入51孔或97孔无菌定量盘内，以手抚平定量盘背面以，然后用封口。
①②答案:赶除孔穴内气泡程控定量封口机二、判断题1．总大肠菌群酶底物法是指在选择性培养基上能产生乒半乳糖苷酶的细菌群组，该细菌群组能分解色原底物释放出色原体使培养基呈现颜色变化，以此技术来检测水中总大肠菌群的方法。
( )①答案：正确2．采用固定底物技术酶底物法测定总大肠菌群和大肠埃希氏菌可以定性测量，也可以定量测量。
( )①②答案：正确3．采用固定底物技术酶底物法可在48h判断水样中是否含有总大肠菌群和大肠埃希氏菌及含有的总大肠菌群和大肠埃希氏菌的最可能数值。
( )①②答案：错误正确答案为：应该是24h。
三、问答题采用固定底物技术酶底物法定量测定大肠埃希氏菌时，采用正确步骤培养后的样品，怎样判断大肠埃希氏菌的数值?②答案：采用固定底物技术酶底物法定量测定大肠埃希氏菌，采用正确步骤培养后的样品，观察51孔或97孔无菌定量盘，将变成黄色的水样的定量盘在暗处用波长为366nm的紫外灯光照射，如果有蓝色荧光产生则表示该定量盘孔穴中有大肠埃希氏菌存在，计算有荧光反映的孔穴数，对照MPN表即可查出大肠埃希氏菌最大可能数(MPN)，结果以MPN／100m1表示；如所有孔未产生荧光，则可报告为大肠埃希氏菌未检出。
检测大肠杆菌
培养 24h
10管法或51孔定量盘法培养
培养基：颜色变为黄 色为阳性
结果用最大可能数表示（查表）
采用固定底物技术，能产生β-半乳糖苷酶酶分解色原底物释放出色原使 培养基颜色变化。样品用量100ml，检测时间1-2days
大肠杆菌埃希氏菌多管发酵法：多管发酵法总大肠杆菌群 阳性，在含有荧光底物的培养基上44.5培养24h，产生β-葡 萄糖醛酸酶，分解荧光底物释放出荧光产物，使培养基在 紫外光下产生特征性荧光的细菌 大肠杆菌埃希氏菌滤膜法：将总大肠杆菌群阳性的滤膜在 含有荧光底物的培养基培养，产生β-葡萄糖醛酸酶，分解 荧光底物释放出荧光产物，使培养基在紫外光下产生特征 性荧光的细菌
江琴 主要参考：GB5750-12 《生活饮用水标准检测方法-微生物指标》
菌落总数 水样在营养琼脂上有氧环境条件下37℃培养48h 后，获得1ml水样所含有菌落的总数 -活菌总数 总大肠杆菌 指一群在37 ℃培养24h能发酵乳糖、产酸产气、需氧 和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌
耐热大肠杆菌群
用提高培养温度的方法将自然环境中的大肠杆菌与粪便中的 大肠杆菌群分开，在45.5 ℃仍能生长的大肠杆菌群
3、暗处，366nm紫外， 蓝色荧光，为阳性
2、在最后判 断时将黄色再 检测，366nm 紫外下产生蓝 色荧光
改进的酶底物法
•主要是合成新的底物，减少时间
基于分子生物学的方法
•DNA探针技术 •聚合酶链反应
基于免疫学的方法
•酶联免疫法 •胶体金免疫法 •荧光免疫法 •化学发光免疫技术 •电化学免疫法 •免疫磁珠法
试剂配制、滤膜滤器灭菌
过滤水样
培养：品红亚硫酸培养（24h）
取特菌落
染色、镜检
革兰氏染色阴性
水质总大肠菌群、粪大肠菌群和细菌总数监测技术规范
水质总大肠菌群、粪大肠菌群和细菌总数监测技术规范1 范围本文件规定了水中总大肠菌群、粪大肠菌群和细菌总数的术语和定义、采样技术要求、分析技术要求、质量控制要求、监测记录、注意事项等技术内容。
本文件适用于地表水、地下水、生活污水和工业废水中总大肠菌群、粪大肠菌群和细菌总数的监测。
2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。
其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 14848 地下水质量标准GB 3838 地表水环境质量标准HJ 1000 水质细菌总数的测定平皿计数法HJ 1001 水质总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的测定酶底物法HJ 164 地下水环境监测技术规范HJ 347.1 水质粪大肠菌群的测定滤膜法HJ 347.2 水质粪大肠菌群的测定多管发酵法HJ 630 环境监测质量管理技术导则HJ 755 水质总大肠菌群和粪大肠菌群的测定纸片快速法HJ/T 91 地表水和污水监测技术规范HJ 91.1 污水监测技术规范3 术语和定义3.1 总大肠菌群 total coliforms参照HJ 755定义为：37℃培养，24 h内能发酵乳糖产酸产气的需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽抱杆菌。
3.2 粪大肠菌群 fecal coliforms又称耐热大肠菌群（thermmotolerant coliforms ），参照HJ 755定义为：44.5℃培养24 h，能发酵乳糖产酸产气的需氧及兼性厌氧革兰氏阴性无芽抱杆菌。
3.3 细菌总数 total bacteria参照HJ 1000定义为：36℃培养48 h，样品在营养琼脂上所生长的需氧菌和兼性厌氧菌菌落总数。
4 采样技术要求14.1 样品采集4.1.1 地表水附近有桥梁的河流断面宜在桥上采样，湖库点位和水体较深的河流断面宜采用船只采样，水深较浅的河流断面宜涉水采样，按照HJ/T 91的相关规定执行。
水中总大肠菌群检测方法
水中总大肠菌群检测方法作者：尚伊娜来源：《青年文学家》2013年第05期摘要：目的本文对我站目前使用的酶底物法与过去使用的传统方法多管发酵法进行对比，分析两种方法的优缺点。
结果酶底物法与多管发酵法检测结果具有一致性。
结论酶底物法具备特异性和敏感性的同时更省时省力。
关键词：总大肠菌群；检测方法；比较[中图分类号]：R378.2+1 [文献标识码]：A[文章编号]：1002-2139（2013）-5--01总大肠菌群是指一群需氧及兼性厌氧、在37℃生长时能使乳糖发酵、在24小时内产酸产气的革兰阴性无芽胞杆菌。
是卫生监测中用以指示饮用水卫生状况及安全的指示性微生物1，因此水中检测总大肠菌群的方法必须具备特异、敏感性，同时还要省时省力并且低成本。
1、方法原理1.1 酶底物法方法原理酶底物法（enzyme substrate technique）利用大肠菌群β-半乳糖苷酶及大肠杆菌β-葡萄糖醛酸酶代谢的两种营养剂─指示剂：邻硝基苯-β-D-半乳派喃糖（ONPG）及甲基香豆基葡糖醛酸苷（MUG），作为 Colilert 试剂的主要碳源。
①利用大肠菌群细菌能产生β-半乳糖苷酶分解ONPG使培养液呈黄色，检测大肠菌群。
②利用大肠埃希氏菌产生β-葡萄糖醛酸酶分解MUG 使培养液在波长366nm紫外光下产生蓝色荧光，检测大肠埃希氏菌。
③改变培养温度，可检测耐热大肠菌群，因为大多数非─大肠杆菌属菌类没有这些酶，所以无法在 Colilert 试剂里生长及干涉这些物质。
而有这些酶的少数非─大肠杆菌属菌类会受到 Colilert 特殊配方的基质选择性的抑制作用。
1.2 多管发酵法方法原理多管发酵是根据大肠菌群细菌能发酵乳糖，产酸产气以及具备革兰氏染色阴性、无芽孢、呈杆状等有关特性，通过培养、计数来检测。
2、仪器设备及方法2.1 酶底物法2.1.1 仪器设备①程控定量封口机②酶底物24小时 Colilert试剂（爱德士公司提供）③51孔定量盘（无菌）；97 孔定量盘（无菌）④阳性51孔和97孔标准比色盘⑤100mL含硫代硫酸钠无菌取样瓶。
酶底物法测定水中粪大肠菌群的探讨
广东化工2021年第3期· 194 · 第48卷总第437期酶底物法测定水中粪大肠菌群的探讨许丹梅，吕玉容(佛山市环境监测中心站，广东佛山528000)[摘要]采用酶度物法测定地表水、地下水、生活污水、工业废水的粪大肠菌群，通过试验，样品的精密度良好，标准样品的测定值在理论值范围之内。
用此方法测定水中的粪大肠菌群，结果令人满意。
[关键词]酶度物法；水质；粪大肠菌群[中图分类号]O65 [文献标识码]A [文章编号]1007-1865(2021)03-0194-01 Determination of Fecal Coliform Group in Water by Enzyme Substrate MethodXu Danmei, Lu Yurong(Foshan Environmental Monitoring Center station, Foshan 528000, China)Abstract: The fecal coliform group in surface water, ground water, domestic sewage and industrial waste water was determined by enzymatic method. The precision of the sample was good, and the value of the standard sample was within the theoretical value. The method has been applied to the determination of fecal coliform bacteria in water with satisfactory results.Keywords: enzymatic method；water quality；fecal coliform粪大肠菌群是总大肠菌群中的一部分，主要来自粪便[1]。
菌落总数、总大肠菌群、粪大肠菌群、大肠埃希氏菌酶底物法水质自动分析仪——编制说明.docx
菌落总数、总大肠菌群、粪大肠菌群、大肠埃希氏菌酶底物法水质自动分析仪编制说明《酶底物法水质自动分析仪》起草工作组二〇二一年五月主要内容包括：1、任务来源2、协作单位3、主要工作过程1.任务来源日常生活中，总大肠菌群、粪大肠菌群、大肠埃希氏菌和菌落总数作为指示水质卫生质量的重要指标，已被广泛应用于水质安全评价工作中。
国家一系列标准对各指标给出了相应的规定限值。
目前微生物大多指标还是采用实验室手动检测，但是已经无法满足需求，随着2006年酶底物方法列入了国标，基于该方法的自动分析仪逐步形成，并可以满足当前需求。
但是目前没有一套该类产品的性能评价标准，所以，急需制定一套基于酶底物法微生物自动分析仪的产品标准，来规范产品的技术指标。
用标准来促进该类产品在整体质量和性能上的全面提升，建立产品质量监测的依据。
为有效预报和控制疾病的发生和传播早日做到有据可依。
在疫情仍然严峻，市场尚有强烈需求的今天，该标准的制定显得尤为重要和迫切。
该项目是国家重大仪器专项的科技成果转化。
2. 主要起草单位：青岛佳明测控科技股份有限公司。
协作单位：中国环境监测总站、军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所、吉林市光大分析技术有限责任公司、上海安杰环保科技股份有限公司、北京华夏科创仪器股份有限公司、广州市微生物研究所、聚光科技（杭州）股份有限公司、山东东润仪表科技股份有限公司。
3. 主要工作过程3.1成立标准编制组为了保证标准的适用性、实用性和可操作性，组建了以生产、科研与用户为一体的标准起草小组。
主要参加单位：青岛佳明测控科技股份有限公司、中国环境监测总站、军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所、吉林市光大分析技术有限责任公司、上海安杰环保科技股份有限公司、北京华夏科创仪器股份有限公司、广州市微生物研究所、聚光科技（杭州）股份有限公司、山东东润仪表科技股份有限公司。
起草工作小组成员的职责分工和所做的工作范围：青岛佳明测控科技股份有限公司为主草单位，高心岗任起草小组组长，主持全面指挥与组织协调工作。
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酶底物法（科立得）检测总大肠菌群和粪大肠杆菌（或大肠
埃希菌）
一 、适用范围：用于水样中的总大肠菌群和粪大肠杆菌（或大肠埃希菌）的同
步定量分析。
二 、工作环境 ：(a)室内使用：环境温度 -10°C～50°C
(b)电源供给：220V±10%，50HZ
(c）相对湿度：25%～85%，无凝结
三 、原理：1，大肠菌群细菌能特异性产生β-半乳糖苷酶（β-D-galactosidase），
该生物酶可以分解ONPG（Ortho-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside， β-
半乳糖醛苷），使培养液呈黄色。（注：检测 粪大肠菌 的培养温度为 44.5°C;
检测 总大肠菌 的培养温度为：36±1℃）
2，大肠埃希氏菌能特异性产生β-葡萄糖醛酸酶（β-glucuronidase），
分解MUG（4-甲基-伞形葡萄糖苷酸，4-methyl-umbelliferyl-β
-D-glucuronide）,使培养液在波长366nm紫外光下产生荧光。利用该原理，来
判断水样中是否含有大肠菌群及大肠埃希氏菌（或粪大肠菌）。
四、仪器技术参数：
1、国产程控定量封口机
# 技术指标 性能
（1） 可靠性 无漏液，无破孔
（2）噪音 <50 dba @ 2 ft.
（3）重量 <17公斤.
（4） 处理速度 <15秒/样品
（5） 预热时间 <15分钟
（6） 加热温度(内辊) 200°C +/- 10°C
（7） 外罩温度 <40°C
（8） 工作电压 220V±10%
（9） 工作环境温度 -10°C～50°C
（10）带51孔及97孔定量盘橡胶托垫
2、紫外灯
（1）6W 365 nm长波紫外灯，含灯管.
（2）尺寸：(9 cm x 7 cm x 27 cm)
（3）电源：220V
四 、技术参数指标：
（1）量程范围： 0－200个/100mL 或0－2419个/100mL
（2）绝对检出限：0个
（3）培养基：ONPG-MUG
（4）样品体积： 100mL
（5）检测周期： 24小时
五 、系统配置及性能指标：本配置能够简单快捷地同时测定水中总大肠菌群和
粪大肠菌群（或大肠埃希菌）；应包括所有能正常分析的仪器设备及消耗品：
1 、消耗品：应能保证1000个水样常规检测所需的消耗品
（1）DST酶底物法24小时Colilert试剂（ ONPG-MUG培养基）：200个/盒；
（2）取样瓶：独立密封包装；
（3） 定量盘：51孔或97孔；
2 、程控定量封口机（带51孔及97孔定量盘橡胶托垫）；
3 、6瓦特紫外灯，220v，366nm；