华中农业大学病毒学实验技术第六章病毒纯化(XXXX).pptx
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➢ 病毒体具有一定大小、形状和密度，可利 用超速离心技术提纯病毒
三、病毒纯化前的预处理 1、病毒感染的组织、脏器或细胞
✓研磨匀浆 ✓超声波处理 ✓反复冻融 ✓低速离心去掉细胞碎片
2、细胞培养液、鸡胚尿囊液 低速离心去掉可能含有的杂质或直接用
于病毒的分离纯化
四、病毒纯化的方法
➢沉淀法 ➢超速离心法 ➢超滤法 ➢层析法 ➢两相溶剂间分配系数法 ➢吸附法 ➢电泳法
3、根据具体情况选择提纯方法 根据需要纯化的病毒的性质、起始材料的特
点、研究的目的以及实验室的条件等，选择适 宜的纯化方法。 4、建立灵敏的病毒鉴定和测定方法
六、伪狂犬病毒的浓缩提纯 1、病毒材料
将伪狂犬病病毒接种于PK-15细胞，病变后 收集细胞培养物，反复冻融3次，即为样品材 料。
2．病毒提纯浓缩 ✓去细胞碎片及杂质：将细胞培养物4℃ 3000r/min
原理：A、降低溶液的介电常数，从而增加病毒颗 粒表面不同电荷之间的引力，导致其溶解度 降低。
B、与水作用，破坏蛋白质分子的水化膜。 优点：分辨力高，易除去 缺点：易使表面蛋白质变性，溶解脂质
4、等电点沉淀法（分辨力不高）
原理：病毒粒子在等电点时，所携带的正电荷与 负电荷相互中和，因而失去相互排斥的作用而发 生沉淀（分辨力不高）。
多数病毒的等电点在pH4.０~5.5之间。
5、皂土法
轮状病毒 皂土在酸性条件下（pH4~4.5)可吸附轮状病 毒，在碱性条件下(pH8.5)，又使其洗脱下来。
6、鱼精蛋白沉淀法（沉淀直径大于50nm的病毒）
鱼精蛋白为碱性蛋白，具有携带其它蛋白质（直径 大于50nm ）共沉淀的作用，当向这种沉淀物加入 1mol/L NaCl时，其它蛋白质又重新释放到悬液中， 而鱼精蛋白仍然沉淀。
（五）电泳法
（六）超滤法 利用超滤膜将水、盐及小分子滤过，将一定大小
的大分子或病毒等颗粒截住从而使后者得到浓缩。 优点： ✓可用于大容量样品的浓缩 ✓可以在室温或低温下操作 ✓对被浓缩产物的损害小 ✓浓缩的同时可达到部分纯化 ✓回收率高 ✓可防止外来污染
（七）离心法 ✓差速离心 ✓速度区带离心法 ✓密度梯度离心
（Байду номын сангаас）层析法
✓葡聚糖柱层析法 ✓凝胶层析法 ✓离子交换柱层析法 ✓亲和层析法
（三）两相溶剂间分配系数法 原理：溶质在两个互不相溶的溶剂中分配系数的不同 而选择性地分配于其中的一方。 常用的溶剂：葡聚糖硫酸盐（dextran sulphate, Ds)
聚乙二醇（PEG） 甲基纤维素（MC） 聚乙烯醇（PVA） 分配体系：Ds-PEG系、Ds-PVA系、Ds-MC系
（四）吸附法 原理：利用对病毒或对杂质有选择吸附能力的固 体吸附剂吸附病毒或吸附杂质，再用一定的盐溶 液把它们洗脱下来。
作为吸附剂必须具备的特点： ✓有较大的表面积和吸附能力 ✓较高的吸附选择性 ✓便于洗脱 ✓性质稳定
常用吸附剂： ✓ 白土 ✓ 磷酸钙 ✓ 硅藻土 ✓ 红细胞 ✓ 离子交换树脂 ✓ 羧甲基纤维素
分子量、抗原性 ➢ 结晶形成
检测病毒制备物均一性的方法： ✓ 电镜观察：大小、形态均一 ✓ 超速离心：沉降速率和密度一致，只出现一条沉降带 ✓ 电泳：颗粒大小及表面电荷均一，只形成一条电泳带 ✓ 免疫学方法：只与特异性抗体发生反应
二、病毒纯化的理论依据
➢ 病毒体外表面的主要化学组成是蛋白质， 可利用蛋白质提纯的方法纯化病毒
1.差速离心法
原理：不同大小和比重的粒子沉降速度不同。
用途：从组织培养液、鸡胚尿囊液或经过红细胞 吸附释放的病毒悬液中提纯病毒。
优点：可快速处理大量样品
步骤：低速（2000-3000r/min, 20-30min)、 中速（10000min, 20-30min)去除较大的宿主细 胞碎片、污染的细菌及其它较大的杂质。再选择 较高速度离心1-2h使病毒沉淀。
（一）沉淀法 主要从稀的病毒悬浮液中浓缩病毒。
✓中性盐沉淀法（盐析） ✓聚乙二醇沉淀法 ✓有机溶剂沉淀法 ✓等电点沉淀法 ✓皂土法 ✓鱼精蛋白沉淀法
1、中性盐沉淀法（盐析） 先用其它方法去除材料中的大量杂质，再以
高浓度的中性盐溶液盐析，析出的沉淀用缓冲 液悬浮后再进行盐析，反复几次后，悬浮沉淀， 用透析法或其它方法脱盐。
离心30min，收集上清液。 ✓硫酸铵沉淀：按100ml病毒液42.5g硫酸铵的量加入
硫酸铵，搅匀后置4℃冰箱搅拌沉淀过夜，4℃ 5000r/min离心40min，去上清，沉淀用适量的灭 菌ddH2O悬浮。 ✓透析：将悬浮的病毒液装于透析袋中，于ddH2O或 PBS中搅拌透析，每半个小时换一次液，共换5次， 第5次透析过夜。
第六章 病毒的纯化
利用各种物理、化学方法，以不使 病毒受损伤和失活为前提，去除宿主细 胞组分等非病毒杂质，提取出高纯度浓 缩的病毒样品。
✓病毒微细结构的研究 ✓病毒抗原蛋白的分离纯化 ✓病毒化学成分及其遗传物质的研究 ✓病毒感染的分子细节的研究
一、病毒纯化的标准
➢ 保持感染性 ➢ 具有均一性：大小、形态、密度、化学组成、
2. 速度梯度离心法与密度梯度离心法
速度梯度离心法
密度梯度离心法
原理
沉降与颗粒质量成正比， 沉降与颗粒密度成正比，
以物质沉降速度的不同进 以物质浮密度的不同进行
行分离
分离
介质
密度小，1-1.3286，预制 密度大，1-1.9025，连续
梯度，不连续
梯度
离心力场
强，离心速度高，使被分 离物质易沉降
稍强，速度相对低，使 CsCl形成梯度，建立沉降 扩散平衡
病毒一般在45%以上饱和度的硫酸铵溶液中 沉淀，且保持感染性。
2、聚乙二醇（PEG）沉淀法 用于病毒沉淀的分子量：2000-6000 将PEG配成50%左右的溶液，或直接将固体
PEG加于病毒悬液中，使其达到所需浓度，在4℃ 搅拌过夜，然后离心使病毒沉淀。
3、有机溶剂沉淀法 乙醚、甲醇、氯仿、正丁醇、氟碳化合物
离心过程 样品向离心管底沉降
样品停留于介质的等密度 部位
离心时间 较短，几小时到几十小时 较长，十几小时到数天
A
A. 速度梯度离心
B. 密度梯度离心
B
…… ……
五、病毒纯化应注意的问题
1、保持病毒的感染性 严格控制温度、pH及试剂的选择。
2、选用适宜的纯化实验起始材料 ➢无其它病毒或毒株的污染 ➢病毒体的含量高 ➢杂质含量少并易于处理
三、病毒纯化前的预处理 1、病毒感染的组织、脏器或细胞
✓研磨匀浆 ✓超声波处理 ✓反复冻融 ✓低速离心去掉细胞碎片
2、细胞培养液、鸡胚尿囊液 低速离心去掉可能含有的杂质或直接用
于病毒的分离纯化
四、病毒纯化的方法
➢沉淀法 ➢超速离心法 ➢超滤法 ➢层析法 ➢两相溶剂间分配系数法 ➢吸附法 ➢电泳法
3、根据具体情况选择提纯方法 根据需要纯化的病毒的性质、起始材料的特
点、研究的目的以及实验室的条件等，选择适 宜的纯化方法。 4、建立灵敏的病毒鉴定和测定方法
六、伪狂犬病毒的浓缩提纯 1、病毒材料
将伪狂犬病病毒接种于PK-15细胞，病变后 收集细胞培养物，反复冻融3次，即为样品材 料。
2．病毒提纯浓缩 ✓去细胞碎片及杂质：将细胞培养物4℃ 3000r/min
原理：A、降低溶液的介电常数，从而增加病毒颗 粒表面不同电荷之间的引力，导致其溶解度 降低。
B、与水作用，破坏蛋白质分子的水化膜。 优点：分辨力高，易除去 缺点：易使表面蛋白质变性，溶解脂质
4、等电点沉淀法（分辨力不高）
原理：病毒粒子在等电点时，所携带的正电荷与 负电荷相互中和，因而失去相互排斥的作用而发 生沉淀（分辨力不高）。
多数病毒的等电点在pH4.０~5.5之间。
5、皂土法
轮状病毒 皂土在酸性条件下（pH4~4.5)可吸附轮状病 毒，在碱性条件下(pH8.5)，又使其洗脱下来。
6、鱼精蛋白沉淀法（沉淀直径大于50nm的病毒）
鱼精蛋白为碱性蛋白，具有携带其它蛋白质（直径 大于50nm ）共沉淀的作用，当向这种沉淀物加入 1mol/L NaCl时，其它蛋白质又重新释放到悬液中， 而鱼精蛋白仍然沉淀。
（五）电泳法
（六）超滤法 利用超滤膜将水、盐及小分子滤过，将一定大小
的大分子或病毒等颗粒截住从而使后者得到浓缩。 优点： ✓可用于大容量样品的浓缩 ✓可以在室温或低温下操作 ✓对被浓缩产物的损害小 ✓浓缩的同时可达到部分纯化 ✓回收率高 ✓可防止外来污染
（七）离心法 ✓差速离心 ✓速度区带离心法 ✓密度梯度离心
（Байду номын сангаас）层析法
✓葡聚糖柱层析法 ✓凝胶层析法 ✓离子交换柱层析法 ✓亲和层析法
（三）两相溶剂间分配系数法 原理：溶质在两个互不相溶的溶剂中分配系数的不同 而选择性地分配于其中的一方。 常用的溶剂：葡聚糖硫酸盐（dextran sulphate, Ds)
聚乙二醇（PEG） 甲基纤维素（MC） 聚乙烯醇（PVA） 分配体系：Ds-PEG系、Ds-PVA系、Ds-MC系
（四）吸附法 原理：利用对病毒或对杂质有选择吸附能力的固 体吸附剂吸附病毒或吸附杂质，再用一定的盐溶 液把它们洗脱下来。
作为吸附剂必须具备的特点： ✓有较大的表面积和吸附能力 ✓较高的吸附选择性 ✓便于洗脱 ✓性质稳定
常用吸附剂： ✓ 白土 ✓ 磷酸钙 ✓ 硅藻土 ✓ 红细胞 ✓ 离子交换树脂 ✓ 羧甲基纤维素
分子量、抗原性 ➢ 结晶形成
检测病毒制备物均一性的方法： ✓ 电镜观察：大小、形态均一 ✓ 超速离心：沉降速率和密度一致，只出现一条沉降带 ✓ 电泳：颗粒大小及表面电荷均一，只形成一条电泳带 ✓ 免疫学方法：只与特异性抗体发生反应
二、病毒纯化的理论依据
➢ 病毒体外表面的主要化学组成是蛋白质， 可利用蛋白质提纯的方法纯化病毒
1.差速离心法
原理：不同大小和比重的粒子沉降速度不同。
用途：从组织培养液、鸡胚尿囊液或经过红细胞 吸附释放的病毒悬液中提纯病毒。
优点：可快速处理大量样品
步骤：低速（2000-3000r/min, 20-30min)、 中速（10000min, 20-30min)去除较大的宿主细 胞碎片、污染的细菌及其它较大的杂质。再选择 较高速度离心1-2h使病毒沉淀。
（一）沉淀法 主要从稀的病毒悬浮液中浓缩病毒。
✓中性盐沉淀法（盐析） ✓聚乙二醇沉淀法 ✓有机溶剂沉淀法 ✓等电点沉淀法 ✓皂土法 ✓鱼精蛋白沉淀法
1、中性盐沉淀法（盐析） 先用其它方法去除材料中的大量杂质，再以
高浓度的中性盐溶液盐析，析出的沉淀用缓冲 液悬浮后再进行盐析，反复几次后，悬浮沉淀， 用透析法或其它方法脱盐。
离心30min，收集上清液。 ✓硫酸铵沉淀：按100ml病毒液42.5g硫酸铵的量加入
硫酸铵，搅匀后置4℃冰箱搅拌沉淀过夜，4℃ 5000r/min离心40min，去上清，沉淀用适量的灭 菌ddH2O悬浮。 ✓透析：将悬浮的病毒液装于透析袋中，于ddH2O或 PBS中搅拌透析，每半个小时换一次液，共换5次， 第5次透析过夜。
第六章 病毒的纯化
利用各种物理、化学方法，以不使 病毒受损伤和失活为前提，去除宿主细 胞组分等非病毒杂质，提取出高纯度浓 缩的病毒样品。
✓病毒微细结构的研究 ✓病毒抗原蛋白的分离纯化 ✓病毒化学成分及其遗传物质的研究 ✓病毒感染的分子细节的研究
一、病毒纯化的标准
➢ 保持感染性 ➢ 具有均一性：大小、形态、密度、化学组成、
2. 速度梯度离心法与密度梯度离心法
速度梯度离心法
密度梯度离心法
原理
沉降与颗粒质量成正比， 沉降与颗粒密度成正比，
以物质沉降速度的不同进 以物质浮密度的不同进行
行分离
分离
介质
密度小，1-1.3286，预制 密度大，1-1.9025，连续
梯度，不连续
梯度
离心力场
强，离心速度高，使被分 离物质易沉降
稍强，速度相对低，使 CsCl形成梯度，建立沉降 扩散平衡
病毒一般在45%以上饱和度的硫酸铵溶液中 沉淀，且保持感染性。
2、聚乙二醇（PEG）沉淀法 用于病毒沉淀的分子量：2000-6000 将PEG配成50%左右的溶液，或直接将固体
PEG加于病毒悬液中，使其达到所需浓度，在4℃ 搅拌过夜，然后离心使病毒沉淀。
3、有机溶剂沉淀法 乙醚、甲醇、氯仿、正丁醇、氟碳化合物
离心过程 样品向离心管底沉降
样品停留于介质的等密度 部位
离心时间 较短，几小时到几十小时 较长，十几小时到数天
A
A. 速度梯度离心
B. 密度梯度离心
B
…… ……
五、病毒纯化应注意的问题
1、保持病毒的感染性 严格控制温度、pH及试剂的选择。
2、选用适宜的纯化实验起始材料 ➢无其它病毒或毒株的污染 ➢病毒体的含量高 ➢杂质含量少并易于处理