SOE―PCR在稻瘟病菌基因敲除中的应用
基因定点突破
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第四月 第三月 第二月 第一月
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大引物PCR megaprimer PCR
1.用引物P1和含突基因的 引物P2扩增模板DNA产 生双链大引物(PCR1).
2.纯化大引物，去除PCR1 剩下的引物和脱氧核苷酸， 同时加入引物P3，形成带 突变基因的双链DNA
3. 扩增带有突变基因的双 链DNA
三种经典基因定点突变方法比较
1 寡核苷酸引物介导的定点突变法 其优点是保真度比PCR突变法高，经过改进后使该方法突变成功率大大提高 缺点是操作过程环节复杂、周期长， 而且在克隆待突变基因时会受到限制性 酶切位点的限制。
抗稻瘟病水稻空育131BL3品种的BC1代的培育
抗稻瘟病水稻空育131BL3品种的BC1代的培育张庆鑫农业资源与环境（种子科学与工程） 20112791摘要：本研究是利用回交转育和MAS技术相结合的方法，欲将水稻品种中的广谱高抗的抗稻瘟病基因Pid2 、Pid3引进到黑龙江水稻品种空育131中，同时剔除了水稻中的不利特性，拟培育出寒区水稻空育131不同抗稻瘟病基因的近等基因系。
本研究结果将为寒区培育出优良的早粳稻抗稻瘟病新品系.关键词：回交转育和MAS技术抗稻瘟病基因Pid2 、Pid3 空育131 抗稻瘟病新品系1.稻瘟病概述水稻(是我国主要粮食作物，水稻年栽培面积三千万公顷以上，产量居于首位。
然而，水稻病害严重影响着水稻生产。
水稻病害种类很多，其中稻瘟病危害较为严重，是水稻“三大病害”之一[1]。
稻瘟病是由子囊菌引起的真菌性病害[2]。
稻瘟病菌以分生抱子和菌丝体形式越冬，当气温升到20℃左右时，就能不断的产生分生抱子，借风雨传播到稻株上，侵入寄主并向邻近细胞扩散，形成病斑。
病部形成的分生抱子经风雨传播进行再侵染。
稻瘟病在不同时期水稻不同部位均可发生。
根据危害部位不同可分为苗瘟、叶瘟、节瘟、穗颈瘟、谷粒瘟等，其中叶瘟和穗颈瘟危害最大[3一5]。
2.项目内容田间回交组配出空育131BL3的BC1代种子，并对其进行前景及背景选择。
（1）用水稻品种空育131做母本，含抗稻瘟病抗病基因的水稻品种福伊B作父本的杂交F1代的种子，种在田间得到F1代植株，用田间生长健壮，表型接近空育131的植株与空育131回交，即得回交一代BC1。
回交一代已经获得。
（2）前景选择：利用与抗瘟基因连锁紧密且与供体亲本和受体亲本间的多态性效果清楚的SSR标记进行前景选择（3）背景选择：选择在水稻12个连锁群上均匀分布的、在双亲间有多态性的SSR标记，共36个，进行背景选择（4）本研究利用分子标记辅助选择技术首次将抗稻病基因Pi2\Pi3转入水稻空育131中，结果将为寒区培育出优良的早粳稻抗稻瘟病新品种。
【国家自然科学基金】_长片段pcr_基金支持热词逐年推荐_【万方软件创新助手】_20140802
科研热词 鳜类 高胆固醇血症 长片段pcr 长片段dna 钙调素基因 重叠延伸pcr(soepcr) 轻病毒属 表型 菊科植物 稻瘟病抗性基因pi36 病毒装配 病毒粒子 病毒包膜蛋白质类 生长激素基因 甜菜碱醛脱氢酶基因 热启动pcr技术 核糖核酸酶类 序列差异 序列分析 巴西橡胶树 家族性 基因突变 基因整合 基因 全基因扫描 假基因 hbx抗原 dna序列 cre-loxp置换系统
2013年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
科研热词 长片段pcr 酵母双杂交 表达 融合pcr 荧光原位杂交 耐盐性 病毒感染 烟曲霉 根 染色体断裂点分子作图 智力低下 孤独症 大豆 基因回补 克隆 互作蛋白 rho1 prkrip1 pkr
推荐指数 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
2011年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
2011年 科研热词 长片段pcr技术 长片段dna 重组工程 重叠寡核苷酸 表达载体 肝炎病毒,乙型 纤维化 精确合成 稻瘟病 癌,肝细胞 打靶载red重组酶 page纯化 abo血型 5'非翻译区 推荐指数 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
2012年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
科研热词 推荐指数 基因克隆 3 杜梨 2 重叠pcr 1 表达特点 1 表达特征 1 胆碱单加氧酶 1 肠杆菌 1 磷酸乙醇胺n-甲基转移酶 1 整合子 1 小电导钙激活钾通道 1 基因工程 1 单壁碳纳米管 1 动物源 1 保真度 1 qnr基因 1 pcr 1 hpv16 1 e6/e7融合基因 1
广谱稻瘟病抗性基因Pigm和Pi2的抗谱差异及与Pi1的互作效应
Resistance Spectrum Difference between Two Broad-Spectrum Blast Resistance Genes, Pigm and Pi2, and Their Interaction Effect on Pi1
YU Miao-Miao1,2,3, DAI Zheng-Yuan1, PAN Cun-Hong1, CHEN Xi-Jun2, YU Ling1, ZHANG Xiao-Xiang1, LI Yu-Hong1, XIAO Ning1, GONG Hong-Bing3, SHENG Sheng-Lan3, PAN Xue-Biao2, ZHANG Hong-Xi1, and LI Ai-Hong1,*
URL: /kcms/detail/11.1809.S.20130812.1751.021.html
1928
作物学报
第 39 卷
Piz-t 等至少 10 个抗性基因, 这些基因在抗病基因簇 内呈等位或紧密连锁关系, 并有研究结果显示其抗 谱存在明显差异[1-7]。但这种差异大多是在不同遗传 背景下获得的初步鉴定结果, 缺乏在同一遗传背景 下(如近等基因系水平上)的验证。Pigm 是从持久抗 稻瘟病品种谷梅 4 号中鉴定的一个新的广谱稻瘟病 抗性基因, 定位及等位性测验结果显示其可能与第 6 染色体的 Pi2 和 Pi9 等位或连锁[8]。Pi1 是源自利 比亚粳型品种“LAC23”的广谱稻瘟病抗性基因, 定 位在第 11 染色体上 MGR4766 标记 1.3 cM 处, 现已 经被成功克隆[9-10], 并有研究显示其与 Pi2 有良好的 互补效应[11-13]。本研究构建了 4 个轮回亲本背景下 Pigm、Pi2 的系列近等基因系, 进而比较其抗谱差异, 并分析其与 Pi1 的互作效应, 从而为稻瘟病抗性育 种提供参考。
稻瘟病菌MGG-01005的表达纯化与生物信息学分析
浙江农业学报Acta Ag/cxltxTae Zhejiaxgensis,2021,33(3):470-478htt y：/// 赵秀平，王双，闫星伊，等c稻瘟病菌MGG甲1005的表达纯化与生物信息学分析[J]•浙江农业学报,2021,33(3)：470-478.DOI：10.3969/j.issn.1004-1524.2021.03.12稻瘟病菌MGGN1005的表达纯化与生物信息学分析赵秀平，王双，闫星伊，段强，张帅，陈永胜，李国瑞!(内蒙古民族大学生命科学与食品学院，内蒙古自治区高校1!麻产业工程技术研究中心，内蒙古自治区堇麻育种重点实验室，内蒙古自治区堇麻产业协同创新中丿LsM麻产业技术创新内蒙古自治区工程研究中心，内蒙古通辽028043)摘要:MGG-01005是与稻瘟病菌的菌丝生长有重要关系的基因，对其进行一般理化性质、结构域、功能位点预测等一系列生物信息学分析,构建了原核表达载体pETM13-MGG-01005,利用IPTG诱导重组蛋白表达，并通过镰离子亲和层析、阴离子交换层析以及分子筛层析进行蛋白纯化。
结果显示，该蛋白相对分子质量约为16471.49u,编码153个氨基酸，含Tctea-1结构域，无跨膜结构和信号肽，无功能位点，存在磷酸活性位点，为不稳定亲水蛋白;该蛋白可被0.1mmol-L-1诱导表达，亲和层析的最适洗脱液组分为20mmol-L-1Tris-HC1,500mmol-L-1NaCl,80mmol-L-1咪R;阴离子交换层析表明该蛋白对低盐条件具耐受性;分子筛层析具有形态均一且对称性良好的构象，最大洗脱峰出峰位置对应的蛋白相对分子质量约为35ku,表明该蛋白以二聚体形式存在。
本研究最终得到大量高纯蛋白，以期为进一步探索该蛋白的功能以及稻瘟病菌的后续相关研究奠定理论与实践基础+关键词:稻瘟病菌;原核表达;纯化;生物信息学分析中图分类号:S435.111.4+1文献标志码:A文章编号:1004-1524(2021)03甲470甲9Expression,puridcation and bioinformatics analysis of MagnaportUr oryzar MGG-01005ZHAO Xiuping,WANG Shuang,YAN Xingyi,DUAN Qiang,ZHANG Shuai,CHEN Yongsheng,LI Guorui*(College op Lfe Sciexcc aeb Foob Sciexcc,layer Moxgolia Unmersity fer Natioxalities,Ixoer Mongolia Ixbustrial Ex-gine g eg Research Center p Unmersitics for Castor,Ixoer Mongolia Key Laboratory p Castor Breeding,Ixoer Moego-lia Co l aeo atieeInnoeation Cente ao Casto Inbusty,Inne Mongolia Engin e ing Resea ch Cente oaInbustialtech-eology Ineovatiox p Castor,Toxgliao028043,China)Abstract:MGG-01005is an important gene associated with myceliv growth of Magxaporthe oryzac.In this study,a series of bioinformatics analysis including general physical and chemical properties,sWuctural domains,and functional site prediction were carried out to construct the prokaryotic expression vector PETM13-MGG-C1005.ITTG was used to induce the expression of recombinant protein,and the protein was purified by nickel ion Ofinity chromamyra-phy,anion exchange chromatography and molecular sieve chromatography.The results showed that the molecular weight of the protein was about16471.49u,which encoded153amino acits.It contained the domain of TctexD, had no transmembrane structure and signal peptide,had no functional site,and had the active site of phosphoric acit,and was an unstable hydrophilic protein.The protein coulU be induced to express by0.1mmol•L_1ITTG.The optimal eluent of affinity chromatography was divided into20mmol•L_1Tris-HCl,500mmol•L_1NaCl,and80收稿日期:2020甲6-19作者简介:赵秀平(1995—)，女，黑龙江齐齐哈尔人，硕士研究生，主要从事分子育种研究+E-mail：2247632876Eqq.cm*通信作者,李国瑞,E-mail:deyree1982@赵秀平，等.稻瘟病菌MGGQ1005的表达纯化与生物信息学分析・471・mmoe-L-1imidaeoee.Anion eichangecheomatogeaphyshowed thatthepeotein waseesistanttoeowsaetconditions. The molecular sieve chromatography has the conformation of uniform morpholoy and good symmetry,and the molecular weight of the protein corresponding to the maximum elution peak is about35ku,indicating that the protein existsin the form of dimer.In this study,a large amount of high purity protein was obtained in order to lay a theoretical and practical foundation for further exploration of the function of this protein and subsequent related studies on Mag-oapofhe oryzac.Key words:MagoapogCe oryzac；prokapotic expression；purification；bioinforma/cs analysis水稻是重要的粮食作物，在我国有超过60%的地区以稻米为主食u-2〕。
重叠PCR法构建嗜酸乳杆菌分选酶A基因外源打靶片段
重叠PCR法构建嗜酸乳杆菌分选酶A基因外源打靶片段何嘉怡;王文文;吴京;潘道东;吴振;曾小群【摘要】为比较单步法、分步法重叠PCR在构建嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus ATCC4356分选酶A(SrtA)外源打靶片段的差异性,设计了5对具有20~25 bp互补末端的引物,分别扩增两对上下游同源臂和卡那霉素基因,先采用分步法、单步法重叠PCR构建不含筛选基因的外源打靶片段SrtA-up2-SrtA-down2,比较两者优劣,随后取较优者构建含抗生素筛选基因的打靶片段SrtA-up1-Kan-SrtA-down1.结果显示单步法优于分步法,非特异性扩增少,拖尾现象少,且扩增打靶片段SrtA-up1-Kan-SrtA-down1条带单一,无非特异性扩增.即在构建两种外源打靶片段时,单步法重叠PCR优于分步法PCR,为之后构建嗜酸乳杆菌基因打靶载体、构建融合基因打下了基础.【期刊名称】《宁波大学学报（理工版）》【年(卷),期】2017(030)006【总页数】7页(P21-27)【关键词】嗜酸乳杆菌;外源打靶片段;单步法重叠PCR;分步法重叠PCR【作者】何嘉怡;王文文;吴京;潘道东;吴振;曾小群【作者单位】宁波大学浙江省动物蛋白食品精深加工技术重点实验室, 浙江宁波315211;宁波大学浙江省动物蛋白食品精深加工技术重点实验室, 浙江宁波315211;宁波大学浙江省动物蛋白食品精深加工技术重点实验室, 浙江宁波315211;宁波大学浙江省动物蛋白食品精深加工技术重点实验室, 浙江宁波315211;南京师范大学食品科学与营养系, 江苏南京 210097;宁波大学浙江省动物蛋白食品精深加工技术重点实验室, 浙江宁波 315211;宁波大学浙江省动物蛋白食品精深加工技术重点实验室, 浙江宁波 315211【正文语种】中文【中图分类】Q784嗜酸乳杆菌是一种兼性厌氧, 耐酸性强, 对人和动物肠道有益生功能的微生物菌群[1], 因其具有较好的保健功能: 缓解呼吸道感染、婴幼儿乳糖不耐受等症状[2-3]而被广泛应用于乳品、保健品等行业中. Meng等[4]研究证明Lactobacillus acidophilus NCFM表面蛋白能降低HT-29的由E. coli ATCC 43893和S. typhimurium CMCC 50013所引发的凋亡率; Othman等[5]研究发现酸奶发酵期间添加嗜酸乳杆菌能够有效抵抗金黄色葡萄球菌的繁殖. 分选酶 A被普遍认为是管家分选酶, 广泛存在于革兰氏阳性菌如芽孢杆菌、肠球菌、乳杆菌等[6-7]中,其可以识别含LPXTG基序的分选酶相关黏附蛋白(SDPs)并将其锚定在细胞壁上[8], 因而与菌体的黏附性能[9]有关. 为进一步研究分选酶 A, 研究者普遍采用基因敲除对分选酶A的功能做进一步探索.Remus等[10]研究发现植物乳杆菌WCFS1分选酶A缺失株与野生株相比, 丧失了分选酶活力, 无法对SDPS蛋白定位而降低了细菌的黏附性; Call 等[11]也表明 SrtA的缺失降低了嗜酸乳杆菌的体外黏附性能.基因敲除技术指利用特定方法使目标基因缺失或失活, 对染色体进行定点修饰改造, 从而改变细胞遗传特性的生物手段[12]. 乳酸菌基因敲除多采用构建环状载体进行单双交换基因敲除[12-13],包括温敏敲除系统[14]、自杀载体敲除系统[15]等. 构建外源打靶片段时, 既可设置抗生素抗性基因如kanamycin[16]、spectinomycin[17]、chloromycetin[18]为筛选标记, Feraint等[15]融合 D-乳酸脱氢酶基因的上下游同源臂与氯霉素抗性基因, 转入 PJDC9质粒中, 进行单双交换筛选, 成功构建了 ldhD 缺失菌; 也可只含目的基因上下游同源臂[19], Okano等[13]人连接植物乳杆菌 ldh的上下游同源臂至pGHOST+9中, 成功构建了敲除载体pGh9-ldh . 在一定长度范围内, 同源重组效率与上下游同源臂长度成正比[14]. 重叠延伸PCR技术(Splicing by Overlap Extension PCR, SOE-PCR)可不需要内切酶消化和连接酶处理, 简单快速地拼接多个异源 DNA片段[20-21], 其原理是根据目的基因设计具有互补末端的引物,先独立合成具有重叠序列的待融合片段, 随后以片段间的重叠部分互为模板, 互相搭桥, 形成重叠链, 通过重叠链的延伸将扩增片段拼接起来[22-24].Shevchuk等[25]结合重叠PCR技术与长片段PCR技术, 成功构建了3～20kb的DNA分子. 王宝利等[26]通过此技术成功拼接了OPG基因外显子2和外显子3. 重叠PCR技术构建融合基因可避免加入连接序列而出现不必要的碱基序列, 正确率较高[21,27],因而广泛用于构建基因敲除打靶片段[28-29]. 目前对分步法重叠 PCR研究较多, 有采用分步法重叠PCR构建外源打靶片段[28,30], 构建多位点突变[31],优化分步法重叠 PCR反应条件[32], 但鲜有文章比较单步法与分步法重叠PCR的差异性[33-34].实验以嗜酸乳杆菌 Lactobacillus acidophilus ATCC4356分选酶A基因(SrtA)为例, 设置5对具有20～25bp互补重叠的引物, 先采用单步法、分步法重叠 PCR构建不含抗性筛选基因打靶片段SrtA-up2-SrtA-down2并比较两者优劣, 之后, 取较优者用于构建含抗性筛选基因的打靶片段, 为后续构建嗜酸乳杆菌打靶载体、多个DNA片段的融合打下了理论基础.嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus ATCC4356,本实验室保存; PrimeSTAR HS DNA Polymerase、大肠杆菌DH5ɑ、pMD18-T载体用于融合片段的亚克隆及测序分析, 购于大连TAKARA宝生物公司;DNA标准分子质量(2kb DNA ladder, 5 kb DNA ladder, 1.5kb DNA ladder); DNA凝胶回收试剂盒、pEASY-blunt Zero质粒购于北京全式金生物技术有限公司; X-gal(20 mg·mL-1)、氨青霉素购于北京索莱宝有限公司.Multigene Thermal Cycler型PCR仪, 美国莱伯特(Labnet)公司; Universal Hood型凝胶成像系统,Bio-Rad公司.设计并合成 3对引物见表 1(下划线部分为引物之间的碱基重叠序列). 以纯化后的Lactobacillus acidophilus ATCC 4356基因组DNA为模板, 用常规PCR法扩增两对不同长度的SrtA基因上下游同源臂(SrtA-up1与 SrtA-down1, SrtA-up2与SrtA-down2), 反应条件为: 94℃预变性5min; 98℃10s、55℃ 15s、72℃ 1min, 30个循坏; 72℃延伸10 min. 以质粒pEASY-blunt Zero为模板, 采用常规PCR程序扩增卡那霉素基因(Kan), 反应条件:94℃预变性5min; 98℃ 10s、55℃ 15s、72℃2 min, 30个循坏; 72℃延伸 10min. 扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测, 纯化回收后作为后续重叠PCR的模板.测定纯化后的上下游同源臂 SrtA-up2、SrtA-down2的浓度, 在50μL体系中加入等摩尔比例的待融合片段, PCR反应体系: 5×PrimeSTAR Buffer(Mg2+ Plus)10μL, dNTP Mixture(2.5 mM)4μL, 引物SrtA-up2 F和SrtA-down2 R各1μL,纯化后的SrtA-up2、SrtA-down2片段各2μL, Primer STAR HS DNA Polymerase 0.5μL, ddh2O 29.5μL.PCR反应条件: 94℃预变性5min; 98℃ 10s、55℃ 15s、72℃ 2min, 30个循坏; 72℃延伸10 min,扩增产物经1%琼脂糖电泳检测.测定纯化后上下游同源臂 SrtA-up2、SrtA-down2的浓度, 在 PCR体系中加入等摩尔比例的待融合片段, 第一轮 PCR反应体系: 5×PrimeSTAR Buffer (Mg2+ Plus) 10μL, dNTP Mixture(2.5 mM) 4μL, Primer STAR HS DNA Polymerase 0.5μL, SrtA-up2、SrtA-down2 各1μL, ddh2O 补足至40μL. 第一轮反应条件: 94℃预变性5min; 94℃ 30s、50℃ 1min、72℃ 2 min, 共 10个循坏;72℃延伸5min; 第二轮PCR: 取出第一轮反应液,补充dNTP Mixture (2.5 mM) 2μL, Primer STAR HS DNA Polymerase 0.5μL, 引物 SrtA-up2 F 和SrtA-down2 R各1μL, ddh2O补足至50μL. 反应条件: 94℃预变性5min; 94℃ 30s、56℃ 30s、72℃ 2 min, 30个循坏; 72℃延伸10 min. 比较单步法、分步法重叠PCR 的电泳检测结果, 取较优者,割胶纯化后连接 pMD18-T载体, 转入大肠杆菌DH5ɑ, 挑取单菌落, 送检测序.向50μL体系中加入等摩尔比例纯化后的待融合片段(SrtA-down1约15ng·μL-1, Kan约14.5 ng·μL-1), PCR 反应体系为: 5×PrimeSTAR Buffer(Mg2+ Plus)10μL, dNTP Mixture (2.5 mM) 4μL, 引物Kan F和SrtA-down1 R各1μL, SrtA-down1 1μL,Kan 2μL, 灭菌水31μL. PCR反应条件: 94℃预变性5 min; 98℃ 10s、55℃ 10s、72℃ 2 m in, 30个循坏; 72℃延伸 10 min, 扩增产物经 1%琼脂糖电泳检测, 割胶回收目的条带, 得到融合片段SrtA-down1-Kan(约12ng·μL-1), 采用上述 PCR 体系, 只将引物改为SrtA-up1 F, SrtA-down1 R, 模板改为 SrtA-down1-Kan 1.5μL(约12ng·μL-1), SrtA-up1(约10ng·μL-1) 0.5μL, PCR反应条件: 94℃预变性5 min; 98℃ 10s、60℃ 15s、72℃ 3 min, 30个循坏; 72℃延伸 10 min. 扩增片段经 1%琼脂糖电泳检测.以嗜酸乳杆菌 ATCC4356为模板扩增得到的上下同源臂片段: SrtA-up1(552bp)和 SrtA-down2(592bp)(图 1(a)), SrtA-up2(720bp)和 SrtA-down2(720bp)(图1(c)), 从质粒pEASY-blunt Zero扩增出的Kan片段(1224bp)(图1(b)), 在理论大小的位置,均可以见到单一、明亮的条带.单步法、分步法重叠 PCR终产物, 各取5μL凝胶电泳检测, 均能在理论位置得到目的条带(图2), 约 1400bp. 然而, 分步法重叠 PCR(图 2(b))非特异性条带较多, 拖尾现象较严重; 相对而言, 单步法重叠PCR(图2(a))因模板延伸与基因的扩增同时进行, 导致拖尾现象较少, 具有较高的特异性.测定两者纯化后的终产物浓度, 分步法重叠PCR产物浓度略高于单步法重叠PCR. 综合而言, 单步法重叠PCR优于分步法PCR. 将单步法重叠PCR终产物割胶纯化后与 pMD18-T载体连接, 转化大肠杆菌DH5ɑ, 随机挑取 6个单菌落培养, 并菌落PCR验证, 将PCR验证正确的单菌落送检测序, 并用NCBI进行比对, 结果表明DNA序列正确.鉴于步骤2.2的结果, 采用单步法重叠PCR构建含筛选基因的打靶片段SrtA-up1-Kan-SrtA-down1.实验采用两两融合方式, 先将下游同源臂与卡那霉素基因等摩尔比例反应后取5μL凝胶电泳检测,在2000bp附近有目的条带Kan-SrtA-down1(1800 bp左右), 但同时也存在一些非特异性条带、较严重的拖尾现象. 割胶纯化目的条带, 与纯化后的SrtA-up1片段等摩尔比例混合, 得到最终的融合片段(图 3)SrtA-up1-Kan-SrtA-down1(大约 2400bp),条带单一, 大小正确, 但拖尾现象严重且浓度较低.重叠 PCR可以简单快速地将异源, 独立的多个基因片段进行连接[35], 步骤简单, Davidson、Kuwayama等[36-37]均用此方法成功融合约 4kb的DNA长片段, 因而多用于构建突变基因、基因敲除等分子领域[27]. 之前构建基因敲除外源打靶片段多通过酶连法连接各个独立片段, 费事费力[38],Zhang等[39]也认为采用重叠PCR技术简化了链球菌等位基因置换突变株的构建步骤, 同时避免了重复序列的干扰, 省时省力. 传统重叠PCR为分步法重叠 PCR, 之前有较多研究采用分步法重叠PCR构建融合基因, 定点突变, 但也有学者表明采用单步法重叠 PCR构建融合基因(DNA长度可达1kb), 相对于传统重叠PCR操作更方便, 碱基错配率低[34].本研究首先比较了分步法与单步法重叠 PCR在构建嗜酸乳杆菌分选酶 A基因外源打靶片段SrtA-up2-SrtA-down2的优劣性, 结果表明单步法重叠PCR产物虽浓度略低于分步法PCR产物[33], 但特异性高[32,35], 而且外源打靶片段 SrtA-up1-Kan-SrtA-down1的扩增单一性更加肯定了单步法重叠PCR更适合多个DNA片段间的融合反应. 单步法重叠PCR拼接融合片段, 模板用量, 退火温度、引物设计、聚合酶的选择等都是影响扩增效率的关键因素. 重叠PCR的引物与普通PCR不同之处即为相邻的两对引物之间有碱基重叠区域, 研究表明互补序列长度在15～25bp之间, 扩增效果较好, 大于30bp时容易出现弥散现象[33], 且接头区尽量避免A、T以免增加错配率, 另外引物的退火温度Tm均取接近独立片段的退火温度[21,40], 以便融合步骤的顺利进行. 重叠PCR虽以PCR为基础, 但其为多重扩增, 易发生碱基错配, 因此一般选择高保真聚合酶而不选用Taq酶[41], 而且Taq酶在其PCR产物的3’端添加了一个突出的“A”易造成移码,本实验选用的是Primerstar HS polymerases, 此外还有Pfu polymerases[42], KOD HiFi polymerases.Nicholas Harrison等人表明模板浓度对重叠PCR扩增结果的影响较小[43], 但融合片段时, 传统方法为取模板间的摩尔比例为 1:1[44], 所以在本研究中,无论是单步法还是分步法, 融合反应体系中模板浓度均以等摩尔比例混合. 除此之外, 有文献表明引物的浓度也是影响扩增结果的因素, Davidson等人研究表明为获得浓度较高的融合片段, 引物的浓度应至少高于模板浓度的10倍[34].实验同时采用单步法、分步法重叠PCR, 构建不含抗性筛选基因的打靶片段 SrtA-up2-SrtA-down2,并对这两种重叠 PCR法进行比较分析. 结果表明, 单步重叠PCR 扩增非特异性条带少, 拖尾现象少, 优于分步法PCR, 但分步延伸PCR扩增产物浓度略高于单步延伸PCR. 综合以上结果, 采取单步法重叠PCR构建含筛选基因的打靶片段SrtA-up1-Kan-SrtA-down2, 电泳显示条带单一, 大小正确且无杂带(图3b), 因此实验表明融合多个片段,宜采取单步法重叠 PCR, 为构建乳酸菌敲除载体和多个DNA片段的融合奠定了基础.*通信作者: 吴振（1985－）, 男, 河南新乡人, 讲师, 主要研究方向: 乳品科学. E-mail:***************【相关文献】[1]邢海楠, 姜颖越, 李艳茹, 等. 不同低聚糖对嗜酸乳杆菌增殖的影响研究[J]. 延边大学农学学报, 2014, 36(2):155-159.[2]LEYER G J, LI S, MUBASHER M E, et al. Probiotic effects on cold and influenza-like symptom incidence and duration in children[J]. Pediatrics, 2009, 124(2):e172-e179.[3]LALIČIĆ-PETRONI JEVIĆ J, POPOV-RALJIĆ J,OBRADOVIĆ D, et al. Viability of probiotic strains Lactobacillus acidophilus NCFM® and Bifidobacterium lactis HN019 and their impact on sensory and rheological properties of milk and dark chocolates during storage for 180 days[J]. Journal of Functional Foods, 2015, 15:541-550.[4]MENG J, ZHANG Q X, LU R R. Surface layer protein from Lactobacillus acidophilus NCFM inhibit intestinal pathogen-induced apoptosis in HT-29 cells[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2017, 96:766-774.[5]OTHMAN H E, ABDELSAMEI H M, ABDOU A M, et al. Evaluation the effect of Lactobacillus acidophilus probiotic culture over Staphylococcus aureus during the production and storage of acidophilus yoghurt[J]. Benha Veterinary Medical Journal, 2017, 32(1):127-131.[6]朱芳. 金黄色葡萄球菌分选酶 A基因的原核表达、纯化及活性测定[D]. 广州: 华南理工大学, 2011.[7]姜利滨, 文莹, 陈芝. 分选酶的研究进展及其在生物技术中的应用[J]. 生物技术进展, 2011,1(3):184-188.[8]CALL E K, KLAENHAMMER T R. Relevance and application of sortase and sortase-dependent proteins in lactic acid bacteria[J]. Frontiers in Microbiology, 2013,4(3):73. [9]王刚, 吴振, 彭刘杨, 等. 不同 pH 对嗜酸乳杆菌分选酶相关基因表达及菌体黏附能力的影响[J]. 食品工业科技, 2016(21):166-171.[10]REMUS D M, BONGERS R S, MEIJERINK M, et al.Impact of Lactobacillus plantarum sortase on target protein sorting, gastrointestinal persistence, and host immune response modulation[J]. Journal of Bacteriology,2013, 195(3):502-509.[11]CALL E K, GOH Y J, SELLE K, et al. Sortase-deficient lactobacilli: Effect on immunomodulation and gut retention[J]. Microbiology, 2015, 161(2):311-321.[12]杜胜阳, 王斌斌, 冯佳, 等. 乳酸菌基因敲除技术的研究进展[J]. 食品与发酵工业, 2016,42(1):244-251.[13]OKANO K, ZHANG Q, SHINKAWA S, et al. Efficient production of optically pure D-lactic acid from raw corn starch by using a genetically modified L-lactate dehydrogenase gene-deficient and alpha-amylase-secreting Lactobacillus plantarum strain[J]. Applied & Environmental Microbiology, 2008, 75(2):462-467.[14]BISWAS I, GRUSS A, EHRLICH S D, et al. Highefficiency gene inactivation and replacement system for gram-positive bacteria[J]. Journal of Bacteriology,1993,175(11):3628-3635.[15]FERAIN T, JR J N H, RICHARDSON J, et al. Knockout of the two ldh genes has a major impact on peptidoglycan precursor synthesis in Lactobacillus plantarum[J]. Journal ofBacteriology, 1996, 178(18):5431-5437.[16]LIU G, TIAN Y, YANG H, et al. A pathway-specific transcriptional regulatory gene for nikkomycin biosynthesis in Streptomyces ansochromogenes that also influences colony development[J]. Molecular Microbiology, 2005,55(6):1855-1866.[17]ARNAU D M, CHASTANET A, DÉBARBOUILLÉ M.New vector for efficient allelic replacement in naturally nontransformable, low-GC-content, gram-positive bacteria[J]. Applied & Environmental Microbiology, 2004, 70(11):6887-6891.[18]MALLERET C, LAURET R, EHRLICH S D, et al.Disruption of the sole IdhL gene in Lactobacillus sakei prevents the production of both L- and D-Iactate[J].Microbiology, 1998, 144(12):3327-3333.[19]白向阳, 吕安国, 吴文芳, 等. 用改进的重叠PCR引入血管内皮生长因子基因突变[J]. 生物化学与生物物理进展, 2004, 31(2):181-184.[20]WARRENS A N, JONES M D, LECHLER R I. Splicing by overlap extension by PCR using asymmetric amplification: An improved technique for the generation of hybrid proteins of immunological interest[J]. Gene, 1997,186(1):29-35.[21]魏薇, 李凡, 陈海如. 利用重叠延伸 PCR 技术扩增长片段 DNA[J]. 云南大学学报(自然科学版), 2008,30(S1):86-88; 93.[22]HO S N, HUNT H D, HORTON R M, et al. Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction[J]. Gene, 1989, 77(1):51-59.[23]李守宇. 重叠延伸PCR技术及其在生物学中的应用[J].生物学教学, 2013, 38(4):65-66.[24]JONES M L, BARNARD R T. Chimerization of multiple antibody classes using splice overlap extension PCR[J].Biotechniques, 2005, 38(2):181-182.[25]SHEVCHUK N A, BRYKSIN A V, NUSINOVICH Y A,et al. Construction of long DNA molecules using long PCR-based fusion of several fragments simultaneously[J].Nucleic Acids Research, 2004, 32(2):e19.[26]王宝利, 梁晖, 戴芳, 等. 重叠延伸PCR法在合成人骨保护素N端编码序列中的应用[J]. 天津医科大学学报,2004, 10(3):343-345.[27]徐芳, 姚泉洪, 熊爱生, 等. 重叠延伸PCR技术及其在基因工程上的应用[J]. 分子植物育种, 2006, 4(5):747-750.[28]张念章, 储岳峰, 赵萍, 等. 重叠PCR法构建副猪嗜血杆菌外源打靶基因[J]. 生物技术通报, 2011(7):186-190.[29]李爽. D-乳酸产生菌株的基因敲除[D]. 天津: 天津大学, 2010.[30]赵莹, 张丽仪, 刘昌政, 等. 植物偏爱密码子优化HPV18L1全长基因的重叠PCR合成[J]. 南方医科大学学报, 2009, 29(3):387-392.[31]AN Y, JI J, WU W, et al. A rapid and efficient method for multiple-site mutagenesis with a modified overlap extension PCR[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2005, 68(6):774-778.[32]孟祥平, 杨建英, 乔晓岚, 等. 优化重叠延伸PCR条件构建 BTRCP-CypA融合基因[J]. 生物技术, 2013(6):51-54.[33]张丽丽, 李振军, 李景富, 等. 融合基因构建方法的建立[J]. 东北农业大学学报, 2012, 43(1):155-160.[34]WU G, WOLF J B, IBRAHIM A F, et al. Simplified gene synthesis: A one-step approach to PCR-based gene construction[J]. Journal of Biotechnology, 2006, 124(3):496-503. [35]黄卓. 重叠延伸 PCR(SOE PCR)技术在洛伐他汀九酮合成酶基因克隆中的应用[D]. 海口: 海南大学, 2010.[36]DAVIDSON R C, BLANKENSHIP J R, KRAUS P R, et al. A PCR-based strategy to generate integrative targeting alleles with large regions of homology[J]. Microbiology,2002, 148(8):2607-2615.[37]KUWAYAMA H, OBARA S, MORIO T, et al. PCR-mediated generation of a gene disruption construct without the use of DNA ligase and plasmid vectors[J].Nucleic Acids Research, 2002, 30(2):e2.[38]李娅妮, 赵国芬, 包秋华, 等. 植物乳杆菌lai基因同源重组敲除载体的构建与鉴定[J]. 农产品加工(学刊),2014(6):51-53; 59.[39]ZHANG S, ZOU Z, KRETH J, et al. Recombineering in streptococcus mutans using direct repeat-mediated cloning-independent markerless mutagenesis (DR-CIMM)[J]. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology,2017, 7:202.[40]李敏, 杨谦. 一种高效构建同源重组DNA片段的方法—–融合 PCR[J]. 中国生物工程杂志, 2007, 27(8):53-58.[41]TINDALL K R, KUNKEL T A. Fidelity of DNA synthesis by the Thermus aquaticus DNA polymerase[J].Biochemistry, 1988, 27(16):6008-6013.[42]TAKAGI M, NISHIOKA M, KAKIHARA H, et al.Characterization of DNA polymerase from Pyrococcus sp.strain KOD1 and its application to PCR[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1997, 63(11):4504-4510.[43]DATSENKO K A, WANNER B L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2000,97(12):6640-6645.[44]WITHERS-MARTINEZ C, CARPENTER E P,HACKETT F, et al. PCR-based gene synthesis as an efficient approach for expression of the A+ T-rich malaria genome[J]. Protein Engineering, 1999, 12(12):1113-1120.。
病原真菌中MAPK信号通路的研究进展
病原真菌中MAPK信号通路的研究进展刘帅;陈晨【摘要】信号通路对于细胞生理指标变化具有调控功能,不同的信号通路对于细胞行为的影响是不同的.综述了MAPK信号通路在形态建成、细胞生长、胞壁合成以及应答压力等方面的重要作用,并从HOG途径、Mkc1途径、Cek1和Cek2途径,以及Fus3/Kss1-MAPK信号通路和Slt2-MAPK级联通路等方面阐述了MAPK信号通路的研究进展.%Signal pathways have regulatory functions for changes of cell physiological indexes, and the effects of different signaling pathways on cell behavior are different. The important roles of MAPK signaling pathway in morphogenesis, cell growth, and cell wall synthesis and response pressure were reviewed. Advances in MAPK Signaling Pathway in Pathogenic Fungi were summarized from HOG pathway, Mkc1 pathway, Cek1 and Cek2 pathway, and Fus3/Kss1-MAPK signaling pathway and Slt2-MAPK China Unicom and other aspects.【期刊名称】《湖南农业科学》【年(卷),期】2017(000)011【总页数】4页(P119-122)【关键词】病原真菌;MAPK信号通路;细胞行为;研究进展【作者】刘帅;陈晨【作者单位】兰州交通大学化学与生物工程学院,甘肃兰州 730070;兰州交通大学化学与生物工程学院,甘肃兰州 730070【正文语种】中文【中图分类】Q936信号通路是指能将胞外的信号经细胞膜传入胞内的一系列酶促反应通路。
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SOE―PCR在稻瘟病菌基因敲除中的应用
摘要：稻瘟病是水稻重要病害之一，可引起大幅度减产。
稻瘟病菌具有许多植物病原真菌侵染循环的重要特点，其侵染过程、致病机理和其中伴随的基因行为在致病真菌中具有典型性。
本文综述了SOE-PCR技术的原理及其在稻瘟病菌基因敲除方面的应用情况，并指出此技术中要注意的问题，展望了其在稻瘟病研究中的应用前景。
关键词：重叠延伸PCR，稻瘟病菌，基因敲除技术
1.SOE-PCR技术的原理
重叠延伸PCR技术（gene splicing by overlap extension PCR，简称SOE PCR）[1，2]，是一种采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成重叠链，在接下来的反应中通过重叠链的延伸，将来源不同的扩增片段重叠连接起来且不需要内切酶消化和连接酶处理的技术，该技术在敲除基因片段上具有很大的优势。
2.SOE-PCR技术在稻瘟病菌研究中的应用
从稻瘟病菌数据库中选取想要敲除掉的致病基因，并获得该基因的上、下游基因序列。
以一段带有潮霉素标记的基因序列来代替欲敲除基因。
SOE-PCR 是将不同来源的两个基因或DNA 片段拼接起来构成融合基因的方法。
两段基因的
引物其中有两条是常规的引物，两外两条引物是特殊设计的，其序列上一端与自身的目的片段互补，另外一端却是另外一段目的基因的序列。
这样经过各自的PCR克隆后，在各自的产物其中的一端加上特别的接头。
然后把PCR 产物处理后，利用接头的特异互补进行PCR 扩增，从而将两段PCR 产物
连接到了一起，形成了不靠限制性内切酶连接的杂交基因片段。
在重叠延伸PCR中，两个重叠的DNA片段是分别从两个独立的PCR扩增反应得到的，预设突变构建在重叠区域中。
整个过程需要4对引物，用引物AF和AR，通过PCR的方法从稻瘟病菌基因组DNA扩增待敲除基因的上游A片段，接着用引物BF和BR再从稻瘟病菌基因组DNA中扩增待敲除基因的下游B片段，再用引物HYG/F和HY/R扩增出潮霉素磷酸
转移酶序列内部的正向引物HPH1，用引物YG/F和HYG/R扩增出潮霉素磷酸转移酶序列内部的反向引物Hph2。
再通过SOE-PCR的方法搭桥连接待敲除基因的上游A片段和Hph1、待敲除基因的下游B片段和Hph2，获得该基因的AH和HB
片段。
取上述PCR产物AH、HB片段各5μg，利用PEG介导的方法导入稻瘟菌的原生质体中。
原生质体复苏后，在含有300 μgmL-1潮霉素的选择培养基上进行生长。
5～7天后，在平板上挑取具有潮霉素抗性的转化子。
将所挑取的转化子在固体酵母培养基中培养含3～5 天，收集菌丝，提取基因
组DNA，进行PCR验证是否为敲除突变体。
3.SOE-PCR的优点及缺点
3.1优点：①操作步骤简洁，耗时短，可行性高；②不需要设计特定的酶切识别位点，将DNA片段拼接到一起；③可以进行高保真的定点、定位突变；④可以利用PCR将不同来源的DNA片段连接起来。
一些基因来源的材料比较难得，很难将这些基因模板提取出来，并且提取出来的模板特异性不强。
此时，利用重叠延伸PCR 技术，可以不需要从原始材料中获取目的基因，而是从其他含有目的片段模板中扩增，并实现突变、连接等。
3.2缺点：①容易产生随机突变，需要优化PCR过程；
②对引物设计的要求很高。
4.展望
利用抗病品种是防治稻瘟病最经济有效的方法之一，然而，水稻品种在生产上大面积推广3～5年后，抗性下降或丧失。
研究者们利用对基因的加工和修饰来达到自己的研究目的，而前提是要获得目的基因。
在实际操作中，某些目的基因的获得存在一定的困难，然而SOE-PCR技术不需要通过内切酶消化和连接酶处理即可获得，对于一些基因来源材料比较难得的基因，很难将这些基因模板提取出来，并且提取出来的模板特异性不强。
可以不需要从原始材料中获取目的基因，而是从其他含有目的片段模板中扩增。
使研究人员在基因操作上节省了大量时间。
参考文献：
[1]赵卫、胡志君、秦鄂德等。
登革2型病毒全长cDNA 克隆定点诱变的OL-PCR 方法[J].中华微生物与免疫学杂志，2001，21（6）：662-665
[2]JonesML，BarnardRT.Chimerazation of multiple antibody classes using splice overlap extension PCR[J].Biotechniques，2005，38（2）：181-182.
[3] 钟志成，黎诚耀，朱利，张玲，万成松，马丹娟，杨瑜，熊建英，一种可用于多DNA 片段连接的新SOE-PCR 方法[J].热带医学杂志，2010，10（3）：253-257
[4] 桑春果，张开春，张军科. 重叠区扩增法合成抗菌肽
B 基因. 西北农林科技大学学报（自然科学版），2002，30（1）：66-67
作者简介：衣雨娇（1993～），女，汉，福建农林大学，植物保护学院大三学生。
（福建农林大学植物保护学院，福建福州350000）。