稻瘟病菌T-DNA插入方法优化及其突变体分析
水稻WRKY转录因子家族研究进展
水稻WRKY转录因子家族研究进展刘梦佳;李海峰【摘要】综述了水稻WRKY转录因子响应逆境胁迫、调控发育和代谢等方面的生物学功能，介绍了水稻WRKY基因表达模式和作用机制研究的新进展，并在功能解析方面做了展望。
%In this paper, we reviewed the functions of rice WRKY transcription factors on response to stress,regulation in developmental and metabolic process. Furthermore, progresses in expression pattern and molecular mechanism were introduced,and a short prospect in function analysis was made.【期刊名称】《河南农业科学》【年(卷),期】2016(045)003【总页数】8页(P1-8)【关键词】水稻;WRKY转录因子;生物胁迫;非生物胁迫;胁迫应答【作者】刘梦佳;李海峰【作者单位】西北农林科技大学农学院/旱区作物逆境生物学国家重点实验室，陕西杨凌712100;西北农林科技大学农学院/旱区作物逆境生物学国家重点实验室，陕西杨凌712100; 新疆农业职业技术学院，新疆昌吉831100【正文语种】中文【中图分类】S685水稻(Oryza sativa)WRKY转录因子作为植物转录因子家族的一个重要成员，通过保守的WRKY结构域特异性结合到启动子区域的W-box，直接或间接调控抗病、干旱、冷热、高盐、氧化损伤、衰老等相关基因的表达，参与水稻的生物、非生物胁迫反应、激素信号转导途经、发育和代谢过程。
近年来，水稻WRKY基因功能研究特别是在抵抗逆境方面的研究取得了很大进展。
基于此，综述了水稻WRKY转录因子响应逆境胁迫、调控发育和代谢等方面的生物学功能，介绍了水稻WRKY基因表达模式和作用机制研究的进展，并在功能解析方面做了展望。
T-DNA插入鉴定实验报告
T-DNA插入突变体的鉴定时明辉同组者：薛敏学号：201000220069摘要 Ti质粒是上有一段特殊的DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移进植物细胞，并插入植物染色体DNA中。
所以Ti质粒上的这一段能转移的DNA被叫做T-DNA。
将感兴趣的基因改造插入到T-DNA区段中，通过农杆菌侵染植物细胞，实现外源基因对植物的遗传转化，得到含有突变的植株。
通过本实验，我们将学习如何用PCR的方法检测所得植株是否为T-DNA的插入突变体。
1.引言T-DNA作为一种实验常用的遗传转化方法，在插入突变过程中，插入到植物染色体上的位置是随机的。
如果T-DNA插入进某个功能基因的内部，特别是插入到外显子区，将造成基因功能的丧失。
所以利用农杆菌Ti质粒转化植物细胞，是获得植物突变体的一种重要方法。
农杆菌Ti质粒转化植物细胞后，在获得的后代分离群体中，有T-DNA 插入的纯合突变体，杂合突变体，和野生型。
在突变体研究中，需要的材料是纯合突变体，所以必须从分离群体中将纯合突变体鉴定出来。
本次实验中，采用液CTAB（或者TSP法）提取拟南芥植株的DNA，然后PCR将所获DNA扩增，在之后采用琼脂糖凝胶电泳技术，分离处长度不一的DNA带，以确定样品是否为T-DNA插入突变纯和体。
PCR（Polymerase ChainReaction），即聚合酶链式反应是体外核算扩增技术，具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断。
（PCR基本原理如右图）DNA含有PO43-基团，在pH8.0 Buffer（本实验中为TAE）中带负电, 在电场中向正极移动。
自由电泳时，由于不同大小的DNA片段的电荷密度大致相同，各核酸分子难以分开；选用适当浓度的琼脂糖凝胶作为支持物，使之具备一定的孔径，即可发挥分子筛效应，使大小不同的核酸片段迁移率出现较大差异，达到分离的目的；同样条件对Marker电泳；起到鉴定的作用。
拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定
拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定09生工吴超 200900140129一、实验原理T-DNA插入法是反向遗传学研究的重要手段。
T-DNA是农杆菌的一个大质粒，长度在25kb左右。
野生型农杆菌的T-DNA上带有激素合成基因，感染植物后会导致植物细胞快速增殖形成愈伤组织，失去分化能力。
所以一般实验使用改造后的农杆菌——T-DNA中导入了卡那霉素抗性基因和抗除草剂基因。
因此在农杆菌感染植物后可用除草剂来筛选转化子。
在转化子培养到F2代出现分离后，就需要对其基因型进行鉴定。
T-DNA插入突变体鉴定方法主要有两种：三引物法和双引物法。
在本实验中使用三引物法。
三引物法的原理如图1所示，即采用三引物（LP、RP、BP）进行PCR扩增。
野生型植株目的基因的两条染色体上均未发生T-DNA插入，所以其PCR产物仅有1种，分子量约900bp（即从LP到RP）；纯合突变体植株目的基因的两条染色体上均发生T-DNA插入，T-DNA本身的长度约为25kb，过长的模板会阻止目的基因特异性扩增产物的形成，所以也只能得到1种以BP与LP或RP为引物进行扩增的产物，分子量约为400-700bp；杂合突变体植株只在目的基因的一条染色体上发发生了T-DNA插入，所以PCR扩增后可同时得到两种产物。
上述3种情况的电泳结果差异明显，能有效区分不同基因型的植株。
此法优点是可同时鉴定出纯和突变体并确证T-DNA的插入情况。
图1 T-DNA插入示意图CATB，即十六烷基三甲基溴化铵，是一种离子型表面活性剂。
能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。
并且CATB可在高离子强度的溶液里与蛋白质和大多数多聚糖形成复合物进而形成沉淀，但不沉淀核酸。
本实验使用CATB抽提DNA。
聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是体外核酸扩增技术。
它具有特异性高、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至几万倍，使肉眼能直接观察和判断。
模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的PCR鉴定资料讲解
▪ 第一管：
▪
10xTaq buffer
min，再转移上清入新管。 5. 向上清液中加等体积的冷异丙醇，小心混匀。-20 ℃ 放置30 min，12000 rpm离心10 min，
弃上清。 6. 用70%乙醇洗涤沉淀一次，12000 rpm稍离心，弃上清。 7. 将沉淀在超净工作台上吹干，或空气中晾干。加50 μl TE (pH 8.0)放4 ℃缓慢溶解。 8. 电泳检测DNA的浓度和质量。
▪
81.8 g NaCl
▪
0.2%(V/V)β-巯基乙醇
▪注：先将除巯基乙醇之外的药品配好，高压蒸汽灭菌后加入巯基乙醇
▪酚/氯仿/异戊醇： 25：24：1
▪氯仿/异戊醇： 24：1
▪TE缓冲液：Tris-HCl (pH 8.0) 10 mmol/L，EDTA 1 mmol/L
▪3 M NaAc（pH 5.2）
左引物 LP： TCATCCACCATGGAAGAAAAG 右引物 RP：
TTGGATACGATGCGAGTAACC 中间引物LB: TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG 用LP+RP产生大带：1107bp 用LB+RP产生小带：560-860bp
三、实验步骤
▪ 实验材料：拟南芥T-DNA插入突变体分 离群体30个株号的植株。
3. 用PCR方法鉴定T-DNA插入纯合突变体
▪ 农杆菌Ti质粒转化植物细胞后，在获得的后代分离群体中， 有T-DNA插入的纯合突变体，杂合突变体，和野生型。在 突变体研究中，需要的材料是纯合突变体，所以必须从分 离群体中将纯合突变体鉴定出来。
▪ PCR方法为鉴定纯合突变体提供了有利手段。它利用三 个引物LP、RP和BP，其中LP和RP是植物基因组上TDNA插入位点两测的引物，BP是T-DNA区段上的引物。 经过PCR，在野生型植株，LP和RP这对引物扩增出分子 量较大的产物（野生型基因，大带）；在杂合突变体， LP和RP能扩增出分子量较大的产物（野生型基因，大 带），另外BP和RP还能扩增出分子量较小的产物（小 带）；在纯合突变体，只有BP和RP能扩增出分子量较小 的产物（小带）。因此，利用以上三种引物做PCR，根 据扩增结果能够容易地从群体中区分出纯合突变体。
稻瘟菌基因的功能互补试验
稻瘟菌基因的功能互补试验随着几种模式生物，尤其是人的全基因组序列的完成，生命科学的研究进入了一个功能基因组学的时代。
人们已经不仅仅关心一个基因组中包含有多少基因，更重要的是包含有多少有功能的基因，各个基因的功能分别是什么。
稻瘟病以其在农业生产中所处的地位以及稻瘟菌的生物学特性，已作为研究植物与病原真菌相互作用的模式系统(Valent, 1990)。
同时稻瘟菌具有易于人工培养，已有高效率的人工转化体系，在实验室可进行有性杂交，菌丝体为单倍体等特点，是分子遗传研究的良好材料。
稻瘟菌的基因组一共包括七条染色体，全基因组的大小为38Mb，包括大约10000个基因，平均3-4kb就有一个基因。
由于稻瘟菌的菌丝体为单倍体，每一个基因的突变都能引起其相应生理生化功能的变化，因此当在此基因组中引入相应基因的野生型基因时，就能从功能上互补此基因的突变，恢复野生型的功能，即稻瘟菌基因的功能互补试验。
基因的功能互补试验一般包括以下几个步骤：首先，将基因的全长克隆至细菌载体上；然后，在此载体中连入一个真核生物的选择标记，一般为潮霉素抗性基因和新霉素抗性基因等，或基因的全长重新克隆至连有真核生物的选择标记细菌载体上；第三，选用合适的限制性内切酶将质粒切为线形；第四，利用REMI转化体系转化突变体；第五，挑取抗性转化子进行功能互补鉴定；最后，PCR鉴定或基因组Southern杂交鉴定。
以上所用的实验步骤是基于REMI转化的，目前稻瘟菌的转化还有农杆菌介导转化等方法，利用这种方法也能进行基因的功能互补试验，其鉴定的方法与上面一致，只是在载体构建时是将基因全长和真核生物选择标记连入农杆菌的T-DNA中。
基于REMI转化和农杆菌介导转化的方法都是比较好的用于基因功能互补试验的方法，但是这两种方法都有一个共同的弱点，就是在这两种方法中，所引入的DNA都是以随机插入的方式整合入稻瘟菌的基因组中，这样，就有可能导致另一个功能基因的失活，从而产生新的性状或者不能完全互补原来的基因突变。
实验五 拟南芥TDNA插入突变纯合体的鉴定
0.5 ml dNTP〔10 mmol/L〕
1 ml 046 5’引物〔10 mmol/L〕
1 ml 046 5’引物〔10 mmol/L〕
1 ml LBa 引物〔10 mmol/L〕
1 ml LBa 引物〔10 mmol/L〕
135号突变体的鉴定〔7-11组〕
30ml反响体系1：
30ml反响体系3：
实验五 拟南芥TDNA插入突变 纯合体的鉴定
实验目的
1．熟练掌握植物基因组DNA快速提取的方法； 2．掌握利用PCR方法鉴定拟南芥T-DNA插入突
变体的方法。
T-DNA插入鉴定的原理
突变体鉴定的步骤
1. T-DNA插入基因的基因组序列； 2. T-DNA插入方向确实定； 3. T-DNA插入位置确实定； 4. 引物设计； 5. PCR扩增； 6. 电泳检测。
条件下，离心5分钟； 〔6〕弃上清后，用70%乙醇润洗沉淀，并在室温下枯燥沉淀； 〔7〕100 ml TE溶解沉淀，将制备好的样品在4℃保存备用。
〔此方法提取的基因组DNA只适用于PCR的鉴定，不适合酶切和大片段基因的扩增〕
PCR鉴定
30ml反响体系： 2ml 植物基因组DNA样品 3ml 10×扩增缓冲液 ml Taqase 〔5U/ml〕 0.5 ml dNTP〔10 mmol/L〕 1ml 引物1〔10 mmol/L〕 1ml 引物2〔10 mmol/L〕
1ml 135 5’引物〔10 mmol/L〕
1ml 135 3’引物〔10 mmol/L〕
1ml 135 3’引物〔10 mmol/L〕
30ml反响体系2：
30ml反响体系4：
2ml 植物基因组DNA样品〔WT〕 2ml 植物基因组DNA样品〔111〕
T-DNA
T-DNA插入突变具有受体材料范围广、操作简便、转化效率高、插入拷贝数少,转化子稳定等优点，是目前标记和获得植物病原真菌功能基因组的最有效的途径之一。
T-DNA插入突变也叫T-DNA标签(tagging)、(Agrobacterium tumefaciens 一mediated transformation，ATMT)，是根癌农杆菌介导的利用T-DNA作为插入突变原或分子标记，来分离或克隆因为插入而失活的基因并研究其基因功能的方法。
所谓的根癌农杆菌是指侵染植物根部的能诱发植物产生肿瘤的革兰氏阴性细菌，它们在自然状态下趋化性感染大多数双子叶植物的受伤部位，继而侵入根部细胞，最后在其中裂解，释放出Ti质粒，其上的T-DNA片段便会与植物细胞的核基因组整合，合成正常植株所没有的冠瘿碱(opines)，破坏控制细胞分裂的激素调节系统，从而使它转为癌细胞并诱导其产生冠瘿瘤。
1974年，比利时根特大学遗传学实验室的Zaenen观察到了农杆菌中的巨型质粒，并首次命名为Ti质粒。
后来发现这个约200kb的环状Ti质粒，主要包括毒性区(Vir区)、转移DNA 区(T-DNA区)、接合转移区和复制起始区这四个区域。
它能从致病植株转移到无病的植株中，使正常植株致病，T-DNA转移要穿越植物和细菌的细胞壁，再经过其原生质膜，最后穿透核膜。
主要包括4个过程：1)农杆菌首先识别植物敏感细胞再进行吸附和对信号的感受；2)Ti质粒上vir基因的激活；3) T-DNA切割以及T-DNA复合物的形成；4)新形成的T-DNA复合物从农杆菌转移到植物细胞中；5)整合T-DNA到植物的核基因并开始表达。
整个过程中，T-DNA自身并不编码任何与转移及整合有关的酶。
ATMT技术正是利用这一特性来携带外来基因进入植物细胞。
由于T-DNA两端各有一段25 bp的相对保守的同向重复序列，即T-DNA 边界序列。
将要转入植物细胞核的外源目的基因就是通过质粒构建的方法连接于这两段DNA区域之间。
【国家自然科学基金】_t-dna插入突变_基金支持热词逐年推荐_【万方软件创新助手】_20140803
推荐指数 3 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
2014年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
2014年 科研热词 致病性 致病力 脱落酸 生物学性状 淡紫拟青霉 棉花黄萎病 插入突变 拟南芥 大丽轮枝菌 图位克隆 农杆菌介导的遗传转化 t-dna插入突变 asm1 推荐指数 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
推荐指数 4 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
2010年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9
科研热词 雄性不育 花药发育 木霉 拟南芥 序列分析 图位克隆 tail-pcr t-dna插入突变体 ms1521
2012年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32
科研热词 拟南芥 水稻 t-dna插入突变 雄性不育 鉴定 角果角度 花药发育 芥子油苷 绒毡层 突变表型 突变体库 生殖发育 玉米大斑病菌 漆酶 根癌农杆菌介导的转化 根发育 新型隐球酵母 反向遗传学 共分离 tos17突变系 tail-pcr t-dna突变系 t-dna插入缺失突变体 t-dna插入突变体 st273基因 spa基因 myb51 dna损伤修复 atmyb123 atmt atkor1 atccap
2011年 科研热词 推荐指数 水稻 4 拟南芥 4 遗传分析 3 短根毛突变体 2 基因定位 2 黄叶 1 遗传转化 1 转录因子 1 转基因 1 编码 1 红曲霉 1 红曲色素 1 精细定位 1 类病变突变体 1 筛选 1 突变俸库 1 突变体 1 病变组织 1 生物学机制 1 生物合成途径 1 水稻(oryza sativa l.) 1 氧化酶 1 桔霉素 1 根癌农杆菌 1 根形态 1 核基因控制 1 整合 1 插入突变 1 图位克隆 1 单萜合酶attps03 1 分子标记 1 农杆菌 1 侧翼序列 1 β -罗勒烯 1 tail-pcr 1 t-dna插入突变 1 t-dna 1 rei1 1 nadk3 1 gfp 1 cry1 1 bzip 1 abre元件 1 abl1 1 aba响应基因 1 aba信号传导 1
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杆菌的抗生素头孢噻肟钠和羧苄青霉素的配比， 不同转化阶段培养基的选择等。转化 ! G !%4 个孢子平均可获得约 5%% 个左右的转化子， HIJ 和 2EKL0HIJ 检测表明约 15M 转化子中含 20D,E 插入。对 !5$% 个突变体进行形态变异 观察， 发现菌落颜色突变的有 !5 个； 随机取 51 个突变体进行比较， 发现产孢量减少的 # 个， 孢子萌发率降低的 1 个， 附着胞形成率降低的 " 个； 还获得对水稻品种 I!%!LEI （ H90!） 和 ’50!0!$’ （ H90"） 致病的突变体， 为进一步克隆相 应的无毒基因奠定了基础。 关键词 稻瘟病菌，20D,E，插入突变，功能基因组学 N’5! 文献标识码 E 文章编号 !%%%0&%4! （$%%&） %#0%#!"0%5
［’］ （ .+7 O! Z 9#$ ;"） 的 XFOR! ， 由美国宾夕法尼 >X>
年新发展的农杆菌介导转化 （ 51*(6+0/%*#)7 /)7%-+8 的 20D,E 插入方 0#%$&073;98R3; RQ8<TB)Q78R9)<， E2U2） 一是转化 法解决了这一问题。 E2U2 方法的优点： 材料易得， 可以用原生质体、 菌丝、 孢子和蘑菇的菌 二是得到 素等， 而 J6UK 只能用原生质体进行转化；
［4］ 中 ， 这给进一步的突变体分析带来很多麻烦。近 ［5］
&
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材料与方法
供试菌株 稻瘟病菌菌株 4VF!5、 "5%5#F、 1!$’# 和测 14%54
均为本实验室保存的从福建田间分离纯化的单孢菌 系。 农杆菌菌株为 EWL0!。 20D,E 插入所用质粒为 XIEUFKE!&%% 中的 XI8U(&5Y0>X> 被 置 换 为 X2QXI0
［/@］ ［-］
［-］
将 /13@ 个突变菌株每 3@ 个一组混合接种于含 单个抗瘟基因的水稻品种 ./@/5J.（ R+M/） 、 ./@/J1/ （R+M3） 和 -1M/M/3（ R+M’） 及感病对照 .W8’ 上， 31D 保 湿 3A>， 然后置于控温玻璃温室中让其发病， C Z /@E
［/8］ 后调查病情， 参照 9",4%, 等 @ Z 1 级的标准记载 病斑反
将稻瘟病菌 A 个田间 -"!"! 抗生素的选用和优化： 菌株 B[9/1、 ’1@1A9、 C/3-A 和测 CB@1B 的分生孢子置 于不同浓度的潮霉素 9 水溶液中， 在 3CD 下培养， 并分别在 C、 AC、 ’B> 观察其萌发情况。结果对照 C> 内， 分生孢子萌发率就已达 ’@2 ； 但在 3@@ :645 潮 ! 霉素 9 水 溶 液 中， 只 有 /2 萌 发； 而 在 A@@、 B@@ 和 孢子都没有萌发。对潮霉素 9 水溶液 C@@ :645 中， ! 进一步观察的结 中的分生孢子培养 AC> 和 ’B> 后， 果表明经 3@@ :645 处理的分生孢子萌发率略有增 ! 加， 分别是 32 和 12 ，A@@、 B@@、 C@@ :645 中仍然未 ! 见孢子萌发， 菌株间没有差异。可见 3@@ :645 潮霉 ! 素 9 水溶液对稻瘟病菌分生孢子萌发有较好的抑 制效果。 而将上述 A 个菌株的分生孢子均匀地铺于含不 同浓度潮霉素 9 的培养基平板上， 结果是 3CD 培养 其余则未见； 3E 后在对照中就可以观察到菌落， 8E 后对 照 菌 落 已 基 本 长 满 平 板， 所有菌株均可在 而且 3@@ :645 潮霉素 9 平板上见到少量菌落生长， ! 菌株 ’1@1A9 在 A@@ 潮霉素 平板上仍可见少 :645 9 ! 量菌落生长； AE 后所有菌株在 A@@ :645 潮霉素 9 ! 平板上均有菌落生长， 菌株 ’1@1A9 在 B@@ :645 潮 ! 霉素 9 平板上也可见少量菌落生长。结果表明， 在 平板培养基上， 需要较高浓度的潮霉素 9 才能达到 较好的抑菌效果， 而且不同稻瘟病菌菌株间所需的 抑菌浓度也有差异。因此， 在进行转化选择时必须 而且要尽早将 根据所用菌株确定潮霉素 9 的用量， 转化子转移到新的培养基上， 以免出现太高比例的 假转化子。 稻瘟病菌与农杆菌共培养后， 选用合适的抗生 素抑制农杆菌的生长极为重要。结果表明， 在稻瘟 病菌 与 农 杆 菌 共 培 养 后， 从只用头孢噻肟钠 （ 3@@
基金项目： 国家自然科学基金 （ ,)+ &%%%%!!!） ， 福建省 “百千万” 人才工程资助。 23*： 1405"!0&’1"#’1； 60789*： :.);)<:*.= /8>))+ ?)7。 23*： 1405"!0&’’"5&4； 60789*： @8<:A>= BC8. + 3;. + ?< " 通讯作者：
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生 物 工 程 学 报 !"#$%&% ’()*$+, (- .#(/%0"$(,(12
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稻瘟病菌 !"#$% 插入方法优化及其突变体分析
$， & $" 李宏宇!， 潘初沂$ 陈 涵! 赵长江$ 鲁国东$" 王宗华!，
$ （! 福建农林大学生命科学学院； 福建农林大学植物保护学院， 福州 &5%%%$） & （中国人民解放军军需大学， 长春 !&%%4$）
摘
要
优化了农杆菌介导转化稻瘟病菌获得 20D,E 插入突变的条件， 包括选择转化子的潮霉素 F 用量， 抑制农
收稿日期： 修回日期： $%%&0%!0$1， $%%&0%#0$1。
亚州立大学的 Y3):?>8< [8<: 博士赠送。 &’( 培养基 酵母粉 $:， 琼脂 !%: 加水 酵母培养基： 淀粉 !%:， 至 !%%%7L。 琼脂 !1 :， 加水至 米糠产孢培养基： 米糠 $% :， !%%% 7L， XO4\5。
［’， 1］ 。 E2U2 法 构 建 真 菌 突 变 体 库 已 用 于 多 种 真 菌
并获得一批稻 为此， 我们优化了 E2U2 方法的条件， 包括形态发育和致病性 瘟病菌 20D,E 插入突变体， 突变体。
为进一步从基因组水平认识水稻与稻瘟病菌相互作 用的机制奠定了基础。稻瘟病菌致病性复杂易变， 给水稻抗病育种及抗病品种的利用带来了极大困 难。因此， 利用功能基因组学的方法从全基因组水 平分析该菌的致病性变异机制非常必要。 基因插入失活获得能够覆盖全基因组的突变体 库是功能基因组学研究的基础性工作。在真菌中最 常用的插入失活方法是限制酶诱导整合 （ J3TRQ9?R9)< 但是 J6UK 有许 J6UK） ， 3<A/73073;98R3; 9<R3:Q8R9)<， 多缺 点， 最大的缺点是所产生的转化子中约有 高 的 可 达 到 1%M ， 其标签没有插入基因组 $%M ，
。
=期
李宏宇等： 稻瘟病菌 45673 插入方法优化及其突变体分析
=(+
的选择培养基上分离纯化的稻瘟病菌株中， !"#$） ! 约有 %&’ 在培养时仍可见农杆菌生长； 而在含头孢 噻肟钠 （(&& 和羧苄青霉素 （(&& 的选择 !"#$） !"#$） ! ! 培养基上分离纯化的稻瘟病菌株中， 只有 %’ 在继 代培养时仍可见农杆菌生长， 但在选择培养基上培 养时间延长， 带农杆菌的比例还会增加。因此， 在选 和 择培养基中， 应同时加入头孢噻肟钠 （(&& !"#$） ! 羧苄青霉素 （(&& 以有效抑制农杆菌的生长。 !"#$） ! !"#"! 培养基的优化： ( 种共培养培养基比较结果 表明， （ 培养基中葡萄糖含量为 , ##-."$） 的共 )*+ 培养效果好， 共培养 /01 在硝酸纤维素膜上可见稻 瘟病菌菌丝生长， 但又不过于茂盛， 结果能得到较多 的转化子； 而在 )*( （ 培养基中葡萄糖含量提高到 ， 共培养 /01 看不到稻瘟病菌菌丝， 最后 +& ##-."$） 在选择培养基上也得不到转化子， 这可能是因为葡 萄糖含量高不利于稻瘟病菌生长。 共培养后的稻 ( 种选择培养基比较结果表明， 瘟病菌在 2*+ （ 基本培养基） 、 （ 酵母培养基） 和 2*( （米糠产孢培养基） 上均能良好生长， 说明 34*4 2*/ 方法在选择转化子时， 对培养基要求不严。米糠产 孢培养基不易污染， 而且可以直接产孢， 是比较适宜 的培养基。 !"! 转化子 $%&’( 插入的 )*+ 验证及其插入的 稳定性 随机抽取获得的转化子， 以 45673 左右边界序 列设计的引物进行 8)9，结果从转化子 +5+:5%、 +5+:5 ,、 +58;<5+=、 +58;<5+(、 +58;<5<、 +58;<5%、 +58;<5= 都扩增 到一条约 +>,?@ 大小的片段， 野生型菌株对照和清 水中均未见该条带， 但 8;<5+/ 也没有条带 （图 +） ， 可 能没有 45673 插入， 或是 45673 边界序列丢失。多 次转化结果平均每 + A +& 个孢子可以得到约 ,&& 个转化子， 而 8)9 结果则表明其中约有 +,’ 的转化